جداسازی سودوموناس‏های مقاوم به نانو اکسید روی از خاک و بررسی ژن‏های دخیل در مقاومت

نویسندگان

1 دکتری میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، ایران

2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، ایران

3 استادیار ژنتیک مولکولی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی‏‏صنعتی و فناوری پیشرفته کرمان، ایران

4 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی‏‏صنعتی و فناوری پیشرفته کرمان، ایران

چکیده

مقدمه: نانو ذرات اکسید روی به طور وسیع در صنعت، لوازم آرایشی، بهداشتی و پزشکی استفاده می‏شوند. بررسی‏های زیادی بر روی فعالیت ضد میکروبی نانو ذرات متمرکز انجام شده است، اما اطلاعات اندکی در مورد مقاومت باکتری‏ها در برابر آن‏ها در دسترس است‏‏.
مواد و روش‏‏ها: جدایه‏های سودوموناس مقاوم به نانو اکسید روی از نمونه‏های خاک جمع آوری شده از مناطق مختلف از جمله معدن مس سرچشمه کرمان جداسازی شد. جدایه انتخاب شده به‏وسیله تحلیل‏ توالی ژن 16S rRNA شناسایی شد. اثر نانو ذرات اکسید روی بر روی سرعت رشد باکتری بررسی شد. یون‏های محلول روی آزاد شده از نانو ذرات اکسید روی به‏وسیله اسپکتروفتومتری جذب اتمی اندازه‏گیری شد. بخشی از توالی ژن مقاوم به روی (czcC) تکثیر شده و به‏وسیله تحلیل‏ فیلوژنتیکی توالی پروتئین آن شناسایی شد.
نتایج: تحلیل‏ فیلوژنتیکی بر اساس توالی ژن 16S rRNA نشان داد که جدایه انتخاب شده Pseudomonas sp. ZnO-2 است. الگوی رشد جدایه انتخاب شده در حضور تمام غلظت‏های نانو اکسید روی مورد بررسی، مشابه نمونه کنترل (کشت فاقد نانو ذرات) بود که نشان می‏دهد نانو ذرات اکسید روی رشد جدایه جداسازی شده را تحت تاثیر قرار نداده است. PCR ژن czcC و الکتروفورز نشان داد که Pseudomonas sp. ZnO-2 دارای این ژن است.
بحث و نتیجه‏گیری: در طی فرآیند تکامل، میکروارگانیسم‏ها مکانیسم‏های مقاومت به فلزات خود را برای سازگاری با محیط‏های مختلف بهبود می‏بخشند. وجود ژن czcC به‏وسیله PCR تایید شد که شباهت زیادی با ژن‏های مقاوم به روی در باکتری‏های دیگر نشان می‏دهد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation of Zinc Oxide (ZnO) nanoparticles resistant Pseudomonas strains from soil and investigation of Zinc resistance genes

نویسندگان [English]

  • Shahla Soltani Nezhad 1
  • Mohammad Rabbani Khorasgani 2
  • Mohammad Mehdi Yaghoobi 3
  • Shahryar Shakeri 4
1 Ph.D. of Microbiology, University of Isfahan, Iran
2 Associate Professor of Microbiology, University of Isfahan, Iran
3 Assistant Professor of Molecular Genetics, Institute of Science, High Technology and Environmental Sciences, Graduate University of Advanced Technology, Kerman, Iran
4 Assistant Professor of microbiology, Institute of Science, High Technology and Environmental Sciences, Graduate University of Advanced Technology, Kerman, Iran
چکیده [English]

