بررسی آلودگی گوشت گوساله عرضه شده در سطح شهر اصفهان به کلستریدیوم دیفیسیل با روش کشت و واکنش زنجیره ای پلیمراز با تکنیک چندتایی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری علوم و صنایع غذایی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات تهران، ایران

2 دانشیار میکروبیولوژی، مرکز تحقیقات بیماری‏های عفونی و گرمسیری، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران

3 دانشیار علوم و صنایع غذایی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات تهران، ایران

4 استاد پاتوبیولوژی، دانشکده پاتوبیولوژی، دانشگاه Guelph، اونتاریو، کانادا

5 دانشیار علوم دامی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات تهران، ایران

چکیده

مقدمه: در سال‏های اخیر احتمال انتقال کلستریدیوم دیفیسیل با مصرف مواد غذایی به انسان با افزایش عفونت این باکتری در جامعه مطرح شد. در این میان پژوهش‏های گسترده‏تری از وضعیتکلستریدیوم دیفیسیل در گوشت قرمز کشور‏های مختلف دنیا نسبت به مواد غذایی دیگر انجام شد. مطالعه حاضر با هدف بررسی شیوع کلستریدیوم دیفیسیل در گوشت گوساله انجام گرفت‏‏.
مواد و روش‏‏‏ها: 100 نمونه از گوشت گوساله عرضه شده در دو شکل تکه‏ای و چرخ کرده از قصابی‏‏های مناطق مختلف شهراصفهان برای انجام آزمایش‏ها جمع آوری شد. پس از انجام مراحل کشت و تایید پرگنه‏های مثبت کلستریدیوم دیفیسیل با آزمون‏های بیوشیمیایی، روش مولکولی PCR با تکنیک چندتایی جهت تشخیص سه ژن ایزومراز تری فسفات، زهرابه آ و زهرابه ب انجام گرفت. بررسی ارتباط بین شیوع کلستریدیوم دیفیسیل در دو شکل تکه‏ای و چرخ کرده گوشت گوساله در نرم افزار آماری SPSS (ویرایش 16) با آزمون مربع کای در سطح معنی داری Pvalue<0.05 انجام گرفت.
نتایج: کلستریدیوم دیفیسیل در 12 نمونه (12 درصد‏) از گوشت‏های گوساله جداسازی شد. از بین 12 نمونه،  دو نمونه (4 درصد‏) به گوشت تکه‏ای و 10 نمونه (20 درصد) به گوشت چرخ کرده مربوط بود. همه پرگنه‏های جداسازی شده از هر سه ژن مورد بررسی برخوردار بودند. تفاوت معنی‏داری در شیوع کلستریدیوم دیفیسیل در دو نوع از گوشت‏های مورد بررسی مشاهده شد (01/0=Pvalue).
بحث و نتیجه‏گیری: در این مطالعه، میزان جداسازی کلستریدیوم دیفیسیل در گوشت‏های چرخ کرده گوساله نسبت به شکل تکه‏ای افزایش داشت که می‏تواند به علت عدم رعایت اصول بهداشتی در شست و شو و تشکیل احتمالی بیوفیلم در دستگاه‏های چرخ گوشت باشد. همچنین، نتایج این مطالعه نشان داد که مصرف گوشت گوساله به‏عنوان یک مخزن احتمالی از کلستریدیوم دیفیسیل در انتقال این باکتری به انسان می‏تواند عمل کند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Examination of Clostridium difficile Contamination in beef meat distributed in Isfahan using culture and Multiplex-PCR method

نویسندگان [English]

