بیوکنترل عامل مولد بیماری شانکر مرکبات با استفاده از ترکیبات ضد میکروبی تولید شده توسط قارچ Aspergillus awamori K-03

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی، دانشگاه شاهرود، ایران

2 استادیار زیست شناسی مولکولی، گروه پژوهشی بیوتکنولوژی، دانشگاه شاهرود، ایران

3 استادیار بیوشیمی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران،

4 استادیار زیست شناسی مولکولی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

5 استادیار بیماری شناسی گیاهی، گروه پژوهشی بیوتکنولوژی، دانشگاه شاهرود، ایران

6 کارشناس گروه شانکر مرکبات، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: بیماری‏های باکتریایی از جمله دلایل اصلی خسارت در گیاهان به شمار می‏آیند. در این میان، باکتری عامل بیماری شانکر مرکبات (Xanthamonas citri ssp. citri (Xcc کشت لیمو در سراسر دنیا را تحت تأثیر خود قرار داده است‏‏.
مواد و روش‏‏ها: توانایی آنتاگونیستی ترکیبات ضد میکروبی موجود در سکروتوم قارچ
Aspergillus awamori K-03 علیه 26 سویه از باکتری Xanthomonas citri ssp. citri با استفاده از روش دیسک
بر روی محیط PDA بررسی شد. همچنین، طیف بازدارندگی این ترکیبات ضد میکروبی بر علیه باکتری‏های گرم مثبت و گرم منفی دیگر از جمله Escherichia coli، Bacillus subtilis، Erwinia amylovoraو
Pseudomonas fluorescense و دو پاتوژن مهم انسانی Salmonella typhiوStaphylococcus aureus ارزیابی شد.
نتایج: ترکیبات ضد میکروبی موجود در سکروتوم قارچA. awamori K-03توانایی کنترل کنندگی باکتری‏های مورد مطالعه در این آزمایش را داشت و توانست ویژگی‏های ضد میکروبی خود را در برابر گرما و همچنین، طیفی از اسیدیته‏های اسیدی و قلیایی حفظ کند.
بحث و نتیجه‏گیری: نتایج بررسی‏های ما در شرایط آزمایشگاهی ثابت کرد که می‏توان از ترکیب ضد میکروبی موجود در عصاره خام قارچ K-03 ‏ A. awamori به عنوان عاملی برای بیوکنترل باکتری‏های پاتوژن استفاده کرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Biocontrol of Causative Agent of Citrus Canker Disease Using Antimicrobial Substances Produced by Aspergillus awamori K-03

نویسندگان [English]

  • Sara Kazemzade 1
  • Naser Farrokhi 2
  • Saeed Aminzade 3
  • Mehdi Alavi 4
  • Abolfazl Masoudi 1
  • Mojtaba Mamarabadi 5
  • Tannaz Goodarzi 6
1 M.Sc of Biotechnology, Shahrood University, Iran
2 Assistant Professor of Molecular Biology, Shahrood University, Iran
3 Assistant Professor of Biochemistry, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran
4 Assistant Professor of Molecular Biology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran,
5 Assistant Professor of Plant Pathology, Faculty of Agriculture, Shahrood University, Shahrood, Iran
6 Technical Research Assistant of Citrus Canker Group, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction:Bacterial phytopathogens have a great impact on yield loss. In between, the causative agent of citrus canker Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc), has influenced citri culture worldwide.
Materials and methods: Antimicrobial efficacy of Aspergillus awamori K-03 secrotome was tested against 26 strains of Xanthomonas citri ssp. citri using disc diffusion method.
Results: The secretome managed to control other Gram positive and negative bacterial pathogens including Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus and Erwinia amylovor. The secretome was heat stable and remained active in wide ranges of pH (4-9).
Discussion and conclusion: Our result demonstrates that the A. awamori K-03 secretome has antimicrobial activity and can be used as a biocontrol agent.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Fungi
  • Antimicrobial substances
  • Canker disease
  • Xanthomonas citri ssp. citri

مقدمه

بیماری باکتریایی‏ شانکر آسیایی مرکبات از جمله بیماری‏های باکتریایی است که بر روی درختان میوه ایجاد می‏شود. عامل این بیماری دارای دو تیپ متفاوت A و *A است. اگرچه سویه‏های تیپ A در بیشتر مناطق کشت و تولید مرکبات دیده می‏شود ولی سویه‏های تیپ *A تنها در هند، تایلند و کشورهای حوزه خلیج فارس از جمله ایران شناسایی شده‏اند و دامنه میزبانی آن‏ها تنها محدود به درخت لیموترش است. این بیماری در سال 1899 برای نخستین بار در ژاپن بر روی برگ‏های واشنگتن ناول مشاهده شد ولی نامی برای آن مشخص نشد (1). برگر و همکاران[1] شانکر را به عنوان بیماری جدید معرفی کردند (2). این بیماری نخستین بار در ایران بر روی لیموی مکزیکی از منطقه کهنوج استان کرمان به‏وسیله علیزاده و رحیمیان[2]گزارش شد (4). رحیمیان و همکاران[3] گسترش شانکر را در استان‏های جنوبی بررسی و گزارش کردند این بیماری در بیشتر باغات استان هرمزگان، کهنوج و تعدادی از باغات جیرفت و سیستان و بلوچستان وجود دارد. همچنین، درختان لیموترش به پاتوتیپ‏های موجود حساسیت بالایی داشته ولی ارقام پرتقال، نارنگی و نارنج حساسیت کمتری دارند (5 و 6).

عامل بیماری شانکر مرکبات باکتری گرم منفی Xanthomonas citri ssp. citri است که بر روی محیط‏های کشت کلونی‏های زرد رنگ ایجاد می‏کند. درجه حرارت بهینه برای رشد این باکتری 28 تا 32 درجه سانتی‏گراد‏ است. عامل بیماری در حاشیه زخم‏های ایجاد شده روی برگ، میوه و سرشاخه‏ها تا زمان ریزش آن‏ها باقی می‏ماند، در حالی که در خاک فقط چند روز می‏تواند زنده بماند (7).

علایم این بیماری شامل: زخم‏های برآمده و نکروتیک مشخص بر روی برگ‏ها، ساقه و میوه است. شدت بیماری باعث ریزش برگ‏ها، بدشکلی میوه‏ها، ریزش پیش از موقع میوه‏ها، خشکیدگی سر شاخه‏ها و ضعف عمومی درخت است. البته این بیماری سیستمیک نیست و فقط باعث زخم‏های موضعی می‏شود (3، 8 و 9). شانکر باکتریایی به کمک قطرات باران و یا آب جاری و یا دست‏زدن به گیاهان و یا از طریق ابزار آلوده و مواد آلوده گیاهی انتقال می‏یابد. کنترل بیماری شانکر، از طریق بهداشت، شیوه‏های از بین بردن و از طریق چندین بار اسپری کردن سموم مسی، محلول بوردو و یا آنتی‏بیوتیک‏ها انجام می‏شود (6 و 7).

با توجه به اهمیت استفاده از استراتژی مبارزه زیستی به‏عنوان یکی از روش‏های کنترل عوامل بیماری‏زا، در این تحقیق توانایی آنتاگونیستی عصاره خام مجموعه‏ای از جدایه‏های قارچی برای استفاده در بیوکنترل بیماری شانکر مرکبات بررسی شد.

 

مواد و روش‏ها

نمونه‏برداری و جداسازی قارچ از خاک

نمونه‏برداری از خاک باغات نواحی شمال کشور (استان‏های گلستان و مازندران) و جنوب کشور (استان‏های هرمزگان، فارس و کرمان) در تابستان 1390 انجام شد. از هر یک از نمونه‏های خاک، سری رقتی[4] تهیه و بر روی محیط PDA (پپتون، گلوکز و آگار) کشت و در دمای 30 درجه سلسیوس و در تاریکی به مدت یک هفته انکوبه شد. جدایه‌های به‌دست آمده از هر یک از نمونه‌های خاک به ظروف پتری حاوی محیط کشت آب آگار منتقل و با گرفتن تک اسپور از آن‏ها و انتقال به محیط PDA دیگری خالص شد.

 

تهیه عصاره خام[5]از هر یک از جدایه‏های قارچ

برای تهیه عصاره خام از حاشیه کشت هفت روزه هر یک از جدایه‏ها، دو قطعه از محیط کشت قارچ حاوی ژلوز محیط کشت، به ابعاد تقریبی (1 ×1 سانتی‏متر) حاوی 106 × 75 سلول اسپور به‏طور تقریبی، جدا و در فلاسک ارلن مایر شامل: 100 میلی‏لیتر محیط PDB (شامل: 4 گرم پپتون، 20 گرم گلوکز) ریخته شد و به مدت 20 روز در شیکر انکوباتور با دور rpm 180 و دمای 30 درجه‏ سلسیوس نگهداری شد. محیط کشت حاوی میسلیوم‏های قارچی، با عبور از کاغذ صافی فیلتر شد. مایع عبوری از صافی با حجم برابری از اتیل استات مخلوط و به مدت یک ساعت در دمای 20 منفی درجه سلسیوس قرار داده شد و به مدت 30 دقیقه در
 g× 11627 سانتریفیوژ شد. عصاره با استفاده از تبخیر چرخشی در دستگاه SpeedVac Eppendorf/Hamburg/Germany) Concentrator) به میزان 10 برابر غلیظ شدند. تمامی عصاره‏ها در دمای 4 درجه سلسیوس نگهداری شدند (10-13).

سنجش فعالیت آنتی‏میکروبیال عصاره‏های قارچی

عصاره 20 قارچ برای سنجش فعالیت آنتی‏باکتریالی در مقابل 26 سویه از باکتری زانتوموناس و همچنین، سایر باکتری‏های گرم مثبت و گرم منفی دیگر، از جمله Escherichia coli، Bacillus subtilis، Pseudomonas fluorescens، Salmonella typhi، Staphylococcus aureus و Erwinia amylovora بررسی شد.

مقدار 100 میکرولیتر از باکتری کشت داده شده در محیط مایع (YP عصاره مخمر و پپتون) شامل:
 cfu. ml-11023×4 تعداد باکتری، روی سطح پتری‏هایی که حاوی محیط کشت PDA بودند با استفاده از سوآپ استریل کشت شد. مقدار 15 میکرولیتر از هر یک از عصاره‏های قارچی روی سطح دیسک‏های اتوکلاو 5 میلی‏متری که به واسطه پانچ کاغذ صافی ایجاد شده بود، قرار گرفت و دیسک‏ها روی سطح پلیت‏های آغشته به سوسپانسیون باکتری، قرار داده شد. ظرف در دمای 30 درجه‏ سلسیوس به مدت 24 ساعت انکوبه شد. فعالیت آنتی‏باکتریالی به شکل اندازه‏گیری قطر ناحیه بازدارنده بر حسب میلی‏متر ارزیابی شد. همچنین، برای بررسی اثر ضد قارچی سکروتوم هر یک از جدایه‏های قارچی فعالیت آن‏ها بر روی دو قارچ Macrophomina phaseolina و Rhizoctonia solani ارزیابی شد (10-12 و 14-16).

شناسایی مولکولی جدایه قارچی دارای خاصیت آنتاگونیستی

برای شناسایی مولکولی جدایه دارای خاصیت کنترل کنندگی ابتدا با استفاده از روش [6]CTAB، DNA ژنومی استخراج شد. سپس، با استفاده از پرایمرهای عمومی، توالی 18SrRNA

(F18S-5'-CCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3' و R18S-5'- GCTTGATCCTTCTGCAGGTT-3') آن تکثیر شد و پس از تعیین توالی با توالی‏های مربوط در سایت [7]NCBI مقایسه شد. از نرم افزارCLC Sequence Viewer 6 نیز برای ترسیم درخت فیلوژنتیک مربوط به این قارچ استفاده شد.

هر واکنش PCR[8] شامل: 1 میکرولیتر DNA الگو، 5/2 میکرولیتر بافر PCR ×10، 8/0 میکرولیتر MgCl2 (50 میلی‏مولار)، 5/0 میکرولیتر dNTP (10 میلی‏مولار)، 5/0 میکرولیتر از هر یک از پرایمرهای رفت و برگشت با غلظت 10 پیکومول، Taq پلی‏مراز به میزان 2/0 میکرولیتر و ddH2O به میزان 19 میکرولیتر استفاده شد. تکثیر در دستگاه PCR در طی 30 سیکل انجام شد. برنامه PCR شامل: 1 دقیقه در 94 درجه سانتی‏گراد‏، 1 دقیقه در 56 درجه سانتی‏گراد‏ و 2 دقیقه در 72 درجه سانتی‏گراد‏ استفاده شد. مرحله تطویل نهایی نیز در طی 10 دقیقه در دمای 72 درجه‏ سانتی‏گراد‏ انجام گرفت (11).

تأثیر حرارت، اسیدیته‏ و مواد شیمیایی بر فعالیت عصاره قارچی

برای بررسی اثر اسیدیته‏ با استفاده از بافر سدیم فسفات، اسیدیته‏های 4 تا 9 تهیه شد و عصاره قارچی با هر یک از اسیدیته‏های ساخته شده با نسبت 1:1 به مدت 30 دقیقه مجاور شد. برای اندازه‏گیری مقاومت به گرما عصاره در حرارت 50 تا 100 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت نیم ساعت قرار گرفت (14-16). همچنین، برای بررسی اثر مواد شیمیایی، عصاره قارچی با EDTA[9] یک درصد به مدت 30 دقیقه مجاور شد و فعالیت آنتاگونیستی در تمامی موارد با استفاده از روش دیسک بررسی شد (17).

تعیین حداقل غلظت بازدارنده[10] (MIC)

تعیین حداقل غلظت بازدارنده عصاره قارچی با استفاده از روش Broth microdilution در میکروپلیت الایزا انجام شد. برای این کار غلظت‏های 4 تا 2048 میکروگرم در میلی‏لیتر از عصاره حاوی ترکیب آنتی‏میکروبیال تهیه شد و سپس، کدورت باکتری زانتوموناس (سویه 88 NIGEB) به کمک دستگاه اسپکتروفتومتر در cfu. ml-1  105 ×5 تنظیم شد. در زیر هود از هر کدام از غلظت‏های ساخته شده حجم 100 میکرولیتر به چاهک‏های میکروپلیت اضافه شد. از نمونه باکتری نیز به میزان 1 میکرولیتر به دامنه غلظت‏های ترکیب ضد میکروبی اضافه شد. در نهایت، میکروپلیت در دمای 30 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت 24 ساعت قرار گرفت[11].

نتایج

پس از بررسی اثر مهاری عصاره 20 جدایه قارچی بر روی سویه مختلف باکتری زانتوموناس، عصاره‏ قارچی جدایه شماره 3 هاله عدم رشد شاخص‏تری نسبت به سایرین ایجاد کرد. پس از تکثیر ناحیه‏ی 18S rRNAمحصول PCR با کیت Roche (Penzberg/Germany) خالص و برای تعیین توالی به شرکت ژن فناوران فرستاده شد. نتیجه توالی‏یابی حاصل پس از انجام BLAST در سایت NCBI و رسم درخت فیلوژنتیک نشان داد که توالی حاصل به یکی از سویه‏های قارچ Aspergillus awamori مربوط است این قارچ با نام Aspergillus awamori K-03 و با شماره پذیرش KF922319 در سایت NCBI ثبت شد (شکل 1).

در این بررسی عصاره قارچ K-03 A. awamori علیه 26 سویه از باکتری مولد بیماری شانکر مرکبات خاصیت آنتاگونیستی نشان داد (جدول 2). نتایج بررسی‏های ما در شرایط آزمایشگاهی ثابت کرد که می‏توان از ترکیب ضد میکروبی موجود در سکروتوم قارچ K-03 ‏A.awamoriبه عنوان عاملی برای بیوکنترل سایر باکتری‏های پاتوژن نیز استفاده کرد. ماده ضد‏میکروبی تولیدی توسط قارچ K-03 A. awamori علاوه بر سویه‏های مختلف باکتری زانتوموناس فعالیت بازدارندگی برعلیه سایر باکتری‏های گرم مثبت و گرم منفی دیگر از جمله E. coli، Bacillus subtilis، Pseudomonas fluorescenceو Erwinia amylovora و دو پاتوژن مهم انسانی Salmonella typhiوStaphylococcus aureus را نشان داد (شکل 2). حداقل غلظت بازدارنده برای ترکیب ضد میکروبی موجود در سکروتوم قارچ A. awamori K-03، 128 میکروگرم بر میلی‏لیتر تعیین شد.

خاصیت مهم ترکیب ضدمیکروبی موجود در سکروتوم قارچ K-03 A. awamori پایداری در دمای 100 درجه سلسیوس به مدت 30 دقیقه بود. ضمن آنکه فعالیت خود را در اسیدیته‏های متفاوت و همچنین در حضور EDTA حفظ نمود.

سکروتوم قارچ  A. awamori K-03هیچ اثر کنترل‏کنندگی را در مقابل دو قارچ Macrophomina phaseolina و Rhizoctonia solani نشان نداد.

 

بحث و نتیجه‏گیری

نتایج حاصل از تاثیر عصاره‏ قارچK-03A. awamori بر سویه‏های مختلف باکتریایی بیانگر وسیع الطیف بودن این ترکیب‏ ضدمیکروبی است. این اثر بازدارندگی وسیع می‏تواند ناشی از سیستم‏های پیچیده آنتاگونیستی باشد که توسط این قارچ‏ تولید می‏شود. نتایج حاصل از بررسی‏های ژنگ و همکاران[12] مؤید همین مسئله است (16). گزارش‏های بسیاری پیرامون مقاومت ترکیبات آنتی‏میکروبیال در دماهای بالا وجود دارد که در این مطالعه این میزان به مدت 30 دقیقه در دمای 100 درجه سانتی‏گراد بود. ژنگ و همکاران (16) نشان دادند حساسیت ترکیبات آنتی‏میکروبیال نسبت به اسیدیته بسیار متفاوت است و تعداد زیادی از آن‏ها در محدوده وسیعی از اسیدیته‏ها فعال هستند. ماده استخراجی در این مطالعه، نیز همین ویژگی را نشان داده و در تمامی اسیدیته‏های تهیه شده فعالیت خود را به خوبی حفظ کردند. مشابه نتایج مژگانی و همکاران[13] ترکیب عصاره دارای خاصیت ضد میکروبی با EDTAپس از 30 دقیقه مجاورت تغییری را در عملکرد آن‏ها ایجاد نکرد. این عدم بازدارندگی گویای این است که کاتیون‏های فلزی نقشی در فعالیت این ماده ضد میکروبی ندارند (17) (جدول 1).

 

 

 

 

شکل 1- بررسی توالی 18S rRNA ایزوله شماره 3 نشان داد این ایزوله یکی از سویه‏های قارچ Aspergillus awamori است. قرار گرفتن این سویه قارچی در یک شاخه جداگانه از درخت بیانگر این مهم است که قارچ یاد شده سویه‏ای جدید در جنس مربوط به خود است. این قارچ با نام Aspergllus awamori K-03 و با شماره پذیرش KF922319 در سایت NCBI ثبت شد.

 

جدول 1- تأثیر عوامل بازدارنده فیزیکی و شیمیایی بر عامل بازدارنده تولید شده توسط قارچ A. awamori K-03

عامل

تیمار

اثر آنتاگونیستی

شلات کننده

EDTA1 درصد

+

حرارت

(درجه سانتی‏گراد‏)

50

+

70

+

90

+

100

+

اسیدیته‏

4

+

5

+

6

+

7

+

8

+

9

+

+ همچنان اثر آنتاگونیستی خود را حفظ کرده است.

 

 

C-

 

NIGEB-48

 

NIGEB-260R2

 

NIGEB-218

 

NIGEB-381

 

NIGEB-252R1

 

 


 

 

 

شکل2- بررسی اثر آنتاگونیستی سکروتوم قارچ A. awamori K-03بر روی برخی از سویه‏های بیماری‏زای زانتوموناس

 

 

 

 

 

جدول 2- میزان ناحیه بازدارنده سکروتوم قارچ A. awamori K-03بر سویه‏های مختلف زانتوموناس و باکتری‏های دیگر

ردیف

نام سویه

قطر ناحیه بازدارنده بر حسب میلی‏متر

1

NIGEB-213R1

25

2

NIGEB-243R2

15

3

NIGEB-31

16

4

NIGEB-287R1

22

5

NIGEB-A2L3R1L

13

6

NIGEB-213R2

35

7

NIGEB-281R23

16

8

NIGEB-216R2

25

9

NIGEB-228R1

20

10

NIGEB-244R1

17

11

NIGEB-266R2

10

12

NIGEB-243R1

11

13

NIGEB-384

10

14

NIGEB-170

15

15

NIGEB-232

20

16

NIGEB-385

20

17

NIGEB-48

35

18

NIGEB-218

35

19

NIGEB-9322

25

20

NIGEB-A252R1

40

21

NIGEB-388

22

22

NIGEB-380

35

23

NIGEB-260R2

30

24

NIGEB-381

35

25

NIGEB-242R1

25

26

NIGEB-269

25

27

Bacillus subtilis

20

28

Erwinia amylovora

15

29

Pseudomonas fluorescens

25

30

Escherichia coli

25

31

Staphylococcus aureus

20

32

Salmonella typhi

25

 

 

در پایان، می‏توان با قاطعیت ابراز کرد که در این پروژه عامل بیماری شانکر مرکبات توانست به وسیله ترکیبات ضد میکروبی موجود در سکروتوم قارچ
 A. awamori K-03در شرایط in vitro کنترل شود. بنابراین، با توجه به اهمیت استفاده از استراتژی مبارزه زیستی به‏عنوان یکی از روش‏های کنترل عوامل بیماری‏زا، سرمایه‏گذاری بر روی این ترکیبات ضدمیکروبی برای مهار بیماری شانکر مرکبات و سایر بیماری‏های باکتریایی و قارچی دیگر ارزشمند خواهد بود.

تشکر و قدردانی

هزینه اجرای این پژوهش از طریق طرح اولویت محور شانکر مرکبات با شماره (م 406)، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری تأمین شده است که بدین وسیله از تمامی اعضای محترم گروه تشکر و قدردانی می‏شود.

 



[1]- Berger et al

[2]- Alizadeh and Rahimian

[3]- Rahimian et al.

[4]- Serial dilution

[5]- Crude extract

[6]- Crude extract

[7]- http://www.ncbi.nlm.nih.gov

[8]- Polymerase Chain Reaction

[9]- EthyleneDiamineTetraacetic Acid

[10]- Minimum Inhibitory Concentration

[11]- http://www.nccls.org

[12]- Zheng et al.

[13]- Mojgani et al.

References

 (1)   Civerolo E L. Citrus bacterial canker disease: An overview. International Society Citriculture 1981;1: 390-4.

(2)  Berger E W, Stevens H E, Stirling F. Citrus canker. Florida Agricultural Experiment Station 1914; 124 (4): 27-53.

(3)    Koizumi M. Resistance of citrus plants to bacterial canker disease: A review. Proceedings of theInternational Society of Citriculture 1981; 1: 402-5.

(4)    Alizadeh A, Rahimian H. Citrus canker in kerman province. Iranian Journal of PlantPathology 1990; 26 (1-4): 1-4.

(5)     Rahimian H, Khodakaramian G, Babaee-zad V, Zarei A. Widespread distribution of citrus canker in southern Iran. In 13th Iran. Plant Protection Congress: Karaj, Iran, 1998. pp 246.

(6)     Montakhabi M K, Rahimian H, Rastgar M, Jafar pour B. Possible of Xanthomonas axonopodis pv. citri biocontrol, causative agent of canker disease using bacteria. Journal of Plant Protection 2011; 24 (4), 368-76.

(7)     Agrios G. Plant pathology. 5th ed. Gainesville, Florida: University of Florida, Academic Press; 2005.

(8)     Schoulties C L, Civerolo E L, Miller J W, Stall R E, Krass C J, Poe S R, et al. Citrus canker in Florida. Plant Disease. 1987; 71 (5): 355-88.

(9)     Stall R E, Seymour C. Canker, a threat to citrus in the Gulf-Coast states. Plant Disease. 1983; 67 (5), 581-5.

(10)    Mayr-Hartings A, Hedges A J, Berkeley R C W. Methods for studying bacteriocins. Methods Microbiology 1972; 7 (8): 315-422.

(11)    Radji M, Sumiati A, Rachmayani R, Elya B. Isolation of fungal endophyte from Garcinia mangoostana and their antibacterial activity. African Journal of Biotechnology. 2011; 10 (1): 103- 7.

(12)   Silva M G, