بررسی و خالص‏سازی نسبی آنزیم (های) مؤثر در احیای تلوریت از باکتری نمک دوست Salinicoccus iranensis

نویسندگان

1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران

2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران

3 استاد بیوشیمی، دانشگاه تربیت مدرس، ایران

چکیده

مقدمه: امروزه‏ استفاده‏ بیش‏ از حد از تلوریت، محیط را متحمل اثرات سمی ناشی از این اکسی‏آنیون کرده است. از این رو تیمار زیستی مناطق آلوده، به عنوان روشی ارزان و سازگار با محیط زیست، مطرح است. اگرچه اثرات سمی تلوریت برای بیشتر میکروارگانیسم‏ها گزارش شده ولی گونه‏های مختلفی از باکتری‏ها، از جمله باکتری نمک دوست مورد استفاده در این پروژه می‏تواند بر سمیت آن با احیای این اکسی‏آنیون‏ به شکل عنصریش غلبه کند. هدف این مطالعه، شناسایی مسیر آنزیمی به سم‏زدایی تلوریت بود‏‏.
مواد و روش‏‏ها: در ابتدا به منظور بالا بردن فعالیت آنزیمی و از دست ندادن آن طی فرآیند‏ خالص‏سازی، بهینه‏سازی آزمون مناسب برای بررسی فعالیت آنزیمی و شرایط تولید آن انجام شد. بهینه‏سازی با "روش یک عامل‏ در هر زمان" انجام شد. عامل‏های مختلفی از جمله: زمان، درصدهای مختلف مایه‏تلقیح، اسیدیته‏، غلظت‏های مختلف تلوریت و نمک‏های مختلف بهینه شد. به‏منظور اطمینان در طی پژوهش میزان حذف تلوریت نیز بررسی شد. خالص‏سازی آنزیم مورد نظر با روش‏های مختلف مانند، رسوب با آمونیوم سولفات[i] و کروماتوگرافی ستونی میان‏کنش هیدروفوب[ii] با غلظت 4/1 مولار اشباع آمونیوم سولفات انجام شد. خلوص آنزیم در طی هر مرحله با
SDS-PAGE بررسی شد.
نتایج: شرایط بهینه‏ به‏دست آمده نشان داد که در زمان 30 ساعت، 3 درصد مایه‏تلقیح، اسیدیته‏ 5/7، بدون حضور تلوریت و در 5 درصد نمک NaCl، بالاترین میزان فعالیت آنزیم و حذف تلوریت مشاهده می‏شود. خالص‏سازی آنزیم به میزان زیادی پروتئین‏های غیرمرتبط را کاهش داد و تغلیظ یکی از باندها که زیرواحدی از آنزیم مورد هدف بود، را باعث شد. در بخش پروتئینی به طور نسبی خالص‏شده، نشان داده شد که علاوه بر فعالیت تلوریت ردوکتازی، فعالیت سلنیت و نیترات ردوکتازی نیز در این بخش وجود دارد.
بحث و نتیجه‏گیری: این پژوهش، در مسیر شناسایی بیشتر فیزیولوژی میکروارگانیسم‏های‏ هالوفیل و بررسی آنزیم دخیل در احیای تلوریت گام برداشته و آنزیم مسوول را در باکتری مربوطه بهینه‏ و تا حدی خالص‏سازی کرده است.


 

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Investigation and Partial Purification of Tellurite Reducing Enzyme from a Moderately Halophilic Bacterium Salinicoccus iranensis

نویسندگان [English]

  • Sana Alavi 1
  • Mohammad Ali Amoozegar 2
  • Khosro Khajeh 3
1 M.Sc. of Microbiology, Extremophiles Laboratory, University of Tehran, Iran
2 Associate Professor of Microbiology, University of Tehran, Iran
3 Professor of Biochemistry, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: Excessive use of tellurite nowadays, has suffered the environment from the toxic effects of the oxyanion. Hence, biological treatment of polluted areas is considered as an environmentally friendly and inexpensive method. Although the toxic effects of tellurite for most microorganisms have been reported, but several species of the bacteria including the halophilic bacteria used in this project can overcome the toxicity of the oxyanion by its reduction to the elemental form. The aim of this study was to identify the mechanism (s) involved in tellurite detoxification.
Materials and methods: In order to enhance and maintain enzymatic activity during purification, the test conditions and enzyme production by the strain were optimized. The optimization was done by One Factor at A Time (OFAT) method. Several factors, including: time, various percentages of inoculum, range of pH, concentration of tellurite and various salts effects were optimized. For assurance tellurite removal was examined during the experiment. The enzyme was purified by various methods, including ammonium sulphate precipitation and hydrophobic interaction column chromatography in which the Concentration of 1.4 M saturated ammonium sulphate was applied. The purity of the enzyme was assessed by SDS-PAGE during each phase.
Results: The optimum conditions obtained showed that at 30 hours, 3% inoculum, pH 7.5, without tellurite and with 5% NaCl the highest enzyme activity and tellurite removal are observed. Purification of the enzyme greatly reduced the concentration of unrelated proteins and caused a concentrated band which could be one subunit of the enzyme targeted. The partially purified enzyme’s fraction was shown to have nitrate and selenite reductase activity other than tellurite reductase activity.
Discussion and conclusion: This study is an approach to the identification of the halophilic microorganisms Physiology and enzymes involved in restoring tellurite. The production of the enzyme responsible for this phenomenon has been optimized and partially purified.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Tellurite
  • Halophile
  • Salinicoccus

مقدمه

در دهه‏های اخیر کاربردهای زیاد تلوریت در کارخانه‏های باطری‏سازی، الکترونیک، فیبرنوری و معادن افزایش یافته و به آلودگی‏های زیاد زیست‏محیطی تلوریت منجر شده است. تلوریوم و سلنیوم نسبت به آنالوگ‏ خود، سولفور، ترکیبات مشابهی ایجاد می‏کنند ولی خواص و واکنش‏های متفاوتی را از خود بروز می‏دهند و به طور در خور توجهی سمیت بیشتری دارند (1). عامل‏های مقاومت به تلوریت زیادی در کروموزوم یا پلاسمید برخی گونه‏های باکتریایی مشاهده شده است (2 و 3). در کل این عامل‏ها، عامل مقاومت به تلوریت با مکانیسمی ناشناخته هستند.

میکروارگانیسم‏ها راهکارهای مختلفی برای سمیت‏زدایی فلزات و شبه‏فلزات دارند ولی همگی آن‏ها در دو فرآیند‏ کلی جای می‏گیرند:

  1.  میکروارگانیسم‏ها غلظت آن‏ها را در محیط با اتصال سلولی که به آن تجمع زیستی[1] هم می‏گویند، کاهش می‏دهد.
  2. مکانیسم دوم وابسته به متابولیسم سلولی برای تغییر فلز سمی از شکل محلول به نامحلول است.

فرآیند‏ تجمع زیستی غیرفعال است زیرا این فرآیند به تمایل به اتصال بستگی دارد. این در حالی است که فعالیت‏های متابولیکی فعال و وابسته به انرژی سلول است (4).

تاکنون در زمینه‏ شناسایی عوامل مؤثر در احیای تلوریت کوشش‏های اندکی انجام شده است که می‏توان از فعالیت تلوریت ردوکتازی نیترات ردوکتازها (5)، مشارکت گلوتاتیون احیا در تشکیل Se0 و Te0(6)، سطوح بالای فعالیت تلوریت وابسته به FADH2 در بخش غشایی (7)، سیتوکروم‏های c در غشای خارجی (8) و گزارشی از خالص‏سازی پروتئینی با فعالیت تلوریت ردوکتازی نام برد (9).

نمک دوست‏ها، میکروارگانیسم‏های نیازمند به نمک هستند که در محیط‏های با نمک بالا زندگی می‏کنند. آن‏ها به طور کلی شامل میکروارگانیسم‏های پروکاریوتی و یوکاریوتی با توانایی متعادل‏سازی فشاراسمزی با محیط بیرون و مقاومت در برابر اثرات واسرشت‏کننده‏ نمک‏ها مانند تجمع با هم پروتئین‏ها هستند. این گروه میکروارگانیسم‏ها، از تنوع بالایی برخوردارند. بسته به غلظت نمک مورد نیاز برای رشد، آن‏ها را به
تحمل‏کننده‏ نمک (صفر تا 5 درصد ‏سدیم کلرید)، نمک دوست ضعیف (2 تا 5 درصدسدیم کلرید)، نمک دوست نسبی (5 تا 20درصدسدیم کلرید)، و نمک دوست افراطی (20 تا 30درصدسدیم کلرید)، تقسیم‏بندی می‏کنند. میکروارگانیسم‏های نمک‏دوست نسبی از نظر فیزیولوژی متنوع و دارای جنس‏های مختلفی هستند (10).