  • zahra Esfandiari 1
  • Mohammad Jalali 2
  • Hamid Ezzatpanah 3
  • Scott Weese 4
  • Mohammad Chamani 5
1 Ph.D. student, Department of Food Science and Technology, College of Food Science and Technology, Tehran Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
2 Associate Professor of Microbiology, Food Security Research Center, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
3 Associate Professor of Food Science and Technology, Department of Food Science and Technology, College of Food Science and Technology, Tehran Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
4 Professor of Pathobiology, Department of Pathobiology, University of Guelph, Ontario, N1G 2W1, Canada
5 Associate Professor of Animal Science, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction:With regard to increasing of community associated Clostridium difficile infection in recent years, the probable transmission of Clostridium difficile from food to human was supposed. Most of reports on this issue were allocated to examine the prevalence of Clostridium difficile in red meat. The current study aimed at examination of the prevalence of Clostridium difficile in beef meat.
Materials and methods: A total of 100 beef meat samples including 50 chopped and ground for each ones were collected from butcheries in different regions of Isfahan for cultural analysis and biochemical tests. Molecular evaluation of Clostridium difficle was confirmed by multiplex polymerase chain reaction directed on existence of tpi, tcdA and tcdB genes. Chi-square test was performed for descriptive statistics with Pvalue≤ 0.05 in SPSS software.
Results: Clostridium difficile was isolated form 12 (12%) of beef meat samples. Among isolated colonies, 2 (4%) and 10 (20%) were belonged to chopped and ground beef meat, respectively. All colonies contained all genes. The significant difference was observed within the type of meat and Clostridium difficile prevalence (Pvalue=0.01).
Discussion and conclusion: The results of the present study showed the higher incidence of Clostridium difficile in ground meat than chopped ones. It seems that the formation of biofilm in meat grinder was the reason of higher rate of contamination. Furthermore, the consumption of beef meat as a source for Clostridium difficile might transmit the organism to human.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Clostridium difficile
  • Beef meat
  • Multiplex polymerase chain reaction

مقدمه

کلستریدیوم دیفیسیل یک باسیل گرم مثبت، بی‏هوازی اجباری و تولید کننده اسپور با قابلیت تولید زهرابه است. این باکتری به علت جداسازی سخت در محیط‏های کشت آزمایشگاهی با این عنوان نام‏گذاری شد (1). کلستریدیوم دیفیسیل برای نخستین بار در سال 1935 از مدفوع نوزادان سالم جداسازی شد (2) و خاصیت بیماری‏زایی آن در دهه 1970 در بیماران بستری تحت درمان با مصرف آنتی‏بیوتیک در بیمارستان مشخص شد و در این گروه از بیماران به بروز عفونت کلستریدیوم دیفیسیل[1] منجر شد (3). عفونتکلستریدیوم دیفیسیل با تبدیل شکل اسپور باکتری به رویشی و تولید زهرابه در سیستم گوارشی، به‏شکل بدون علامت تا اسهال شدیدآبکی در بیماران بروز می‏نماید (4 و 5). کلستریدیوم دیفیسیل تولید کننده دو اگزوتوکسین با عناوین زهرابه آ [2] (انتروتوکسین) و زهرابه ب[3] (سیتوتوکسین) است (6). هر دو گروه از زهرابه‏ها، بر بخش رئو[4]در پروتئین از طریق واکنش مونوگلوکوزیلاسیون تاثیر می‏گذارند (7 و 8). این شرایط به نابودی اتصالات اکتین F در مجموعه اپی تلیال گوارشی و تخریب اتصالات بین سلولی در بدن انسان منجر می‏شود (9). زهرابه ب قابلیت بیشتری در تخریب مخاط ناحیه کولون نسبت به زهرابه آ دارد. به همین علت سویه‏هایی از کلستریدیوم دیفیسیل که قادر به تولید زهرابه آ نیستند از نظر قدرت تهاجمی مشابه سویه‏هایی با قابلیت تولید هر دو زهرابه هستند (10). البته سویه‏هایی از این میکروارگانیسم نیز زهرابه تولید نکرده و می‏توانند به‏عنوان فلور طبیعی سیستم گوارشی محسوب شوند و قابلیت ایجاد بیماری را ندارند (11). با افزایش شیوع عفونت کلستریدیوم دیفیسیل در جامعه[5] و در محیط خارج از سیستم بهداشتی درمانی، احتمالاتی مبنی بر آن‏که این باکتری یک پاتوژن غذازاد باشد به وجود آمد. با جداسازی کلستریدیوم دیفیسیل از گوشت، برخی مواد غذایی و تشابه ژنتیکی بین سویه‏های جداشده با عامل عفونت کلستریدیوم دیفیسیل در بیمارستان این فرضیه قوت گرفت (12). حتی در برخی از مطالعات، کلستریدیوم دیفیسیل را به‏عنوان یک عامل احتمالی مشترک بیماری‏زا در انسان و دام مطرح می‏کنند (13 و 14). در مطالعات نه چندان زیادی وجود کلستریدیوم دیفیسیل در مواد غذایی گوناگون در دنیا اثبات شده است اما تا به حال بررسی از شیوع این باکتری در گوشت قرمز در کشورمان انجام نگرفته است. این در حالی است که در بررسی انجام گرفته برروی نمونه‏های اسهال بیماران مبتلا به عفونت کلستریدیوم دیفیسیل بستری در بیمارستان الزهرا اصفهان، مصرف گوشت به‏عنوان یکی از منابع احتمالی انتقال عفونت عنوان شد (15). به همین علت ضرورت انجام تحقیقاتی در راستای بررسی آلودگی کلستریدیوم دیفیسیل در گوشت به‏شکل منطقه‏ای اهمیت دارد. بنابراین، در این مطالعه، به ردیابی مولکولی کلستریدیوم دیفیسل در گوشت‏های گوساله عرضه شده در قصابی‏های شهر اصفهان پرداخته شد.

 

مواد و روش‏ها

این مطالعه توصیفی– تحلیلی بر اساس نمونه‏برداری به شکل تصادفی از قصابی‏های مناطق مختلف شهراصفهان با تعداد کلی 100 نمونه گوشت گوساله در دو نوع تکه‏ای و چرخ کرده (هرکدام 50 نمونه) انجام شد. همه نمونه‏ها در شرایط استریل به آزمایشگاه مرکز تحقیقات امنیت غذایی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان منتقل و در روز نمونه‏برداری آزمایش شدند. آزمایش‏های کشت با انتقال 5 گرم از نمونه‏های مورد نظر به 25 میلی‏لیتر محیط مایع انتخابی کلستریدیوم دیفیسیل موکسالاکتام نورفلوکسازین[6] (40 گرم بر لیتر پروتئوز پپتون، 5 گرم بر لیتر دی سدیم هیدروژن فسفات، 1 گرم بر لیتر پتاسیم دی هیدروژن فسفات، 1/0 گرم بر لیتر سولفات منیزیم، 2 گرم بر لیتر کلریدسدیم، 6 گرم بر لیتر فروکتوز و یک گرم بر لیتر اسید سدیم تورکولیک غنی شده با 500 میلی‏گرم بر لیتر سیستئین هیدروکلرید، 12 میلی‏گرم بر لیتر نورفلوکسازین و 32 میلی‏گرم بر لیتر موکسالاکتام) انجام شد.

نمونه‏ها با دمای 37 درجه سانتی‏گراد‏به مدت 7 روز انکوباسیون بی‏هوازی شد. انتقال دو میلی‏لیتر از مایع به دو میلی‏لیتر اتانول و نگهداری آن در دمای محیط به مدت 60 دقیقه انجام گرفت. نمونه‏ها به مدت ده دقیقه تحت سانتریفوژ 3000 دور بر دقیقه قرار گرفتند. رسوب بخش پایینی لوله بر روی محیط CDMN آگار حاوی 7 درصد خون گوسفند کشت و به مدت 72 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد‏ در شرایط بی‏هوازی انکوبه شد. سپس، پرگنه‏های مشکوک به کلستریدیوم دیفیسیل بر روی محیط بلاد آگار کشت و انکوباسیون بی‏هوازی در دمای 37 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت 48 ساعت انجام گرفت. تشخیص بیوشیمیایی از طریق شکل، بوی مدفوع اسب، رنگ آمیزی گرم و اسپور و دیسک پرولین [7] بر روی پرگنه‏های مثبت انجام شد (16).

آماده‏سازی DNA برای انجام آزمایش‏های PCR با برداشتن پرگنه تازه و انتقال آن به یک میلی‏لیتر آب دیونیزه استریل و قراردهی نمونه‏ها به مدت سه دقیقه در دمای 95 درجه سانتی‏گراد ‏انجام شد. نمونه‏ها به مدت پانزده دقیقه در دور 11000سانتریفیوژ شد. سپس، حجم 10 میکرولیتر از سوپرناتانت برای آزمایش‏های PCR به‏کارگرفته شد.

در این مطالعه، ژن ایزومراز تری فسفات[8] برای تایید باکتری کلستریدیوم دیفیسیل و دو ژن زهرابه آ و
زهرابه ب به علت اینکه عامل عفونت کلستریدیوم دیفیسیل هستند برای واکنش PCRبا تکنیک چندتایی[9]بررسی شد.

همه مواد مورد استفاده برای واکنش PCR از شرکت سیناژن تامین شد. واکنش PCR با حجم 25 میکرولیتر که شامل: ترکیبی از 5/2 میکرولیتر بافر 10X PCR،
3 میکرولیتر کلریدمنیزیم[10] 50 میلی‏مولار، 2 میکرولیتر دی‏اکسی نوکلئوتید تری فسفات[11] 10 میلی‏مولار،
5/0 واحد آنزیم تک DNA پلی مراز[12]، 1 میکرولیتر از هریک از آغازگرهای[13] زهرابه آ و زهرابه ب،
5/0 میکرولیتر از آغازگر ایزومراز تری فسفات و
5 میکرولیتر DNA الگو انجام شد. چرخه حرارتی مورد استفاده به ترتیب واسرشتگی[14] در 95 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت سه دقیقه، اتصال[15] در 95 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت 30 ثانیه، 65 درجه سانتی‏گراد‏ تا 55 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت 30 ثانیه برای 11 سیکل و24 سیکل باقیمانده در 65 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت 30 ثانیه، گسترش[16] در دمای 72 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت 30 ثانیه و در پایان، 72 درجه سانتی‏گراد به مدت 5 دقیقه در دستگاه ترموسایکلر (T-cY، هلند) انجام شد. تشخیص ژن‏های ایزومراز تری فسفات، زهرابه آ و زهرابه ب با روش واکنش PCR با تکنیک چندتایی در آزمایشگاه مرکز تحقیقات بیماری‏های عفونی و گرمسیری دانشگاه علوم پزشکی اصفهان براساس روش لمی و همکاران[17] انجام گرفت (17).

کیفیت DNA با استفاده از ژل آگاروز 5/1 درصد در تانک الکتروفورز افقی ارزیابی شد. شدت و وضوح باندها، تحت تاثیر اشعه فرابنفش و بااستفاده از دستگاه ترانسلومیناتور بررسی شد (18). آغازگرهای مورد استفاده برای بررسیکلستریدیوم دیفیسیل از شرکت متابیون[18] تهیه و در جدول 1 نشان داده شده است.

 

جدول 1- توالی آغازگرهای ژن‏هایtpi، tcdA وtcdB برای تشخیص کلستریدیوم دیفیسیل

منبع

اندازه محصول برحسب جفت بازی

سکانس آغازگر

ژن هدف

38

230

F[5'- AAAGAAGCTACTAAGGGTACAAA-3']

R [5'-CATAATATTGGGTCTATTCCTAC-3']

tpi

17

369

F [5'- AGATTCCTATATTTACATGACAATAT-3']

R [5'-GTATCAGGCATAAAGTAATATACTTT-3']

tcdA

17

160

F [5'-GGAAAAGAGAATGGTTTTATTAA-3']

R [5'-TCTTTAGTTATAACTTTGACATCTTT-3']

tcdB

 

 

برای انجام آزمایش‏های مولکولی از سویهکلستریدیوم دیفیسیل ریبوتایپ 027 دریافتی از دانشگاه گوالف [xix] کانادا استفاده شد.

تجزیه و تحلیل آماری برای بررسی ارتباط بین شیوع کلستریدیوم دیفیسیل در دو نوع تکه‏ای و چرخ کرده گوشت گوساله در نرم افزار آماری SPSS (ویرایش 16) با استفاده از آزمون مربع کای در سطح معنی داری Pvalue< 0.05 انجام گرفت.

 

 

شکل 1- نتایج M-PCR برای تشخیص کلستریدیوم دیفیسیل درنمونه‏های گوشت گوساله در ژل آگاروز 5/1 درصد.
N: کنترل منفی،M: نشانگر 1000- 100 جفت بازی،
1: کنترل مثبت کلستریدیوم دیفیسیل ریبوتایپ 027
2: نمونه مثبت کلستریدیوم دیفیسیل

نتایج

در مطالعه حاضر، 12 نمونه (12 درصد‏) گوشت گوساله آلوده به کلستریدیوم دیفیسیلشناسایی شد. دو (4 درصد‏) و ده (20 درصد‏) نمونه از گوشت‏های آلوده به ترتیب به گوشت تکه‏ای و گوشت چرخ کرده مربوط بود. پرگنه‏های مورد بررسی از ژن‏های ایزومراز تری فسفات، زهرابه آ و ب برخوردار بودند (شکل 1).

براساس نتایج به دست آمده اختلاف آماری معنی‏داری بین شیوع آلودگی کلستریدیوم دیفیسیل در نمونه‏های چرخ کرده و تکه‏ای مشاهده شد
(01/0 = Pvalue).

 

بحث و نتیجه‏‏گیری

کلستریدیوم دیفیسیل باکتری‏ای است که به‏عنوان عامل عفونت در محیط بیمارستان شناخته شده است. علت افزایش بروز عفونت کلستریدیوم دیفیسیل با عوارضی حادتر و شدیدتر نسبت به قبل مبهم است. سویه‏های نو ظهوری از کلستریدیوم دیفیسیل مانند ریبوتایپ 027 با قدرت تهاجمی بالاتر به‏علت تولید بیشتر زهرابه آ و ب نسبت به سویه‏های قبلی در عفونت‏های شدید بین المللی پدیدار شده اند. مطالعات مختلف حکایت از پراکندگی گسترده اسپور کلستریدیوم دیفیسیل در محیط دارد. یکی از نگرانی‏های اصلی در این ارتباط، مصرف مواد غذایی آلوده به اسپور است که ممکن است تهدیدی جدی برای سلامت انسان باشد (19-21). در بررسی‏های نقاط مختلف دنیا شیوع کلستریدیوم دیفیسیل با مقادیر متفاوت گزارش شده است. در بررسی حاضر میزان شیوع کلستریدیوم دیفیسیل در گوشت تکه‏ای گوساله 4 درصد ‏است. در دو مطالعه در کشور‏های اتریش و هلند عدم وجود کلستریدیوم دیفیسیل در 26 و 145 نمونه گوشت تکه ای گوساله گزارش شد (14 و 22). در مطالعه ایندرا و همکاران[xx] به عدم آلودگی با کلستریدیوم دیفیسیل در نمونه‏های گوشت خوک و مرغ اشاره شد (14). در پژوهش انجام شده در کشور هلند، میزان آلودگی در گوشت بره و مرغ به ترتیب 3/6 و 7/2 درصد گزارش شد اما در همین مطالعه، دبوار و همکاران[xxi] به عدم جداسازی کلستریدیوم دیفیسیل در گوشت خوک اشاره کردند (22). در بررسی که به‏تازگی به‏عنوان نخستین گزارش از شیوع کلستریدیوم دیفیسل در آمریکای لاتین در کشور کاستاریکا ثبت شده است 4/1 درصد از گوشت گاو مورد آزمایش به کلستریدیوم دیفیسیل تولید کننده زهرابه آ و ب آلوده بودند. در مطالعه یاد شده میزان شیوع در گوشت خوک و مرغ، 3 و 4/1 درصد گزارش شد (23).شیوع در مطالعه حاضر به مراتب کمتر ازمطالعات بحث شده است.

مطالعات شیوع کلستریدیوم دیفیسیل در گوشت گوساله تکه‏ای در سطح عرضه به شکل جهانی کم است و بیشتر مطالعات، اختصاص به شیوع این میکروارگانیسم در گوشت‏های چرخ کرده دارد. برای مثال در بررسی‏های انجام شده در کشور کانادا میزان شیوع کلستریدیوم دیفیسیل در گوشت گوساله چرخ کرده 7/6 و 12 درصد گزارش شد (24 و 25). در مطالعه‏ای دیگر در سوئیس، تنها 04/2 درصد از نمونه‏های گوشت چرخ کرده گوساله آلوده به کلستریدیوم دیفیسیل بودند (26). همچنین، میزان شیوع باکتری در کشور فرانسه 9/1 درصد گزارش شد (27). دو مطالعه در آمریکا و دو مطالعه در اتریش و یک مطالعه در کشور سوئیس به نبود کلستریدیوم دیفیسیل در گوشت چرخ کرده گوساله اشاره کردند که به مراتب از نتایج بررسی حاضر کمتر است (14 و 28- 31). همچنین، در مطالعه‏ای در کشور آمریکا میزان شیوع تا 50 درصد گزارش شده است (32). مطالعه حاضر همسو با نتایج بررسی رودریگواز و همکاران[xxii] در کانادا با میزان شیوع 8/20 درصد در گوشت گوساله چرخ کرده است (33). یکی از نتایج مطالعه حاضر براساس مقایسه شیوع در دو نوع از گوشت، میزان جداسازی بالاتر کلستریدیوم دیفیسیل در گوشت چرخ کرده نسبت به تکه‏ای است که ممکن است مربوط به انتقال آلودگی باکتری از طریق دستگاه چرخ گوشت به محصول باشد که در مطالعه کاری و همکاران[xxiii]و همچنین، هوسر و همکاران[xxiv] به آن اشاره شده است (13 و 34). با رعایت اصول بهداشتی در شست و شو دستگاه‏ها و استفاده از ترکیبات ضدعفونی‏کننده مناسب در راستای حذف بیوفیلم‏های احتمالی تشکیل شده (در دستگاه چرخ گوشت) می‏توان شیوع باکتری را کاهش داد (35). در مطالعات مختلف انجام شده در دنیا، مقادیر مختلفی از شیوع کلستریدیوم دیفیسیل در گوشت قرمز یاد شده است که باید دقت لازم در ارتباط با تفسیر نتایج آن مبذول شود. از جمله دلایل آن، تفاوت در تعداد نمونه ها، شرایط جغرافیایی، منطقه ای و روش های مختلف تشخیص باکتری کلستریدیوم دیفیسیل است

بررسی حاضر نخستین گزارش از وضعیت آلودگی گوشت گوساله به کلستریدیوم دیفیسیل در سطح عرضه در شهر اصفهان است و گویای آن است که این محصول می‏تواند به‏عنوان حامل احتمالی انتقال کلستریدیوم دیفیسیل به انسان باشد البته پخت مناسب محصول می‏تواند نقش موثری در کاهش این میکروارگانیسم داشته باشد اما باید توجه داشت که پخت قادر به حذف کامل اسپور نیست (36 و 37). بنابراین، رعایت اصول بهداشتی، کنترل و نظارت دقیق و مستمر به‏عنوان راه حل مناسب برای کاهش باکتری را باید مد نظر قرار داد. با توجه به مخاطرات احتمالی ناشی آلودگی محصولات غذایی به اسپور باکتری نیاز به انجام مطالعات جامع‏تر در نقاط مختلف کشور روی محصولات مختلف غذایی برای تعیین وضعیت این باکتری در کشورمان است. بررسی الگوی ریبوتایپینگ سویه‏های کلستریدیوم دیفیسیل مطالعه حاضر در پژوهش‏های آینده می‏تواند پاسخگوی سوال های مرتبط با مطالعات اپیدمیولوژیک باشد.

تشکر و قدردانی

از همکاری همه کارکنان محترم مرکز تحقیقات بیماری‏های عفونی و گرمسیری دانشگاه علوم پزشکی اصفهان به‏ویژه سرکار خانم پریسا شعاعی تشکر و قدردانی می‏شود. نتایج مطالعه حاضر حاصل از پایان نامه دکتری تخصصی علوم و صنایع غذایی مصوب در دانشکده علوم و صنایع غذایی، واحد علوم و تحقیقات تهران، دانشگاه آزاد اسلامی است.

 

 

 

 

 

 




[1]- Clostridium difficile infection: CDI

[2]- tcdA

[3]- tcdB

[4]- Rho

[5]- Community associated clostridium difficile infection: CACDI

[6]- Clostridium difficlemoxalactamnorfloxacin: CDMN

[7]- Hardy Diagnostics, USA

[8]- triose phosphate isomerase: tpi

[9]- multiplex Polymerase chain reaction: M-PCR

[10]- MgCl2

[11]- dNTPs

[12]-Taq DNA polymerase

[13]- primer

[14]- denaturation

[15]- annealing

[16]- extension

[17]- Lemee et al

[18]- Martinsried, Germany

[xix]- Guelph

[xx]- Indra et al

[xxi]- de Boer et al

[xxii]- Rodriguez-Palacios et al

[xxiii]- Curry et al

[xxiv]- Houser et al

References

(1)   Borriello SP, Aktories K. Clostridium pertringens, Clostridium difficile, and other Clostridium species. In: Borriell SP, Murray PR, Funke G, editor. Topley and Wilson's microbiology and microbial infections. 10th ed. London: ASM press; 2005. P 1098-1136.

(2)   Hall I, O'Toole E. Intestinal microflora in newborn infants with a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. The AmericanJournal of Diseases of  Children 1935; 49 (2): 390-402.

(3)  Bartlett JG, Chang TW, Onderdonk AB. Antibiotic- associated pseudomembranous colitis due to toxin-producing clostridia. New England Journal of Medicine 1978; 298 (10): 531–4.

(4)  Gould LH, Limbago B. Clostridium difficile in food and domestic animals: a new foodborne pathogen? Clinical InfectiousDiseases 2010; 51 (5): 577-82.

(5)    Poutanen S, Simor A. Clostridium difficile-associated diarrhea in adults. Candadian Medical Associatin Journal 2004; 171 (1): 51-8.

(6)   Hookman P, Barkin JS. Reviwe: Clostridium difficile-associated disorders/diarrhea and Clostridium difficile colitis: the emergence of a more virulent era. Digestive Diseases and Sciences 2007; 52: 1071-5.

(7)   Just I, Selzer J, Wilm M, von Eichel-Streiber C, Mann M, Aktories K. Glucosylation of Rho proteins by Clostridium difficile toxin B. Nature 1995a; 375: 500-503.

(8)   Just I, Wilm M, Selzer J, Rex G, von Eichel-Streiber C, Mann M, et al. The enterotoxin from Clostridium difficile (toxA) monoglucosylates the Rho proteins. The Journal of Biological Chemistry 1995b; 270 (23): 13932–6.

( 9)  Keel MK, Songer JG. The comparative pathology of Clostridium difficile-associated disease. Veterinary Pathology 2006; 43: 225–40. 

(10)   Kuehne SA, Cartman ST. Both, toxin A and toxin B are important in Clostridium difficile infection. Gut Microbes 2011; 2 (4): 252-5.

(11)   Riggs MM, Sethi AK, Zabarsky TF, Eckstein EC, Jump RLP, Donskey CJ. Asymptomatic carriers are a potential source for transmission of epidemic and nonepidemicClostridium difficile strains among long-term care facility residents. Clinical Infectious Diseases 2007; 45: 992-8.

(12)  Weese JS. Clostridium difficile in food-innocent bystander or serious threat? Clinical Microbiology and Infection 2009; 16: 3-10.

(13)   Houser BA, Soehnlen MK, Wolfgang DR, Lysczek HR, Burns CM, Jayarao BM. Prevalence of Clostridium difficile toxin genes in the feces of beef calves and incidence of ground beef contamination. Foodborne pathogenand disease 2012; 9 (1): 32- 6.

(14)   Indra A, Lassing H, Baliko N, Much P, Fiedler A, Huhulescu S, et al. Clostridium difficile: a new zoonotic agent? Wien Klin Wochenschr 2009; 121: 91-5.

(15) Jalali M, Khorvash F, Warriner K, Weese JS. Clostridium difficile infection in an Iranian hospital. BMC Research Notes 2012; 5: 1-5.

(16)  Esfandiari Z, Jalali M, Ezzatpanah H, Weese JS, Chamani M. The Frequency of Clostridium difficile in Processing steps of hamburger. Journal of Health System Research 2013; Special Issue on Nutrition: 1460-7

(17)   Lemee L, Dhalluin A, Testelin S, Mattrat M. A, Maillard K, Lemeland JF, et al. Multiplex PCR targeting tpi (triose phosphate isomerase) , tcdA (toxin A) , and tcdB (toxin B) genes for toxigenic culture of Clostridium difficile. Journal of Clinical Microbiology 2004; 42 (12): 5710-14.

(18)  Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning: A laboratory manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor; 2001.

(19) Rupnik M. Is Clostridium difficle-associated infection a potentially zoonotic and foodborne disease? Clinical Microbiology and Infectious Diseases 2007; 13: 457-9.

(20)  Rupnik M, Wilcox MH, Gerding N. Clostridium difficile infection: new developments in empidemiology and pathogenesis. Nature 2009; 7: 526- 37.

(21)  Rupnik M, Songer JG. Clostridium difficile: Its potential as a source of foodborne disease. Advances in Food and Nutrition Research 2010; 60: 53- 66.

(22)  De Boer E, Zwartkruis-Nahuis A, Heuvelink AE, Harmanus C, Kuijper EJ. Prevalence of Clostridium difficile in retailed meat in the Netherlands. Interantional Journal of Food Microbiology 2011; 144: 561-4.

(23) Quesada-Gomez C, Mulvey MR, Vargas P, Gamboa-Coronado MDM, Rodrigeuz C, Rodriguez-Cavillini E. Isolation of a toxigenic and clinical genotype of Clostridium difficile in retail meats in Costa Rica. Journal of Food Protection 2013; 76 (2): 348-51.

(24) Rodriguez-Palacios A, Reid-Smith RJ, Staempfli HR, Daignault D, Janecko N, Avery BP, et al. Possible seasonality of Clostridium difficile in retail meat, Canada. Emerging Infectious Diseases 2009; 15 (5):802- 05.

(25)  Weese JS, Avery BP, Rousseau J, Reid-Smith RJ. Detection and Enumeration of Clostridium difficile spores in retail beef and pork. Applied and Environmental Microbiology 2009; 75 (15): 5009- 11.

(26) Von Abercron SMM, Karlsson F, TrowaldWigh G, Wierup M, Krovacek K. Low occurrence of Clostridium difficile in retail ground meat in Sweden. Journal of Food Protection 2009; 72 (8):1732-4.

(27) Bouttier S, Barc MC, Felix B, Lambert S, Collignon A, Barbut F. Clostridium difficile in ground meat, France. Emerging Infectious Diseases 2010; 16 (4) :733- 734.

(28) Harvey RB, Norman KN, Andrews K, Norby B, Hume ME, Scanlan CM, et al. Clostridium difficile in retail meat and processing plants in Texas. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 2011; 23: 807-11.

(29) Limbago B, Thompson AD, Greene SA, MacCannell D, MacGowan CE, Jolbitado B, et al. Development of a Consensus Method for Culture of Clostridium difficile from Meat and Its Use in a Survey of US Retail Meats. Food Microbiology 2012; 32: 448-51.

(30) Jobstl M, Heuberger S, Indra A, Nept R, Kofer J, Wagner M. Clostridium difficile in raw products of animal origin. International Journal of Food Microbiology 2010; 138: 172-5.

(31) Hoffer E, Haechler H, Frei R, Stephan R. Low occurrence of Clostridium difficile in fecal samples of healthy calves and pigs at slaughter and in minced meat in Switzerland. Journal of Food Protection 2010; 73 (5): 973-5.

(32)  Songer JG, Trinh HT, Killgore GE, Thompson AD, McDonald LC, Limbago BM. Clostridium difficile in retail meat products, USA, 2007. Emerging Infectious Diseases 2009; 15 (5): 819- 21.

(33) Rodriguez-Palacios A, Staempfli HR, Duffield T, Weese JS. Clostridium difficile in retail ground meat, Canada. Emerging Infectious Diseases 2007; 13 (3): 485-7.

(34) Curry SR, Marsh JW, Schlackman JL, Harrison LH. Prevalence of Clostridium difficile in uncooked ground meat products from Pittsburgh, Pennsylvania. Applied and Environmental Microbiology 2012; 78 (12): 4183-6.