Introduction: Themetal oxide nanoparticles of ZnO are widely used in industrial, cosmetic and medical applications. Many studies have focused on the antimicrobial activity of nanoparticles, but limited information on the resistance of bacteria to them is available.
Materials and methods: TheZnO nanoparticles resistant Pseudomonas strains were isolated from the collected soils from different areas such as Sarcheshmeh Copper mine in Kerman province of Iran. The selected strain was identified by 16 s rRNA gene sequencing analysis. The effect of ZnO NPs on the bacterial growth kinetic was studied. Release of soluble Zinc ions from ZnO NPs were measured by an atomic absorption spectroscopy. The partial sequence of Zinc resistance gene czcC was amplified and identified by phylogenetic analysis of its protein sequences.
Results: Phylogenetic analysis based on the 16 s rRNA gene sequence showed that the selected strain was Pseudomonas sp. ZnO-2. The growth pattern of selected strain with all studied ZnO NPs concentration was similar to that of control, indicating that ZnO NPs would not affect the growth of isolated strain. During dispersion a substantial amount of zinc ions was quickly released from ZnO NPs. PCR amplification of czcC gene and electrophoresis showed that Pseudomonas sp. ZnO-2 carried this gene.
Discussion and conclusion: Through the evolutionary process, microorganisms have improved their heavy metal resistance mechanisms to adapt to adverse environment. The existence of the czcC gene was confirmed by PCR and it showed high homology with Zinc resistance genes from other bacteria. 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Zinc oxide nanoparticles
  • Heavy metal
  • Resistance
  • Pseudomonas

مقدمه

نانو ذرات اکسید فلزی در مقیاس وسیع برای کاربردهای صنعتی و مصارف خانگی تولید می‏شوند. تولید و استفاده زیاد از این نانو ذرات، خطر آلودگی‏های محیطی را افزایش داده و آلودگی خاک، باکتری‏های محیطی را تحت تاثیر قرار خواهد داد(1). نانو ذرات اکسید روی (ZnO) در صنایع الکترونیک، نساجی، لوازم آرایشی، اسپری‏ها، پلاستیک، رنگ‏ها، فیلم‏های محافظ
اشعه ماورا بنفش، حسگرهای شیمیایی و بسته بندی مواد غذایی استفاده می‏شوند(1، 2 و 3). این نانو ذرات فعالیت ضد میکروبی قوی بر علیه باکتری‏های گرم مثبت و گرم منفی به‏ویژه عوامل بیماری‏زای غذایی مهم مثل اشریشیاکولای O157:H7[1]، لیستریا منوسیتوژنز[2]، سالمونلا[3] و استافیلوکوکوس اورئوس[4] دارد (4 و 5). بررسی‏ها نشان داده که ذرات نانو نسبت به یون‏های فلزی سمیت سلولی بالاتری دارند، زیرا امکان نفوذ آن‏ها به درون غشای سلولی و رها‏سازی یون‏های فلزی در درون سلول بیشتر است (6).

سودوموناس جنسی از گاما پروتئوباکترهاست. باکتری گرم منفی، میله ای، هوازی، بدون اسپور، متحرک با تاژک قطبی، اکسیداز و کاتالاز مثبت است (7 و 8). این جنس شامل گونه‏هایی با عملکردهای اکولوژیکی، اقتصادی و پزشکی است که برخی اعضای آن قادرند مواد شیمیایی آلوده کننده را در محیط متابولیزه کنند. در نتیجه می‏توانند در تجزیه زیستی[5] استفاده شوند(9). در حالی که فعالیت ضد میکروبی نانو ذرات به فراوانی بررسی شده اما اطلاعات اندکی در مورد مکانیسم مقاومت باکتری‏ها در برابر این ذرات وجود دارد. بر این اساس هدف از این پژوهش، جداسازی و غربال‏گری جدایه‏های سودوموناس مقاوم به نانو اکسید روی از خاک و شناسایی ژن‏های دخیل در مقاومت است.

 

مواد و روش‏ها

جمع آوری نمونه

نمونه‏های خاک (حدود 100 گرم از هر نمونه) از مناطق مختلف از جمله معدن مس سرچشمه، مجتمع مس شهید باهنر و محوطه تصفیه خانه آب و پساب کرمان، از عمق 20 سانتی‏متری در فلاسک‏های استریل جمع آوری و برای مطالعات بیشتر در 4 درجه سانتی‏گراد نگهداری شدند (10).