در مقایسه با دیگر گروه‏های اکستریموفیل (ترموفیل‏ها و آلکالوفیل‏ها) که به طور گسترده در صنعت استفاده می‏شوند، کاربرد‏های بیوتکنولوژیک زیاد میکروارگانیسم‏های نمک دوست نسبی و افراطی، معمولاً نادیده گرفته ‏شده‏ است. این نادیده گرفته شدن به ویژه وقتی تنوع گسترده نمک دوست‏ها را در نظر بگیریم، بیش‏تر مشهود است. این دسته از موجودات در هر سه قلمرو آرکیا، باکتری‏ها و یوکاریوت‏ها یافت می‏شوند. آن‏ها شامل اعضایی با فیزیولوژی متنوع‏اند که آن‏ها را قادر می‏سازد با گستره‏ وسیعی از غلظت‏های نمک تا حد اشباع، سازش پیدا کنند. از دیگر مزایای احیا توسط میکروارگانیسم‏ها این است که احیای اکسی‏آنیون‏های به‏دست آمده به شکل نانوذره بوده و اهمیت این نانوذرات رو به افزایش است. ترکیبات در مقیاس نانو تلوریوم (Te0) مثل CdTe پتانسیل بالایی در استفاده به عنوان مواد اولیه‏ سلول‏های خورشیدی دارند و امروزه مطالعه و بررسی‏های زیادی روی آن‏ها انجام می‏شود (11).

از آنجا‏ که بعضی ارگانیسم‏های نمک دوست در درون سلول نیز با استرس اسمزی مقابله می‏کنند، مقایسه‏ آنزیم‏های مشابه در ارگانیسم‏های غیرنمک دوست و نمک دوست‏‏، اهمیت زیادی دارد. به هر حال عامل این تفاوت هر چه که هست به طور آشکارا اهمیت بنیادی در درک نوع زندگی نمک دوست‏ها دارد. پروتئین‏های نمک دوست برای فعال، پایدار و محلول بودن در نمک بالا با چالش‏های بسیاری روبه‏رو هستند. غلظت‏های در حد مولار نمک معمولاً برای پروتئین‏ها و دیگر ماکرومولکول‏ها مخرب است. این امر باعث تخریب ساختار سوم و تجمع آن‏ها به خاطر افزایش میان‏کنش‏های هیدروفوب می‏شود و با میان‏کنش‏های الکتروستاتیک تداخل ایجاد می‏کند. اگرچه برخی اوقات این سازگاری‏ها باعث می‏شود تا ماکرومولکول‏ها به طور مطلق برای حفظ یکپارچگی ساختار خود وابسته به نمک بالا باشند (12).

از آنجا‏ که سم‏زدایی شیمیایی مناطق آلوده به فلزات سمی، گران است و محیط را متحمل اثرات جانبی ناشی از مصرف این مواد می‏کند، تیمار زیستی این مناطق به عنوان روشی سازگار با محیط زیست و کاهش‏دهنده‏ هزینه‏ها، مطرح است. نیاز ذاتی میکروارگانیسم‏های نمک دوست به نمک‏ و از سوی دیگر همراهی اکسی‏آنیون‏ها با کاتیون‏هایی که نیاز میکروارگانیسم نمک‏دوست را مرتفع می‏کند، این میکروارگانیسم‏ها را نسبت به همتایان غیرنمک دوست خود در زمینه تحمل و حذف تلوریت تواناتر می‏سازد. پتانسیل بالای میکروارگانیسم‏های نمک دوست در تحمل غلظت‏های بالای فلزات سمی چون سلنیوم و تلوریوم و توانایی تیمار زیستی این عناصر در محیط‏های نمکی و پساب‏های پرنمک، این میکروارگانیسم‏ها را به عنوان کاندیدی مناسب بدین منظور مطرح می‏کند (13).

Salinicoccus iranensis QW6یک باکتری کوکوس گرم مثبت، غیراسپورزا، فاقد حرکت و هوازی با توانایی تولید اکسیداز و کاتالاز است. کلونی‏های آن گرد و صاف بوده و پیگمان قرمز- نارنجی تولید می‏کند. شرایط بهینه‏ رشد برای این میکروارگانیسم بدین شکل به‏دست آمده است (14 و 17):

محدوده نمک (NaCl): ‏1 تا 25 درصد / بهینه: 5/7 تا10 درصد‏

محدوده‏ اسیدیته: 6/5 تا 10 / بهینه: 5/7

محدوده‏ دما: 5 تا 45 / بهینه: 34 درجه‏ سانتی‏گراد‏

MIC برای تلوریت: 12 میلی‏مولار

 

احیای نیترات: مثبت

با توجه به اطلاعات به دست آمده تا کنون هیچ گزارشی از بررسی مکانیسم‏‏های دخیل در احیای تلوریت توسط باکتری‏های نمک دوست انجام نشده است. هدف از این پژوهش، بررسی مسیر یا مسیرهایی است که میکروارگانیسم در راستای مقابله با این اکسی‏آنیون سمی اتخاذ می‏کند. آنزیم به طور نسبی خالص شده در این تحقیق قادر به احیای تلوریت، سلنیت و نیترات بود.

مواد و روش‏ها

مواد شیمیایی

پتاسیم تلوریت، سدیم سلنیت 5آبه، سدیم کلراید، پتاسیم کلراید، منیزیوم کلراید، آمونیوم سولفات، تریپتون، عصاره‏ مخمر و بتا-مرکاپتواتانول از شرکت مرک (درمشتات، آلمان) [2]; سفادکسG-100، لیزوزیم، Tris–HCl، PMSF (فنیل‏متیل‏سولفونیل‏فلوراید[3])، NADH 4 آبه، کوماسی برلیانت بلو، دکستران بلو و دی‏اتیل دی‏تیو‏کربامات[4] از شرکت سیگما (سنت لوییس، آمریکا) [5]; فنیل سفارز و Q- سفارز از شرکت بیوتکنولوژی فارمیشیا[6] و سدیم کلراید از شرکت ایرانی دکتر مجللی[7] تهیه شد.

کشت و رشد میکروارگانیسم

سویه ‏Salinicoccus iranensis QW6 پیش‏تر توسط آموزگار و همکاران[8] از قم جداسازی و شناسایی شده بود (14). این باکتری کوکوس گرم مثبت، ‏هوازی و فاقد تحرک بوده و قابلیت احیای تلوریت و سلنیت را داراست. این باکتری از مرکز ملی ذخایر ژنتیک ایران[9] با شماره‏ی سویه IBRC-10198 دریافت و با دو روش کشت در محیط شیب‏دار، با گلیسرول و نیز به شکل لیوفیلیزه نگهداری شد.

 برای کشت باکتری Salinicoccus از محیط لوریا برتانی (LB) با غلظت سدیم کلراید 5درصدواسیدیته‏ 5/7 به عنوان محیط پایه استفاده ‏شد. محیط‏های مایع در انکوباتور شیکردار با دور rpm 150 و در دمای 34 درجه‏ سانتی‏گراد‏ گرماگذاری ‏شدند. محیط‏های کشت پایه پس از تهیه، با حجم 20 میلی لیتر در در فلاسک‏های ارلن مایر 100 توزیع و اتوکلاو شدند. محلول…های اکسی‏آنیون‏ها به شکل جداگانه با فیلتر استریل و به محیط پایه پیش از تلقیح افزوده شدند. در این روش میزان جذب نوری سوسپانسیون باکتری در طول موج 620 نانومتر در برابر محیط کشت تلقیح نشده به ‏عنوان شاهد در دستگاه UV-vis اسپکتروفوتومتر[10] خوانده شد. در مواردی که وجود عامل تداخل‏کننده مانع این نوع سنجش می‏شد، از غلظت پروتئین به منظور بررسی میزان بیوماس استفاده ‏شد.

بررسی میزان رشد باکتری

برای این منظور از تک کلونی خالص باکتری که روی محیط کشت جامد LB حاوی 5 درصد نمک طعام رشد کرده بود (کشت 48 ساعته)، سوسپانسیون میکروبی معادل کدورت 5/0 مک فارلند تهیه شد و به میزان یک درصد حجم محیط پایه به آن تلقیح و گرماگذاری شد. منحنی رشد مربوط به میکروارگانیسم ترسیم شد تا زمان مناسب (فاز سکون) برای تلقیح از این محیط به محیط پیش‏کشت تعیین شود. سپس، از باکتری‏هایی که به فاز سکون رسیده‏اند به منظور تلقیح به محیط پیش‏کشت به میزان 5 درصد حجمی استفاده شد. پس از رسیدن به دانسیته‏ نوری برابر با 5/1[11] از این محیط به عنوان پیش‏کشت برای تلقیح به محیط‏های اصلی استفاده ‏شد. با رسم منحنی رشد، از آن برای تعیین ساعت مناسب برای تلقیح محیط پیش‏کشت به محیط پایه‏ تولید، در هنگام بررسی اثر عامل‏های مختلف روی رشد سویه، فعالیت آنزیم و حذف تلوریت استفاده شد (13). تمام آزمایش‏ها در سه بار تکرار به طور هم‏زمان انجام شدند.

سنجش مقدار پروتئین و تلوریت

برای سنجش مقدار پروتئین از روش برادفورد و با استفاده از آلبومین سرم گاوی[12] به عنوان استاندارد، استفاده شد (14). برای بررسی میزان حذف اکسی‏آنیون تلوریت از معرف دی‏اتیل‏دی‏تیوکربامات استفاده شد. روش‏کار بدین طریق بود که 300 میکرولیتر از بافر 500 میلی­مولار Tris-HCl, pH 7 و 100 میکرولیتر از معرف دی‏اتیل ‏دی‏تیوکربامات (10 میلی‏مولار) و 100 میکرولیتر از نمونه‏ مورد سنجش با یکدیگر مخلوط شده و جذب آن در طول موج340 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر سنجیده شد. شاهد شامل: 300 میکرولیتر بافر، 100 میکرولیتر معرف، 100 میکرولیتر ازمحیط کشت بدون تلوریت بود (15).

رسم منحنی رشد و بررسی میزان حذف تلوریت Salinicoccus iranensis در حضور غلظت‏های مختلف تلوریت

از محیط پیش‏کشت تهیه شده به منظور تلقیح به محیط‏های حاوی اکسی‏آنیون با غلظت‏های مختلف تلوریت استفاده شد. میزان رشد میکروارگانیسم با سنجش غلظت پروتئین بررسی شد. علت استفاده از این روش پراکنش نور توسط اسپکنروفوتومتر برای تولید ذرات تلوریوم طی رشد میکروارگانیسم بود. بدین منظور در طول مراحل رشد باکتری‏ به میزان 5/0 میلی‏لیتر از محیط کشت در شرایط استریل برداشت شده و در دور g×11000 به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه‏ی سانتی‏گراد‏ سانتریفیوژ ‏شد. محلول رویی به منظور بررسی میزان حذف تلوریت، بررسی شد. رسوب باکتریایی یک‏بار با آب نمک درصد ‏5 شستشو داده شده و سپس، 500 میکرولیتر از سود 1/0 نرمال به آن اضافه شده، 1 ساعت در دمای 96 درجه قرار گرفت. بار دیگر نمونه‏ها با دور g× 13000 اسپین شده و غلظت پروتئین‏ در مایع رویی با استفاده از روش برادفورد[13] سنجیده شد (16 و 17).


آماده‏سازی عصاره‏ی سلولی

برای این منظور ابتدا کشت‏های میکربی طبق شرایط بهینه کشت داده شده و سپس، برای حذف سلول‏ها و دیگر مواد جامد محیط، در دور g× 4000 در دمای
 4 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شدند. رسوب حاصل 2بار با آب نمک 5 درصد شستشو داده ‏شده و در بافر لیز (Tris-HCl  50 میلی مولار،, 1mM PMSF) به حالت سوسپانسیون درآمدند. عمل سونیکاسیون در 10 مرحله 30 ثانیه‏ای با 1 دقیقه فاصله بین مراحل انجام شد. باکتری سونیکت شده با دور
 g× 14000 در دمای 4 درجه‏ی سانتی‏گراد‏ به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. خروجی 5/0 و شدت 60 درصد برای دستگاه سونیکاتور تنظیم شد. محلول رویی به عنوان عصاره‏ سلول با دور g× 13500 و به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ و از بقایای سلولی و سلول‏های شکسته نشده جدا شد (18).

سنجش فعالیت آنزیمی

فعالیت آنزیمی به روش سینیتیکی و از طریق بررسی کاهش میزان جذب NADH در طول موج 340 نانومتر تعیین شد. بدین منظور دستگاه اسپکتروفتومتر در حالت[14]Rate (Kinetic)، 340 نانومتر و زمان 1 دقیقه تنظیم شد. برای تعیین فعالیت تلوریت ردوکتازی، 470 میکرولیتر بافر 50 میلی­مولار (Tris-HCl, pH 8) حاوی تلوریت سدیم و سلنیت سدیم هریک 6 میلی­مولار، 25 میکرولیتر نمونه حاوی آنزیم و 5 میکرولیتر NADH (10 میلی­مولار) در کووت ریخته شد. تمامی مواد در بافر 50 میلی­مولار (Tris-HCl, pH 8) حل ‏شد. تعیین فعالیت در دمای محیط انجام ‏شد. به محض افزودن NADH به محتویات سل، تغییرات جذب بررسی شد (19).

بهبود روش‏های کشت و شرایط رشد برای حذف بیش‏تر تلوریت و تولید بیش‏تر آنزیم

برای بهبود تولید آنزیم، اثر عوامل مختلف روی رشد سویه QW6، تولید آنزیم و میزان حذف، بررسی و گزارش شد. از روش یک عامل در هر زمان[15]به منظور بهینه‏سازی استفاده شد. به این شکل که در هر مرحله فقط اثر یک عامل بررسی شده و تمام عوامل دیگر به شکل ثابت در نظر گرفته شدند. مقدار بهینه‏ به دست آمده برای هر عامل، به منظور بررسی عامل بعدی اعمال شد. اسیدیته‏ همه محیط‏های کشت قبل از سترون‏سازی تنظیم شد.

اثر زمان

برای بررسی اثر زمان روی رشد، تولید آنزیم و میزان حذف، از محیط پیش کشت، به محیط‏های پایه آماده با شرایط بهینه تلقیح انجام شد و در شیکر انکوباتور 34 درجه سانتی‏گراد‏ با دور rpm  150 گرماگذاری شد. در طی 84 ساعت، هر 6 ساعت سه ارلن به شکل جدا، برای بررسی رشد، تولید آنزیم و میزان حذف تحلیل‏ شد. مقدار بهینه به دست آمده در این مرحله، در مراحل بعدی اعمال شد.

اثر حجم مایه‏تلقیح

برای بررسی اثر مایه‏تلقیح رشد، تولید آنزیم و میزان حذف، از محیط پیش کشت با مقادیر 1، 2‏، 4‏، 6‏، 8 و10 درصد‏ به محیط‏های پایه آماده با شرایط بهینه، تلقیح انجام شد و در شیکر انکوباتور در34 درجه سانتی‏گراد‏ با دور rpm  150 گرماگذاری شد. مقدار بهینه به دست آمده در این مرحله، در مراحل بعدی اعمال شد.

اثر غلظت‏های مختلف تلوریت

برای بررسی اثر غلظت‏های مختلف تلوریت بر رشد، تولید آنزیم و میزان حذف، از محیط پیش‏کشت به محیط‏های پایه‏ آماده با شرایط بهینه حاوی 1/0، 25/0، 5/0، 75/0 و 1 میلی‏مولار تلوریت، تلقیح انجام شد و در شیکر انکوباتور در34 درجه سانتی‏گراد‏ با دور
rpm  150 گرماگذاری شد. مقدار بهینه به دست آمده در این مرحله، در مراحل بعدی اعمال شد.

اثر اسیدیته‏

برای دستیابی به اسیدیته‏ بهینه برای رشد، تولید آنزیم و میزان حذف، از محیط پیش کشت به میزان مناسب به محیط‏های پایه آماده شده با شرایط بهینه و بااسیدیته‏های 5/7، 8، 5/8، 9، 5/9 و 10 تلقیح انجام شد و در شیکر انکوباتور در34 درجه سانتی‏گراد‏ با دور rpm  150 گرماگذاری شد. برای تأمین شرایط ثابت اسیدیته‏ در محیط کشت، از بافرهای استاندارد فسفات، تریس و گلایسین با غلظت 50 میلی­مولار به شکل مخلوط استفاده شد. به این شکل که بافرها جایگزین آب مقطر در ترکیب محیط کشت پایه شدند. مقدار بهینه‏ به دست آمده در این مرحله، در مراحل بعدی اعمال شد.

از آنجا که میکروارگانیسم مورد آزمون یک نمک‏دوست بوده و این میکرو ارگانیسم‏ها بیشتر وابستگی به یون سدیمی و در برخی موارد یون کلرایدی از خود نشان می‏دهند، تأثیر این یون‏ها بر حذف تلوریت و فعالیت آنزیمی بررسی شد.

اثر نمک‏های کلرایدی

برای بررسی اثر نمک‏های سدیم کلراید، پتاسیم کلراید و منیزیوم کلراید بر روی رشد، تولید آنزیم و میزان حذف، از محیط پیش کشت به میزان مناسب به محیط‏های پایه آماده با شرایط بهینه و غلظت‏های 1‏، 5‏، 10 و 15 درصد ‏از نمک که جایگزین نمک اصلی در محیط کشت شده بود، تلقیح انجام شد و در شیکر‏انکوباتور در34 درجه سانتی‏گراد‏ با دور rpm  150 گرماگذاری شد. مقدار بهینه‏ به‏دست‏آمده‏ نمک‏ها در این آزمایش در آزمایشی مجزا با یکدیگر مقایسه شدند.

 

اثر نمک‏های سدیمی

برای بررسی این عوامل بر رشد، تولید آنزیم و میزان حذف، از محیط پیش کشت به میزان مناسب به محیط‏های پایه دارای نمک‏های سدیم نیترات، دی‏سدیم‏سولفات و سدیم‏استات با غلظت‏های 1 تا 25 درصد تلقیح انجام شد و در شیکر انکوباتور در34 درجه سانتی‏گراد‏ با دور rpm  150 گرماگذاری شد.

خالص‏سازی نسبی آنزیم

به منظور خالص‏سازی پروتئین در نخستین مرحله از آمونیوم سولفات برای بخش‏بندی[16] پروتئین‏ها استفاده شد. به عصاره‏ سلولی تا 60 درصد اشباع آمونیوم سولفات اضافه شد. بدین وسیله بخشی از پروتئین‏ها از رسوب به وسیله‏ی سانتریفوژ g× 11500 به مدت 10 دقیقه جدا شدند. رسوب حاصل در حداقل مقدار بافر Tris- HCl pH 8  50 میلی­مولار، حاوی 4/1 مولار آمونیوم سولفات (بافر A) حل شده و علیه همین بافر به مدت 12 ساعت و با تعویض بافر هر 4 ساعت دیالیز شد. نمونه‏ی دیالیز شده بر روی ستون فنیل سفارزی که از قبل با بافر 50 میلی­مولار Tris- HCl pH 8  حاوی 4/1 مولار آمونیوم سولفات به تعادل رسیده و به دستگاه [17]FPLC)AKTA Prime, Amersham) متصل بود، بارگذاری شد. پس از شستشوی ستون، پروتئین‏های متصل شده با گرادیان خطی صفر تا 2 مولار آمونیوم سولفات تهیه شده در بافر Tris-HCl, pH 8  50 میلی‏مولار (بافرB) شسته شدند. در هنگام کروماتوگرافی جریان 1 میلی‏لیتر در دقیقه برقرار بود. تنها در هنگام تزریق نمونه به 5/0 میلی‏لیتر در دقیقه کاهش داده می‏شد. بخش‏های 2 میلی‏لیتری از ستون جمع‏آوری و آزمون‏‏ آنزیمی بر روی آن‏ها انجام می‏شد. به منظور اطمینان نمونه‏های مربوط به هر پیک جمع‏آوری و با سیستم اولترافیلتراسیون دارای منافذ 10 کیلو دالتونی (آمیکون[18]، میلی‏پور[19]) تغلیظ و سپس، فعالیت آنزیمی مربوطه بررسی شد.

الکتروفورز سدیم دو دسیل سولفات- پلی‏اکریل آمید ژل[20]

الکتروفورز پروتئین‏ها با روش تغییر یافته‏ی لاملی انجام شد. بدین شکل که از غلظت 5 درصد اکریل آمید برای ژل توده‏کننده و از 5/12 درصد ‏اکریل آمید برای ژل جداکننده استفاده شد. نمونه‏ها با جوشانده شدن در (w/v)1 درصد ‏SDS در حضور 2- مرکاپتواتانول آماده شدند (20).

تجزیه و تحلیل داده‏ها

برای مقایسه بین شرایط بهینه‏ مختلف و نیز تعیین اختلاف معنی‏دار بین آن‏ها در سطح احتمال
(P value <0.05) از تحلیل واریانس یک طرفه ANOVA[21] و آزمون چند دامنه‏ای دانکن[22] استفاده شد. تمام تحلیل‏های آماری با استفاده از نرم افزار SPSS (ویرایش 19) [23] و ترسیم نمودارها با استفاده از نرم افزار Excel 2010 در محیط ویندوز انجام شد.

 

نتایج

رسم منحنی رشد و حذف تلوریت

شکل 1 و 2 منحنی‏های رشد سویه و حذف اکسی‏آنیون تلوریت در طی 84 ساعت گرماگذاری را نشان می‏دهد. میانگین غلظت‏های پروتئین و حذف اکسی‏آنیون به‏دست آمده از سه تکرار برای هر بار سنجش نشان‏دهنده حذف بیش‏تر و رشد بالاتر میکروارگانیسم در غلظت‏های پایین‏تر تلوریت بود. سریع‏ترین حذف در غلظت 5/0 میلی‏مولار تلوریت مشاهده شد.

اثر عوامل فیزیکوشیمیایی بر رشد و فعالیت آنزیم

 اثر زمان بر روی رشد و فعالیت آنزیم

شکل 3 و 4 نشان‏گر رشد و تولید آنزیم در زمان‏های مختلف است. بیش‏ترین تولید در زمان 30 ساعت معادل U/mg 0165/0 دیده شد. نتایج حاصل بیا‏نگر آن است که بین میزان تولید آنزیم در زمان‏های 24 تا 33 ساعت تفاوت معنی‏داری وجود نداشت. تولید آنزیم و حذف تلوریت نیز با میزان بیوماس هم‏خوانی دارد.

 

 

 

شکل1- منحنی‏های رشد در حضور غلظت‏های مختلف تلوریت. تلقیح در محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد‏ نمک سدیم کلراید (اسیدیته 5/7) انجام شد. نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است.

 

 

شکل2- منحنی‏های حذف تلوریت در حضور غلظت‏های مختلف تلوریت. تلقیح در محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید (اسیدیته‏ 5/7) انجام شد. نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است.

 

a

 

a

 

a

 

b

 

b

 

bc

 

cd

 

 

 

 

 

e

 

e

شکل3- اثر زمان بر فعالیت آنزیمو رشددر محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 5/0 میلی‏مولار تلوریت (اسیدیته‏ 5/7). نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است. مقادیر نشان‏گذاری شده با حروف لاتین مختلف دارای اختلاف معنی‏دار (Pvalue<0.05) هستند.

 

 

Growth Curve

&

Tellurite Removal

 

Optimization

شکل4- اثر زمان برحذف تلوریت و رشددر محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 5/0 میلی‏مولار تلوریت (اسیدیته‏ 5/7). نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است.

 


اثر حجم مایه تلقیح[24] بر فعالیت آنزیم، رشد و حذف تلوریت

میزان رشد و فعالیت آنزیم و حذف تلوریت با مقادیر مایه تلقیح متفاوت درشکل‏های 5 و 6 نشان‏داده شده‏است. بین فعالیت آنزیمی مشاهده شده در محیط‏های با درصدهای متفاوت مایه تلقیح‏ تفاوت معنی‏داری دیده نشد (بین 1 و 10 درصد ‏تفاوت معنی‏دار بود). فعالیت آنزیمی و حذف تلوریت در این محیط‏ها نیز با میزان بیوماس هم‏خوانی دارد.

 

 

a

 

ab

 

ab

 

ab

 

ab

 

b

شکل5- اثر حجم مایه تلقیح بر فعالیت آنزیم و رشدسویه QW6 در زمان 30 ساعت در محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 5/0 میلی‏مولار تلوریت (اسیدیته‏5/7). نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است. مقادیر نشان‏گذاری شده با حروف لاتین مختلف دارای اختلاف معنی‏دار (Pvalue<0.05) هستند.

 

 

شکل6- اثر حجم مایه تلقیح بر حذف تلوریت و رشدسویه‏ QW6 در زمان 30 ساعت در محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 5/0 میلی‏مولار تلوریت (اسیدیته 5/7) نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است. مقادیر نشان‏گذاری شده با حروف لاتین مختلف دارای اختلاف معنی‏دار (Pvalue<0.05) هستند.

 

a

 

 

a

 

b

 

c

 

c

 

شکل7- اثر غلظت‏های مختلف تلوریت بر رشد و فعالیت آنزیمدر زمان 30 ساعت در محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 5/0 میلی‏مولار تلوریت با 2 درصد مایه تلقیح (اسیدیته‏ 5/7) نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است. مقادیر نشان‏گذاری شده با حروف لاتین مختلف دارای اختلاف معنی‏دار (P value <0.05) هستند.

 

 

شکل8- اثر غلظت‏های مختلف تلوریت بر حذف تلوریت و رشد در زمان 30 ساعت در محیط پایه حاوی (w/v)5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 5/0 میلی‏مولار تلوریت با 2 درصد مایه تلقیح (اسیدیته 5/7) نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است.


اثر غلظت‏های مختلف تلوریت بر رشد، تولید آنزیم و حذف تلوریت

نتایج رشد و فعالیت آنزیم و حذف تلوریت در حضور غلظت‏های مختلف تلوریت محلول در شکل‏های 7 و 8 نشان داده شده‏است. بیش‏ترین فعالیت آنزیم U/mg 0265/0 در غلظت 1/0 میلی‏مولار تلوریت به دست آمد. با افزایش غلظت میزان تولید بیوماس و فعالیت آنزیم کاهش نشان می‏دهد. میزان فعالیت آنزیم در 1/0 میلی‏مولار و 25/0 تلوریت تفاوت معنی‏داری مشاهده نشد. حذف تلوریت نیز با میزان بیوماس هم‏خوانی دارد.

اثر اسیدیته‏ بر فعالیت آنزیم، رشد و حذف تلوریت

نتایج حاصل از از اثرات اسیدیته‏ اولیه محیط‏کشت تولید، بر میزان رشد، حذف تلوریت و فعالیت آنزیم در شکل 9 و 10 نشان داده شده است. طبق شکل، بیش‏ترین فعالیت ردوکتازی معادل U/mg 0303/0 در8  pH‏ مشاهده شد. بررسی فعالیت آنزیم در اسیدیته‏های مختلف گویای آن است که تفاوت معنی‏داری بین اسیدیته‏های 5/7 تا 9 وجود نداشته و در اسیدیته‏ 10 فاقد رشد قابل ملاحظه به منظور بررسی فعالیت آنزیم بود. همچنین، سویه در اسیدیته‏های اسیدی 6 نیز رشد ضعیفی را نشان می‏داد ولی به این علت که تلوریت در اسیدیته‏ کمتر از 5/7 در بافر مخلوط مورد استفاده حلالیت کمی داشت، رشد و فعالیت در اسیدیته‏‏های اسیدی بررسی نشد. در اسیدیته 5/7 حذف تلوریت به شکل معنی‏دار از اسیدیته‏های دیگر بالاتر بود.

 

 

a

 

b

 

bc

 

bc

 

bc

 

c

شکل9- اثر اسیدیته‏ بر فعالیت آنزیم و میزان رشد در زمان 30 ساعت در محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 1/0 میلی‏مولار تلوریت با 2 درصد مایه تلقیح (اسیدیته‏ 5/7). نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است. مقادیر نشان‏گذاری شده با حروف لاتین مختلف دارای اختلاف معنی‏دار (P value <0.05) هستند.

 

c

 

bc

 

ab

 

ab

 

a

 

ab

شکل10- اثر اسیدیته‏ برحذف تلوریت و میزان رشد در زمان 30 ساعت در محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 1/0 میلی‏مولار تلوریت با 2 درصد مایه تلقیح (اسیدیته‏ 5/7).نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است. مقادیر نشان‏گذاری شده با حروف لاتین مختلف دارای اختلاف معنی‏دار (P value <0.05) هستند.


اثرنمک‏های کلرایدی

شکل11 نتایج تاثیر غلظت‏های مختلف نمک جایگزین بر روی رشد و فعالیت آنزیم را نشان می‏دهد. بیش‏ترین میزان تولید در غلظت 5 درصد NaCl و معادل U/mg 029/0، 5 درصدMgCl2و معادل U/mg 054/0 و در غلظت 5 درصد KCl و معادل U/mg 030/0 سنجیده شده است. میزان تولید بیوماس نیز با میزان فعالیت آنزیم هم‏خوانی دارد.

 

 

a

 

c

 

b

 

a

 

a

 

c

 

b

 

b

 

b

 

c

 

ab

 

a

شکل11- اثر غلظت‏های مختلف سدیم کلراید، منیزیوم کلراید، پتاسیم کلراید بر تولید آنزیم و رشد در محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد ‏نمک سدیم کلراید حاوی 1/0 میلی‏مولار تلوریت با 2 درصد مایه تلقیح (اسیدیته‏5/7). مقادیر نشان‏گذاری شده با حروف لاتین مختلف دارای اختلاف معنی‏دار (P value <0.05) هستند.


مقایسه‏ اثر سدیم کلراید، پتاسیم کلراید، منیزیوم کلراید بهینه

باکتری Salinicoccus iranensis QW6 در نبود یون سدیم نیز به خوبی قادر به رشد است. نتایج اثر غلظت‏های مختلفMgCl2، NaCl وKCl روی رشد و فعالیت آنزیم در شکل 12 نشان داده شده است.
همان‏طور که مشاهده می‏شود، بیش‏ترین میزان فعالیت آنزیمU/mg 04/0، 038/0، 039/0 به ترتیب در غلظت‏های 5 درصد MgCl2‏، 5 درصد NaCl و  5 درصدKCl  مشاهده می‏شود. حذف تلوریت در این نمک‏ها به شکل 100 درصد انجام شد.

 

 

a

 

a

 

a

شکل12- مقایسه‏ بهینه‏ نمک‏های سدیم، منیزیوم و پتاسیم کلراید بر فعالیت آنزیم و رشد در محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 1/0 میلی‏مولار تلوریت با 2 درصد مایه تلقیح (اسیدیته ‏5/7). مقادیر نشان‏گذاری شده با حروف لاتین مختلف دارای اختلاف معنی‏دار (P value <0.05) هستند.

 


اثر نمک‏های مختلف سدیم نیترات، دی سدیم سولفات و سدیم استات روی رشد و فعالیت آنزیم

باکتری Salinicoccus iranensis QW6 قادر به رشد قابل ملاحظه در نمک‏های مورد آزمون نبوده ولی به ترتیب رشد دی سدیم سولفات و سدیم استات در غلظت‏های 10‏ و 15 درصد‏ بهتر بود. در مورد
 نیترات با افزایش غلظت نمک افزایش می‏یافت ولی هیچ گونه فعالیت آنزیمی در این نمک‏ها ردیابی نشد (شکل 13). در ضمن با وجود رشد روی غلظت‏های مختلف نمک،‏ حذفی به شکل مشاهده‏ رسوب سیاه رنگ انجام نشده یا با روش مورد استفاده (DDTC) قادر به سنجش آن نبود.

 

 

 

شکل13- اثر نمک‏های سدیمی بر رشد و فعالیت آنزیم. باکتری در محیط LB با اسیدیته5/7 تلقیح شد


خالص‏سازی آنزیم

رسوب‏دهی به روش آمونیوم سولفات روش مناسبی برای رسوب دادن آنزیم بود. در ابتدا تصمیم بر این بود تا از روش بخش‏بندی[25] توسط آمونیوم سولفات برای خالص‏سازی استفاده شود ولی به علت عدم تکرار‏پذیری از این روش صرف نظر و از همان ماکزیمم غلظت به منظور رسوب‏دهی استفاده شد. در این روش از عصاره‏ سلولی با غلظت 11440 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر استفاده شد. بخش‏هایی که دارای فعالیت آنزیمی بودند، بررسی شدند (شکل 14). با محاسبه فعالیت ویژه‏، میزان درصد مناسب آمونیوم سولفات به منظور رسوب پروتئین (های) مد نظر 60 درصد‏ به‏دست آمد.

از آنجا که به نظر آنزیم وابستگی به نمک از خود نشان می‏داد نمونه‏ها بدون دیالیز و با دیالیز سنجش فعالیت آنزیمی شدند. عصاره‏ دیالیز شده در صورت دیالیز علیه بافر فسفات فعالیت از خود نشان نمی‏داد. علاوه بر آن گرماگذاری بخش فعال در حضور سوبسترا نشان داد که با استفاده از درصد آمونیوم سولفات به دست آمده فرآیند ردوکتازی به شکل رسوب سیاه رنگ در محیط مشاهده شد.

 

شکل14- رسوب‏دهی با آمونیوم سولفات. غلظت‏های مختلف آمونیوم سولفات به منظور رسوب دادن پروتئین (های) مورد نظر از 30-80 درصد به کار گرفته شد.

نتایج ستون‏ فنیل سفارز

120 فرکشن از بارگذاری نمونه‏ عصاره‏ سلولی پس از رسوب با آمونیوم سولفات، روی ستون فنیل سفارز جمع آوری و برای تعیین فعالیت آنزیمی سنجش شد. کروماتوگرام حاصل از سنجش شکل 15 مشاهده می‏شود. فعالیت آنزیمی در بخش انتهایی ستون (95 درصد بافرB) مشاهده شد.

 

 

 

شکل 15- کروماتوگرام ستون فنیل سفارز. ستون باTris-HCl  اسیدیته‏ 8 به تعادل رسانده شده بود. فعالیت آنزیمی در در پیک انتهایی ستون مشاهده شد که با ستاره در بالای پیک مورد نظر نشان داده شده است. مقدار جذب (mAu) در طول موج 280 نانومتر و درصد ‏B میزان بافر B افزوده سده به ستون به منظور شستشو است.


بررسی پروتئین‏ها با الکتروفورز SDS-PAGE

الکتروفورز بخش فعال به‏دست آمده از ستون تغلیظ یکی از باندها در محدوده جرم مولکولی 57 کیلودالتون را نشان داد (شکل 16). در این بخش علاوه بر فعالیت تلوریت ردوکتازی، فعالیت سلنیت و نیترات
ردوکتازی هم مشاهده ‏شد. تغلیظ نمونه نیز نشان داد که در محدوده‏ جرم مولکولی بالاتر از 116 کیلودالتون نیز یک باند تغلیظ شده حضور دارد. علاوه بر آن هم در چاهک و هم اطراف این باند‏ها حضور پروتئین مشاهده می‏شد.

 


 

A

 

C

 

B

 

0/116

2/66

0/45

0/35

0/25

4/18

4/14

 

 

0/116

2/66

 

 

0/45

0/35

0/25

 

 

4/18

4/14

 

 

KDa

 

KDa

 


 

بحث و نتیجه‏‏گیری

با وجود مطالعات زیاد بر روی مقاومت به تلوریت و سایر اکسی‏آنیون‏ها، تا کنون در زمینه‏ شناسایی عوامل دخیل در مسیر احیای تلوریت کوشش‏های اندکی انجام شده است.

این مطالعه‏ها مربوط به میکروارگانیسم‏های غیرنمک‏دوست بوده و با وجود مقاومت ذاتی بالای نمک دوست‏ها به نمک بر روی آن‏ها، پژوهشی در این زمینه انجام نشده است. علت استفاده از باکتریSalinicoccus iranensisQW6، علاوه بر هالوفیل بودن و بومی بودن سویه‏، مقاومت بالاتر آن به تلوریت نسبت به سایر هالوفیل‏های گزارش شده بود (21-24). به منظور بررسی فعالیت مکانیسم تلوریت زدای سعی شد از تکنیک‏های میکربی استفاده شود. در این روش، حذف تلوریت بالاتر به معنای فعالیت بیش‏تر آنزیم (ها) تعبیر می‏شد. با توجه به نتایج رشد همان گونه که انتظار می‏رفت هر چه غلظت اکسی‏آنیون سمی بالاتر بود، مدت زمان فاز تاخیر میکروارگانیسم هم بیش‏تر ‏شد. حتی در غلظت‏های کم تلوریت هم فاز تأخیر در رشد میکروارگانیسم مشاهده می‏شود که بیان‏گر سمیت بالای اکسی آنیون و آماده‏سازی میکروارگانیسم برای مقابله با آن است. در مورد غلظت 1/0 میلی‏مولار تلوریت این موضوع کم‏رنگ‏تر بود بدین علت که این غلظت با توجه بهMIC میکروارگانیسم که 12 میلی‏مولار گزارش شده، کم محسوب شده و میکروارگانیسم قادر است به‏آسانی با آن مقابله نموده و تفاوت زیادی با شاهد و در شرایط بدون حضور اکسی‏آنیون سمی نداشته باشد. این موارد نیز پیش‏تر در نتایج کبیری و همکاران[26] و نیز صعودی و همکاران[27] گزارش شده بود (13 و 25).

در مورد حذف تلوریت نتایج جالب به نظر می‏رسید با افزایش غلظت تلوریت تا 5/0 میلی‏مولار حذف آن هم بیش‏تر انجام می‏شود. آموزگار و همکاران نیز حذف تلوریت در این غلظت را توسط میکروارگانیسم بیش‏تر گزارش نمودند (17). سریع‏ترین میزان حذف در غلظت 1/0 میلی‏مولار تلوریت مشاهده ‏شد. کمی بعد حذف در غلظت 25/0 میلی‏مولار اکسی‏آنیون مشاهده شد که این موضوع با اختلاف میزان بیوماس مشاهده شده مطابقت دارد. با افزایش غلظت‏ اکسی آنیون همان‏طور که میزان بیوماس کاهش بیش‏تری می‏یابد، حذف اکسی‏آنیون هم کم‏تر انجام می‏شود. در غلظت 1 میلی‏مولار تلوریت حذف به اندازه‏ای کم و نوسان‏دار بود که از ارائه‏ آن صرف نظر شد. نتایج پژوهشی دیگر توسط آموزگار و همکاران بر روی باکتری Thermoactinomyces sp. QS-2006 انجام شده بود، نشان داده شد که حذف تلوریت توسط سویه با افزایش غلظت‏ اکسی‏آنیون تا 1 میلی‏مولار بیشتر انجام می‏شود (26). نکته‏ مشابه این است که حتی در غلظت‏های بالا نیز بین 1، 2 و 3 میلی‏مولار تلوریت، 1 میلی‏مولار حذف بالاتری را نشان داد. نوسانات مشابهی در حذف تلوریت در هر دو گزارش مشاهده می‏شود.

بررسی فعالیت آنزیمی در محیط بیرون سلولی (محیط کشت) منفی بود. این محیط تغلیظ شد ولی باز هم آزمون‏‏ آنزیمی مربوطه به آن هیچ فعالیت آنزیمی را با این روش نشان نداد. اگرچه بررسی روی Pseudomonas stutzeri نشان داده بود که پیریدین 2 و 6 بیس تیوکربوکسیلیک اسید (PDTC) که یک سیدروفور است یا محصولات تولید شده توسط آن، هم در احیای سلنیت و هم در احیای تلوریت نقش دارند (27)، این نشان می‏دهد که آنزیم مؤثر در حذف تلوریت در باکتری مورد بررسی در محلی در داخل سلول باکتری واقع شده است.

به منظور انجام بررسی و خالص‏سازی آنزیم از غلظت 5/0 میلی‏مولار تلوریت استفاده شد. پس از سونیکاسیون، فعالیت آنزیم مثبت بود و کاهش جذب در طول زمان مشاهده می‏شد ولی این مقدار فعالیت آنزیمی اندک بود به گونه‏ای که آغاز فرآیند خالص‏سازی با آن انجام پذیر نبود؛ زیرا در طی مراحل خالص‏سازی این مقدار فعالیت که تنها عامل شناسایی آنزیم بود، قابل ردیابی نبود. بررسی تأثیر شرایط مختلف حضور تلوریت، حضور سلنیت، حضور تلوریت و سلنیت، حضور نیترات و بدون هر گونه اکسی‏آنیون بر میزان فعالیت ویژه‏ی آنزیم، عدم القایی بودن آنزیم را پیشنهاد می‏کرد.

بهبود فعالیت آنزیم با روش OFAT افزایش فعالیت آنزیم تلوریت زدای را به همراه داشت.

اثر غلظت‏های مختلف تلوریت

افزایش فعالیت آنزیم در حضور غلظت‏های مختلف تلوریت عدم القاگر بودن آن را برای آنزیم مورد نظر نشان داد؛ ولی نتایج حذف تلوریت این‏گونه نشان می‏داد که با افزایش غلظت اکسی آنیون حذف تلوریت نسبت به فعالیت آنزیمی بالاتر است که این موضوع می‏تواند حضور مسیر‏های مختلف حذف تلوریت در باکتری را نشان دهد. وابستگی بین بیوماس‏ و فعالیت آنزیم، فرض القا شونده بودن آنزیمی را که با این روش به دنبال آن بودیم، رد نمود. پیش‏تر نیز چوانگ و همکاران[28] و نیز موسکوسو و همکاران[29] عدم وجود ارتباط بین غلظت‏های مختلف تلوریت و فعالیت آنزیم را مربوط به القایی نبودن آن گزارش کردند (9 و 28).

 

اثر نمک‏های مختلف

آموزگار و همکاران پیش‏تر با رشد باکتری نمک‏دوست Thermoactinomyces sp. QS-2006 در حضور نمک‏های اخیر رشد و حذف تلوریت مناسبی را گزارش کرده بودند (26). در حالی‏که رشد و حذف تلوریت در این نمک‏ها دیده نشد. هر دو باکتری مقایسه شده از راسته‏ باسیلالز هستند. به نظر می‏رسد میکروارگانیسم مربوطه وابستگی به یون سدیم نشان نمی‏دهد. این موضوع باز هم تأیید‏کننده‏ همراهی حذف تلوریت با میزان بیوماس است. نکته‏ جالب توجه این بود که بیشتر نمک دوست‏ها نیازمندی به NaCl نشان می‏دهند؛ ولی میکروارگانیسم مورد مطالعه در حضور MgCl2 و KCl نیز رشد قابل ملاحظه‏ای، برابر با رشد در حضور NaCl  (P value < 0.05)، از خود بروز می‏داد. شاید این نمک دوست وابستگی به یون کلراید دارد. مقایسه هر سه نمکMgCl2، KCl و NaCl در یک آزمایش نشان داد هر سه، رشد، فعالیت آنزیم و حذف تلوریت را به خوبی پشتیبانی می‏کردند و تفاوت معنی‏داری (P value < 0.05) نشان ندادند. در هر سه نمک حذف تلوریت به شکل 100 درصد انجام شده بود. آشنگرف و همکاران[30] بین حذف تلوریت در حضور نمک‏های MgCl2 و KCl را تفاوت در میزان حذف تلوریت گزارش کرده بودند، که تفاوت مشاهده شده به زمان بررسی میزان حذف در این نمک‏ها نسبت داده شد (17).

خالص‏سازی آنزیم با تلفیق دو تکنیک رسوب‏دهی با آمونیوم سولفات و فنیل سفارز به نظر روش مناسبی برای خالص‏سازی آنزیم بود. کروماتوگرام ستون فنیل سفارز سه پیک نشان داد که فعالیت آنزیمی در پیک انتهایی مشاهده ‏شد. تغلیظ نمونه نیز نشان داد که هنوز پروتئین‏های دیگری هم در چاهک و هم در اطراف باند به نظر تغلیظ شده حضور دارد. به همین منظور نیاز است تا در ادامه با افزودن روش‏های دیگر به آن، خالص‏سازی را بهبود دهیم. به منظور تأیید احیای تلوریت توسط آنزیم مربوطه، از گرماگذاری مستقیم آن با تلوریت و NADH استفاده شد که نتایج حضور آنزیمی را که در احیای این اکسی‏آنیون نقش دارد، تأیید کرد.

این نمونه‏ به طور نسبی خالص‏سازی شده، قادر به احیای سلنیت و نیترات نیز بود. از آنجا ‏که فعالیت تلوریت ردوکتازی نیترات ردوکتازها به عنوان قوی‏ترین فرضیه تا کنون مطرح است، این احتمال را دور از ذهن نمی‏کند که ما به سمت خالص‏سازی این آنزیم گام نهاده‏ایم ولی اثبات آن منوط به خالص‏سازی کامل آنزیم است.

مطالعاتی که در زمینه خالص‏سازی نیترات ردوکتازها در باکتری‏های نمک دوست بوده، یک مورد

 و آن ‏هم در سال 2010 توسط فیلی‏موننکو و همکاران[31] انجام گرفت، که در آن تنها یک زیر واحد را که همان NarG بود، گزارش نمود (29).

در مجموع نتایج این پژوهش بهینه‏سازی آنزیم دخیل در تبدیل زیستی تلوریت به تلوریوم و خالص‏سازی نسبی آن را به همراه داشت. اما باید خالص‏سازی به شکل کامل در ادامه کار انجام شود. همچنین، احتمال حضور مسیر‏های دیگر و غیر وابسته به NADH نیز بررسی شود.

 

 

 

 




[1]- Bioaccumulation

[2]- Merck (Darmstadt, Germany(

[3]- PhenylMethylSulphonyl Fluorid

[4]- Diethyl dithiocarbamate (DDTC(

[5]- Sigma (St. Louis, MO, USA) and

[6]- Pharmacia

[7]- Mojallali

[8]- Amoozegar et al

[9]- IBRC (Irainian Biological Resources Center(

[10]- Shimadzu UV-160A

[11]- OD620 1.5

[12]- Bovine Serum Albumin (BSA(

[13]- Bradford

[14]- Mode

[15]- One Factor At a Time (OFAT(

[16]- Fractionation

[17]- Fast Protein Liquid Chromatograpy

[18]- Amicon

[19]- Millipore

[20]- SDS- PAGE

[21]- One way ANOVA

[22]- Duncan`s multiple-range test

[23]- IBM SPSS Statistics 19

[24]- Inoculum

[25]- Fractionation

[26]- Kabiri et al

[27]- Soudi et al

[28]- Chiong et al

[29]- Moscoso et al

[30]- Ashengroph et al

[31]- Filimonenkov et al

 

 

 

 

 

References

(1) Korbekandi H, Darkhal P, Hojati Z, Abedi D, Hamedi J, Pourhosein M. Overproduction of Clavulanic Acid by UV mutagenesis of Streptomyces clavuligerus. Iranian Journal of Pharmaceutical Research 2010; 9 (2): 177-81.

(2) Tasneem M, Khan A, Ashraf H, Haq I. Xylanase Biosynthesis by chemically mutated strain of Aspergillus niger.Journal of Food Technology 2003; 1 (4): 178-81.

(3)  Coman G and Bahrim G. Minimizing cellulase biosynthesis from cellulase–free xylanase production with Streptomyces ssp. P12-137 using optimization by response surface methodology. Cellulose chemistry and technology 2011; 45 (3-4): 245-50.

(4) Dwivedi P, Vivekanand V,Ganguly R, Singh R P. Parthenium sp. as a plant biomass for the production of alkalitolerant xylanase from mutant Penicilliumoxalicum SAUE-3.510 in submerged fermentation. Biomass & Bioenergy 2009; 33: 581-8.

(5) HAQ I,Hussain R, Hameed U, and Javad M. Selection of Aspergillus niger mutant using antimetabolite 2-deoxy D-glucose after N-methyl N-nito N-nitroso guanidine (MNNG)  treatment. Pakistan Journal of Botany 2008; 40 (6): 2613-23.

(6) Sa-Pereira P, Mesquita A, Duarte JC, Aires Barros MR, Costa-Ferreira M. Rapid production of thermostable Cellulase-free xylanase by a strain of Bacillus subtilis and its properties. Enzyme and Microbial Technology 2002; 30: 924-33.

(7)  Yang VW, Zhuang Z, Elegir G, Jeffries TW. Alkaline-active xylanase produced by an alkaliphilic Bacillus sp isolated from Kraft pulp. Journal of Industrial Microbiology 1995; 15: 434-41.

(8)  Guimarães NCA, Sorgatto M, Peixoto-Nogueira SC, Betini JHA, Zanoelo FF, Marques MR, Polizeli MLTM, and Giannesi GC. Xylanase production from Aspergillus japonicus var aculeatus: Production using Agroindustrial Residues and Biobleaching Effect on Pulp.Journal of Biocatalysis and Biotransformation 2013; 2 (1): 1-6.

 

(9) Terrasan CRF, Temer B, Sarto C, Silva Junior FG, Carmona EC. Xylanase and B-Xylosidase from Penicillium janczewskii: Production, Physico-chemical Properties, and application of the crude extract to pulp Biobleaching.BioResources 2013. 8 (1): 1292-305.

(10)  Muhammad M.J, Haq I, Irfana M. Multistep mutagenesis for the over-expression of cellulase in Humicola insolens. Pakistan Journal of Botany 2011; 43 (1): 669-77.

(11)  Abdel-Aziz MS, Talkhan FN, Fadel M, AbouZeied AA, and Abdel-Razik AS. Improvement of xylanase production from Streptomyces Pseudogriseolus via UV mutagenesis. Australian Journal of Basic & Applied Sciences 2011; 5 (5): 1045-50.

(12) HAQ I, Ali S, Javed MM, Hameed U, Saleem A, Adnan F, et al. Production of alpha amylase from a randomly induced mutant strain of Bacillus amyloliquefaciens andits application as a desizer in textile industry. Pakistan Journal of Botany 2010; 42 (1): 473-84.

(13)   Nadeem M, Qazi JI, Baig SH. Enhanced production of alkaline protease by a mutant of Bacillus licheniformis N-2 for dehairing. Brazilian Archives of Biology and Technology 2010; 53 (5): 1015-25.

(14)  Abo-State M.A.M, Ghaly M.F, and Abdellah E.M. Optimization of Cellulase (s) and Xylanase Production by Thermophilic and Alkaliphilic Bacillus Isolates. American-Eurasian Journal of Agricultural & Environmental Sciences 2013; 13 (4): 553-64.

(15)  Azin M, Noroozi E. Random mutagenesis and use of 2-deoxy-D-glucose as an antimetabolite for selection of α-amylase-overproducing mutants of Aspergillus oryzae. World Journal of Microbiology & Biotechnology 2001; 17: 747-50.

(16)   Zarif B, Azin M, Amirmozafari N. Increasing the bioethanol yield in the presence of furfural via mutation of a native strain of Saccharomyces cerevisiae. African Journal of Microbiology Research 2011; 5 (6): 651-6.

(17)  Thein A, Prathuangwong S. Novel strains of Xanthomonas oryzae pv. oryzae UV mutated induce systemic resistance in rice against bacterial leaf blight disease. Kasersart Journal (Natural Science) 2010; 44: 1026-43.

(18)  Aly MM, Tork S, Alakilli SY. Molecular characterization of chitiniolytic Bacillus pumilus isolated from marine habitats and enhancement of chitinase production by mutation. Universal scholar in Biotechnology 2011; 1 (2): 14-21.

(19) Xu H, Jia SH, Liu J. Development of a mutant strain of Bacillus subtilis showing enhanced production of acetoin. African Journal of Biotechnology 2011; 10 (5): 779-88.

(20) Tehreema I, Mubashir N, Seyed Qaiser A, Muhammad AZ, Iffat A, Kyejoon L, et al.Mutation induced enhanced biosynthesis of lipase by Rhizopus oligosporus var. microsporus. Pakistan Journal of Botany 2010; 42 (2) :1235-49.

(21)  Akhavan Sepahi A, Ghazi SH, Akhavan Sepahi M. Cost effective production and optimization of alkaline xylanase by indigenous Bacillus mojavensis AG137 fermented on agricultural waste. Enzyme Research 2011; 10 (11): 1-9.

(22)  Khandepakar RDS, Bhosle NB. Isolation, Purification and characterization of the Xylanase produced by Arthrobacter sp. MTCC5214 when grown in solid state fermentation. Enzyme and Microbial Technology 2006; 39: 732-42.

(23)  PORSUK I, ÖZAKIN S, BALİ B, İNCE YILMAZ E. A cellulase-free, thermoactive, and alkali xylanase production by terrestrial Streptomyces sp. CA24. Turkish Journal of Biology 2013; 37: 370-5.

(24)  Bailey M J M, Biely P, Poutanen k. Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity. Journal of Biotechnology 1992; 23: 257-70.

(25)   Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Annual Chemistry 1959; 31 (3): 426-8.

(26)  Poorna CA, Prema P. Production and partial characterization of endoxylanase by Bacillus pumilus using agro industrial residues. Biochemical Engineering Journal 2006; 33: 106-12.

(27)   Kapoor M, Nair LM, Kuhad RC. Cost-effective xylanase production from free and immobilized Bacillus pumilus strain MK001 and its application in saccharification of Prosopis juliflora. Biochemical Engineering Journal 2008; 38: 88-97.

(28)  Sridevi B and Charya MAS. Isolation, identification and screening of potential cellulase free xylanase producing fungi. African Journal of Biotechnology 2011; 10 (22): 4624-30.

(29)  Gupta G, Sahai V, Gupta RK. Optimization of xylanase production from Melanocarpus albomyces using wheat straw extract and it’s scale up in stirred tank bioreactor. Indian Journal of Chemical Technology 2013; 20:282-9.

(30) Sugumaran KR, Kiran Kumar B, Mahalakshmi M, Ponnusami V. Cassava bagasse- Low cost substrate for thermotolerant xylanase production using Bacillus subtilis. International Journal of Chemical Technology Research 2013; 5 (1): 394-400.

(31)  Oliveira LA. Production of xylanase and protease by Penicillium janthinellum CRC 87M-115 from different agricultural wastes. Bioresource Technology 2006; 97: 862-7.

(32)   Cordeiro CAM, Martins MLL, Luciano AB, Da Silva RF. Production and properties of xylanase from thermophilic Bacillus sp. Brazilian Archives of Biology and Technology 2002. 45 (4): 413-8.

(33)  Annamalai N, Thavasi R, Jayalakshmi S, Balasubramanian T. Thermostable and alkaline tolerant xylanase production by Bacillus subtilis isolated from marine environment. Indian Journal of Biotechnology 2009; 8: 291-7.

(34)   Rahim T, Ray AL, Beauty SP, Gomes DJ. Induction of mutation in Neurospora crassa with Ultraviolet radiation and evaluation of cellulase and xylanase activities. Bangladesh Journal of Boiology 2009; 38 (2): 201-3.

(35)   HAQ I, Ali S, Saleem A, and Javed MM. Mutagenesis of Bacillus licheniformis through ethyl methanesulfonate for Alha amylase production. Pakistan Journal of Botany 2009; 41 (3): 1489-98.

(36)   Kotchoni S, Gachmo EW, Omafuvbe BO, Shonukan OO.Purification and biochemical characterization of carboxymethyl cellulose (CMCase) from a catabolite repression insensitive mutant of Bacillus pumilus. International Journal of Agriculture and Biology 2006; 8 (2): 286-92.

(37)   Li XH, Yang HJ, Roy B, Park EY, Jiang LJ, Wang D, et al. Enhanced cellulase production of the Trichoderma viride mutated by microwave and ultraviolet. Microbiological Research 2009; 10:1-10.

(38)  Hao XC, Yu XB, Yan ZL. Optimization of the medium for the production of cellulase by the mutant Trichoderma reesei WX-112 using response surface methodology. Food Technology and Biotechnology 2006; 44 (1): 89-94.

(39)   Reddi Pradeep M and Narasimha G. Utilization of pea seed husk as a substrate for cellulase production by mutant Aspergillus niger. Insight Biotechnology 2011; 1 (2): 17-22.

(40)  Nair SU, Singhal RS, Kamat MY. Enhanced production of thermostable Pullulanase type 1 using Bacillus cereus FDTA 13 and its mutant. Food Technology and Biotechnology 2006; 44 (2): 275-82.

(41)  Amena S, Lingappa K, Prabhakar M, Vishalakshi N. Production of L-Asparaginase by strain improvement and whole-cell immobilization of Streptomycesgulbargensis. Journal of the Renin Angiotensin Aldosterone System 2012; 27: 93-8.

(42)  Abdel Latif HAM, Abdel Fatah MR, Sabbour MM, El-Sharkawey AZ, El-sayed RS. Genetic modification of Bacillus thuringiensis var Kurstaki HD-73 to overproduce melanin, UV resistance and their insecticidal potentiality against potato tuber moth. International Journal of Academic Research 2010; 2 (6): 73-81.

(43)   Aftab MN, Haq I , Baig SH. Enhanced production of bacitracin by a mutant strain Bacillus licheniformis UV-MN-HN-8 (Enhanced bacitracin production by mutagenesis). Pakistan Journal of Botany 2010; 42 (3): 2095-103.

(44)   Usama F, Ali, Zeinab M, Ibrahim, and Georg S, Isaac. Ethanol and Xylitol Production from Xylanase Broth of Thermomyces Lanuginosus Grown on Some Lignocellulosic Wastes using Candida tropicalis EMCC2. Life Science Journal 2013; 10 (1): 968-78.

(45)  Radha Krishna E, Shamsher Kumar P, Veerendra Kumar B. Strain improvement of selected strain Bacillus subtilis (MTCC No.10619) for enhanced production of antimicrobial Metabolites. Journal of Microbiology and Biotechnology Research 2011; 1 (3): 32-8.