تهیه محلول ذخیره[6] نانو اکسید روی[7](ZnO)

نانو ذرات پودری اکسید روی (سیگما، آمریکا) با درجه خلوص بیشتر از 99 درصد، اندازه 35 تا 45 نانو متر، رنگ سفید شیری و تقریباً کروی شکل استفاده شد. این نانو ذرات به‏وسیله XRD[8] تحلیل‏ شدند. محلول ذخیره به‏وسیله سوسپانسیون نمودن نانوذرات در آب دو بار تقطیر استریل برای تهیه غلظت نهایی 100 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر فراهم شد. این سوسپانسیون به مدت 30 دقیقه با w 30 اولتراسونیک شده تا این که سوسپانسیون کلوییدی یکنواختی فراهم شد (11 و 12). این محلول در 4 درجه سانتی‏گراد نگهداری شد.

غنی‏سازی و جداسازی سویه‏های سودوموناس از خاک

یک گرم از هر نمونه خاک در 10 میلی‌لیتر آب مقطر استریل سوسپانسیون شده، یک دقیقه ورتکس شد. این سوسپانسیون در rpm 2000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شده، 1/0 میلی‌لیتر از سوپرناتانت رقیق شده به پتری دیش‏های استریل حاوی محیط PIA[9] دارای غلظت 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر از ZnO اضافه شد. محیط‏ها به مدت 72 ساعت در 30 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند. کلونی‏های مجزا بر روی محیط انتخابی PIA کشت مجدد داده شده تا کشت خالص و یک دستی از هر کلونی فراهم شود (13).

 

غربال گری سودوموناس‏های مقاوم به ZnO

برای جداسازی جدایه‏های مقاوم، نمونه‏ها بر روی محیط PIA دارای غلظت‏های مختلف ZnO (100 تا 500 میکروگرم بر میلی‌لیتر) غربال شدند. کشت‏ها 3 تا 5 روز در 30 درجه سانتی‏گراد گرمخانه‏گذاری شدند. تمام آزمایش‏ها با سه تکرار انجام شد.

سنجش سرعت رشد باکتری در حضور غلظت‏های مختلف ZnO

 به منظور بررسی اثر نانو ذرات اکسید روی بر سرعت رشد باکتری، غلظت‏های مختلف آن(100 تا400 میکروگرم بر میلی‌لیتر) استفاده شد. فلاسک‏های استریل دارای 50 میلی‌لیتر محیط کشت آبگوشت LB به مدت 30 دقیقه پس از اضافه نمودن ZnO اولتراسونیک(Tecna 6، ایتالیا) شد. فلاسک‏ها با حدود- 105CFU  بر میلی‌لیتر از کشت تازه باکتری تلقیح شده و در 30 درجه سانتی‏گراد با دور rpm 200 گرمخانه‏گذاری شدند. میزان رشد باکتری با اندازه‏گیری جذب نوری در نانومتر 600 اندازه‏گیری شد. نمونه کنترل مثبت شامل (فلاسک دارای محیط کشت و نانو ذرات، بدون تلقیح باکتری) و نمونه کنترل منفی شامل (فلاسک دارای محیط کشت و باکتری، بدون نانو ذرات) است(14).

تعیین بیشترین غلظت قابل تحمل MTC[10] نانو اکسید روی

 برای تعیین MTC نانو اکسید روی، جدایه مورد نظر بر روی محیط MHA[11] دارای غلظت‏های مختلف نانو اکسید (100 تا 900 میکروگرم بر میلی‌لیتر) کشت داده شده و رشد آن پس از گذشت 48 ساعت در 30 درجه سانتی‏گراد بررسی شد. MTC بالاترین غلظتی از نانو اکسید است که اجازه رشد پس از 48 ساعت گرمخانه‏گذاری در 30 درجه سانتی‏گراد را می‏دهد (15).

اندازه‏گیری رها‏سازی یون‏های روی از ZnO

سوسپانسیون تازه ای از ZnO با غلظت‏های 100 و 200 میلی‌گرم بر لیتر فراهم شده، اسیدیته آن6 و 7 تنظیم شد. این سوسپانسیون به مدت یک ساعت به ملایمت تکان داده شده، سپس 30 دقیقه در g 15000 سانتریفیوژ شد. مایع رویی جمع آوری شده، دوباره به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ شد. غلظت یون روی محلول در مایع رویی ثانویه به‏وسیله اسپکتروفتومتری جذب اتمی
(Varian SpectrAA 220، استرالیا) اندازه‏گیری شد (15). آزمایش با سه تکرار انجام شد.

شناسایی جدایه‏های باکتریایی

تکثیر ژن 16S rRNA و تحلیل‏ الکتروفورزی

DNA ژنومی باکتری مورد نظر با استفاده از کیت استخراج DNA (سیناژن با شماره کاتالوگ DN8115 C) استخراج شد. دو پرایمر مورد استفاده برای تکثیر ژن
16S rRNA عبارتند از: 8F با توالی

5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´
و 1541 R با توالی:

-3´AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-5´(16)

برنامه PCR با 30 سیکل تکثیر در دستگاه ترموسایکلر به این شکل انجام شد: جداسازی اولیه دو رشته در دمای 94 درجه به مدت 5 دقیقه،
باز شدن دو رشته در دمای 94 درجه به مدت 1 دقیقه، اتصال پرایمرها در دمای 56 درجه به مدت 1 دقیقه، طویل شدن رشته هدف در 72 درجه به مدت 2 دقیقه و مرحله طویل شدن نهایی در دمای 72 درجه به مدت 10 دقیقه. محصول PCR به‏وسیله الکتروفورز روی ژل آگاروز یک درصد (مرک، آلمان) جداسازی شده و به‏وسیله اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی شد. توالی ژن توسط شرکت بیونیر[12] کره جنوبی تعیین شد. این توالی توسط نرم افزارهای مختلف از جمله BioEdit، Finch TV، Gene Runner و سایر... بررسی و تحلیل‏ شد (17). نتایج حاصل از BLAST توالی مورد نظر در سایت‏های NCBI[13] و EBI[14] بررسی شده و توسط نرم افزارهای CLC و MEGA5 تحلیل‏ شد (18- 20). درخت فیلوژنتیکی به روش Neighbor joining ترسیم شده، در نهایت، توالی ژن توسط نرم افزار sequin در بانک ژن با شماره دست یابی[15] JX441330 ثبت شد.

تکثیر بخشی از ژن مسئول مقاومت به روی (czcC)

 پس از استخراج DNA ژنومی، بخشی از ژن czcC به‏وسیله PCR تکثیر شد. پرایمرهای مورد استفاده عبارتند از: پرایمر رفت با توالی
-GATGACGTTGTTCGATGG-
و پرایمر برگشت با توالی

 5´-CGTCGAGGTAGGCAATCA-3´

برنامه PCR با 35 سیکل تکثیر در دستگاه ترموسایکلر به این شکل انجام شد: جداسازی اولیه دو رشته در دمای 94 درجه به مدت 5 دقیقه،
 باز شدن دو رشته در دمای 94 درجه به مدت 45 ثانیه، اتصال پرایمرها در دمای 56 درجه به مدت 40 ثانیه، طویل شدن رشته هدف در 72 درجه به مدت 45 ثانیه و مرحله طویل شدن نهایی در دمای 72 درجه به مدت 5 دقیقه. محصول PCR با استفاده از ژل آگاروز 5/1 درصد و ولتاژ 80 ولت با استفاده از بافر TBE بررسی شد. محصول PCR تعیین توالی شده و توالی نوکلئوتیدی آن با کمک سرور ExPASy به توالی پروتئین ترجمه شد. این توالی پروتئین به منظور شناسایی نزدیک‏ترین محصولات ژنی czcC بلاست شده و در نهایت، درخت فیلوژنی به روش Neighbor joining با استفاده از مدل دو شاخصی کیمورا [16]رسم شد (21)

 

نتایج

تعیین ویژگی‏های ریخت‏شناسی نانو ذرات اکسید روی

شکل 1 الگوی XRD نانو ذرات اکسید روی را نشان می‏دهد که با داده‏های استانداردی که قبل گزارش شده (22) همخوانی دارد و حالت کریستال بودن آن را تایید می‏کند.

 

 

شکل 1- الگوی XRD نانو ذرات ZnO

 

 

 

 


جداسازی و غربال گری سویه‏های مقاوم

در این پژوهش، 5 جدایه مقاوم به نانواکسید روی از خاک جدا‏سازی شد. از میان آن‏ها، 4 جدایه در محیط PIA دارای200 میکروگرم بر میلی‌لیتر نانو اکسید روی و 2 جدایه در محیط دارای300 میکروگرم بر میلی‌لیتر نانو اکسید روی رشد کردند. در نهایت، جدایه ZnO-2 (جدا شده از خاک معدن مس سرچشمه) بالاترین مقاومت را نسبت به نانوذرات ZnO نشان داد که برای بررسی‏های بیشتر انتخاب شد.

بررسی منحنی رشد باکتری در حضور غلظت‏های مختلف ZnO

شکل 2 منحنی رشد جدایه Pseudomonas sp. ZnO-2 در حضور غلظت‏های مختلف نانو ذرات ZnO را نشان می‏دهد. الگوی رشد این باکتری در غلظت‏های مختلف ZnO مشابه نمونه کنترل (بدون نانوذرات ZnO) است که نشان می‏دهد نانو ذرات رشد این باکتری را تحت تاثیر قرار نداده است.

 

 

 

 

شکل2- منحنی رشدPseudomonas sp. ZnO-2 در حضور غلظت‏های مختلف نانو اکسید روی

 


تعیین MTC نانو ذرات روی

بررسی بالاترین غلظت قابل تحمل نانو ذرات اکسید روی در جدایه Pseudomonas sp. ZnO-2 نشان داد که این جدایه قادر به رشد در غلظت‏های بالا تا
600 میکروگرم بر میلی‌لیتر نانو اکسید است.

 
رها‏سازی یون‏های محلول روی از نانو ذرات ZnO

میزان رها شدن یون روی از نانو ذرات ZnO در جدول 1 نشان داده شده است. نتایج نشان می‏دهد که مقادیر در خور توجهی از یون‏های روی سریع در محیط رها می‏شوند. برای رها‏سازی یون‏های روی، بر هم کنش معنی‏داری بین غلظت و اسیدیته وجود دارد.

 

 

جدول1- رها‏ سازی یون‏های محلول روی از سوسپانسیون 100 و 200 میلی‏‏گرم بر لیتر نانو ذرات ZnO

اسیدیته 7

اسیدیته 6

ماده

100 میلی‌گرم بر لیتر

200 میلی‌گرم بر لیتر

100 میلی‌گرم بر لیتر

200 میلی‌گرم بر لیتر

یون محلول روی )میلی‌گرم بر لیتر)

یون محلول روی )میلی‌گرم بر لیتر(

003/0± 02/20

01/0± 002/32

003/0± 18/18

003/0± 25/28

ZnO

 


تحلیل‏ فیلوژنتیکی

وابستگی فیلوژنتیکی جدایه Pseudomonas sp. ZnO-2 به‏وسیله تحلیل‏ توالی ژن 16S rRNA مشخص شد. تحلیل‏ فیلوژنی ژن 16S rRNA روشی دقیق و سریع برای شناسایی موقعیت فیلوژنی باکتری‏هاست.

 طول کامل این ژن (حدود 1500 جفت باز) تعیین توالی شده و درخت فیلوژنی رسم شد. شکل 3 ارتباط فیلوژنتیکی این باکتری را با باکتری‏های دیگر نشان می‏دهد.

 

 

 

شکل 3- درخت فیلوژنی رسم شده بر اساس توالی ژن 16S rRNA که وابستگی جدایه Pseudomonas sp. ZnO-2 را با جدایه‏های دیگر نشان می‏دهد.

 


 

تحلیل‏ فیلوژنتیکی ژن czcC

 پرایمرهای استفاده شده برای تکثیر ژن czcC تقریبا یک باند 150 جفت بازی را ایجاد کردند (شکل 4). توالی نوکلئوتیدی به توالی پروتئین ترجمه شده و با توالی‏های پروتئین CzcC باکتری‏های دیگر مقاوم به روی هم‏تراز[17] شد. درخت فیلوژنی بر اساس توالی پروتئین CzcC رسم شد (شکل 5). مقایسه توالی‏ها، تشابه زیادی با ژن مقاومت به روی در باکتری سودوموناس پوتیدا نشان داد.

 

شکل 4- الکتروفورز ژل آگاروز محصول PCR ژن czcC

1- نشانگر DNA  2- ژنczcCجدایه Pseudomonas sp. ZnO-2

 

 

 

شکل 5- درخت فیلوژنی رسم شده بر اساس پروتئین CzcC

 


بحث و نتیجه‏‏گیری

آلودگی خاک با فلزات سنگین و ذرات نانو در حال گسترش است که به طور گسترده در نتیجه فعالیت‏های بشر مانند معدن کاوی، کشاورزی و صنعت اتفاق می‏افتد. معدن مس سرچشمه در جنوب غربی استان کرمان طی فعالیت خود در سال‏های متمادی باعث آلودگی خاک‏های سطحی با فلزات سنگین شده است. این آلودگی می‏تواند اثرات مهمی بر روی جمعیت میکروبی بومی داشته باشد. برای مثال‏ فلزات سنگین و نانو ذرات می‏توانند ترکیب گونه‏ای و تولید مثل میکروبی را محدود کنند. همچنین، ممکن است فعالیت‏های میکروبی مثل تثبیت ازت را تحت تأثیر قرار دهند (23). پژوهش حاضر، با هدف شناسایی جدایه‏های سودوموناس بومی که توانایی مقاومت در برابر نانوذرات اکسید روی را داشته باشند، شروع شد. محیط‏های آلوده به فلزات سنگین منابع بالقوه‏ای برای جداسازی این باکتری‏های مقاوم هستند.

آزاد شدن یون روی از نانو ذرات ZnO

دیمکپاو همکاران[xviii] نشان دادند که رها‏سازی یون‏های محلول از ZnO وابسته به اسیدیته و جرم است. به گونه‏ای که همچنان که غلظت افزایش پیدا می‏کند، میزان یون بیشتری آزاد می‏شود و یون‏های کمتری در اسیدیته 7 نسبت به اسیدیته 6 رها می‏شود که با نتایج این پژوهش هم‏خوانی دارد (1). پژوهشگران زیادی نشان داده اند که رها شدن یون‏ها از نانو ذرات به سمیت آن‏ها کمک می‏کند (1، 24 و 25). برای مثال‏ چکل و همکاران[xix] گزارش کردند که آزاد شدن یون روی از نانو ذرات ZnO به فعالیت ضد باکتریایی نانو اکسید روی کمک می‏کند (26). همچنین، دیمکپا و همکاران نقش بیولوژیکی رها شدن یون‏ها از ذرات نانو را نشان دادند به گونه‏ای که سمیت این ذرات هنگام استفاده از کلاته‏کننده‏های اختصاصی یون‏ها از بین رفت (1). بنابراین، با توجه به این نتایج ممکن است مکانیسم مقاومت به نانو ذرات روی نیز همان مکانیسم‏های مقاومت به فلز روی باشد.

تکثیر ژن دخیل در مقاومت

 در طی فرآیند تکامل، میکروارگانیسم‏ها مکانیسم‏های مقاومت به فلزات خود را برای سازگاری با محیط‏های مختلف بهبود می‏بخشند. باکتری‏ها مکانیسم‏های مختلفی برای مقاومت در برابر عوامل ضد میکروبی دارند. محصولات کد شده به‏وسیله ژن‏های مقاوم نیز می‏توانند سمیت فلزات سنگین را کاهش داده و یا حذف کنند (23). برای مثال،‏ آنزیم‏های کد شده به‏وسیله ژن‏های مسوول مقاومت، عوامل ضد میکروبی را قبل از این که اثر گذار باشند، تخریب می‏کنند. همچنین، باکتری‏ها امکان دارد پمپ‏های انتشار به خارج[xx]را کسب نمایند که عوامل ضد میکروبی را قبل از این که به محل هدف برسند، دفع کنند (27). در این پژوهش، مقایسه توالی بخشی از پروتئین CzcC تشابه زیادی با باکتری‏های دیگر نشان داد. تحلیل‏ درخت فیلوژنی CzcC نشان داد که Pseudomonas sp. ZnO-2 شاخه فیلوژنتیکی با Pseudomonas putida DOT- T1E تشکیل می‏دهد. بهترین مکانیسم مقاومت به روی سیستم czc است که مقاومت به کادمیوم، روی و کبالت را باعث می‏شود. این سیستم به عنوان آنتی‏پورتر کاتیون/ پروتون پمپ کننده کاتیون‏ها به خارج سلول عمل می‏کند. CzcC یک پروتئین غشای خارجی است. CzcB و CzcA در فضای پری پلاسمی گسترده هستند و از رها شدن کاتیون‏های آزاد جلوگیری می‏کنند. CzcD در غشای سیتوپلاسمی قرار دارد (28). با توجه به نتایج این پژوهش می‏توان نتیجه گرفت که خاک‏های آلوده به فلزات سنگین منابع بالقوه‏ای برای جداسازی جدایه‏های مقاوم به ذرات نانو هستند. از طرفی چون نانو‏ذرات اکسید فلزی مقدار در خور توجهی یون‏های فلزی محلول را در محیط آزاد می‏نمایند که به سمیت آن‏ها کمک می‏کند، می‏توان بیان کرد که ممکن است یکی از مکانیسم‏های مقاومت میکروارگانیسم‏ها در برابر ذرات نانو نیز همان مکانیسم‏های مقاومت در برابر فلزات باشد.

تشکر و قدردانی

 از تمام افرادی که ما را در انجام این پژوهش یاری کردند، به‏ویژه مسوولین محترم آزمایشگاه بیوتکنولوژی پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی دانشگاه تحصیلات تکمیلی‏‏صنعتی و فناوری پیشرفته کرمان تشکر و قدردانی می‏شود.

 

 



[1]- Escherichiacoli O157:H7

[2]- Listeria monocytogenes

[3]- Salmonella

[4]- Staphylococcus aureus

[5]- Bioremediation

[6]- Stock solution

[7]- Zinc Oxide Nanoparticles

[8]- X-ray diffraction analysis

(PANalytical XPert Pro Eindhoven, Netherlands)

[9]- Pseudomonas Isolation Agar

[10]- Maximum Tolerable Concentration

[11]- Muller Hinton Agar

[12]- Bioneer

[13]- http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

[14]- http://www.ebi.ac.uk

[15]- Accession number

[16]- Kimura’s two-parameter model

[17]- align

[xviii]- Dimkpa et al

[xix]- Scheckel et al

[xx]- Efflux pumps

References

(1) Dimkpa CO, Alyssa C, Britt DW, McLean JE, Anderson AJ. Responses of a soil bacterium, Pseudomonas chlororaphis O6 to commercial metal oxide nanoparticles compared with responses to metal ions. Environmental pollution. 2011; 159: 1749- 56.

(2)  Mueller NC, Nowack B. Exposure modeling of engineered nanoparticles in the environment. Environmental Science and Technology. 2008; 42(12): 4447-53.

(3)  Aruoja V, Dubourguier HC, Kasemets K, Kahru A. Toxicity of nanoparticles of CuO, ZnO and TiO2 to microalgae Pseudokirchneriella subcapitata. Science of the Total environment. 2009; 407 (4): 1461-68.

(4) Jones N, Ray B, Ranjit KT, MannaAC. Antibacterial activity of ZnO nanoparticle suspensions on a broad spectrum of microorganisms. FEMS Microbiology Letters. 2008; 279 (1): 71–76.

(5) Jin T, Sun D, Su JY, Zhang H, Sue HJ. Antimicrobial efficacy of zinc oxide quantum dots against Listeria monocytogenes, Salmonella enteritidis and Escherichia coli O157:H7. Journal of Food Science. 2009; 74(1): M46–M52.

(6) Wu B, Huang R, Sahu M, Feng X, Biswas P, Tang YJ. Bacterial responses to Cu-doped TiO2 nanoparticles. Science of the Total Environment. 2010; 408 (7): 1755–58.

(7)  Krieg NR. Bergey`s manual of systematic bacteriology. 2nd ed. Baltimore: Williams & Wilkins; 1984.

(8) Barnali S, Celin A, Joshi SR. Pseudomonas: A versatile bacterial group exhibiting dual resistance to metals and antibiotics. African Journal of Microbiology Research. 2010; 4 (25): 2828-35.

 

 

(9) Tanase AM, Trasca C, V assu T, Olteanu A, Pelinescu D, Csutka O, et al. Phylogenetic Analysis on 16S Ribosomal DNA of Pseudomonas Strains from Oil Polluted Soil. Romanian Biotechnology Letters. 2009; 14 (6): 4779-85.

(10)   Sevgoli E, Corali G, Gizir AM, Sangun MK. Investigation of heavy metal resistance in some bacterial strains isolated from industrial soils. Turkish Journal of Biology. 2010; 34: 423-31.

(11)  Ashutosh K, Alok KP, Shashi SS, Rishi S, Alok D. Cellular uptake and mutagenic potential of metal oxide nanoparticles in bacterial cells. Chemosphere. 2011; 83 (8): 1124–32.

(12) Yanping X, Yiping H, Peter LI, Tony J, Xianming S. Antibacterial activity and mechanism of action of Zinc Oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 2011; 77 (7): 2325–31.

(13)  Anyanwu CU, Nwachukwu ON. Heavy Metal Resistance in Bacteria Isolated from Contaminated and Uncontaminated Soils. International Journal of Research in Chemistry and Environment. 2011; 1(1): 173-8.

(14) Khan S, Mukherjee A, Chandrasekaran N. Silver nanoparticles tolerant bacteria from sewage. Journal of Environmental Sciences. 2011; 23 (2): 346-52.

(15) Margeay M, Nies D, Schlegel HG. Alcaligenes eutrophus CH34 is a facultative chemolitotroph with plasmid bound resistance to heavy metals. Journal of Bacteriology. 1985;162: 328-34.

(16) Loffler FE, Sun Q, Li J, TiedjeiJM. 16S rRNA Gene-Based Detection of Tetrachloroethene- Dechlorinating Desulfuromonas and Dehalococcoides Species. Applied and Environmental Microbiology. 2000; 66(4): 1369-74.

(17)  Hall T. Bio Edit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 1999; 41: 95-98.

(18) Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution. 2011; 28 (10): 2731-2739.

(19)  Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 1990; 215 (3): 403–10.

(20)  Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution. 1985; 39 (4): 783-91.

(21)   Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution. 1980; 16 (2): 111–20.

(22)  Peng X, Palma Sh, Fisher NS, Wong SS. Effect of morphology of ZnO nanostructures on their toxicity to marine algae. Aquatic Toxicology. 2011; 102:186–96.

(23) Wei G, Fan L, Zhu W, Fu Y, yu J, Tang M. Isolation and characterization of the heavy metal resistant bacteria CCNWRS33-2 isolated from root nodule of Lespedeza cuneata in gold mine tailing in China. Journal of Hazardous materials. 2009; 162 (1): 50-6.

(24)   Wu B, Wang Y, Lee YH, Horst A, Wang ZP, Chen DR, et al. Comparative eco-toxicities of nano-ZnO particles under aquatic and aerosol exposure modes. Environmental Science and Technology. 2010; 44: 1484- 9.

(25)  Wang H, Wick RL, Xing B. Toxicity of nanoparticulate and bulk ZnO AL2O3 and TiO2 to the nematode Caenorhabditis elegans. Environmental Pollution. 2009; 157 (4): 1171- 7.

(26)  Scheckel KG, Luxton TP, El-Badawy AM, Impellitteri CA, Tolaymat TM. Synchrotron speciation of silver and zinc oxide nanoparticles aged in a kaolin suspension. Environmental Science and Technology. 2010; 44 (4): 1307- 12.

(27)   Fred CT. Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. American Journal of Medicine. 2006; 119 (6A): S3- S10.

(28)  Choudhury R, Srivastava S. Zinc resistance mechanisms in bacteria. Current Science. 2001; 81(7): 7- 10.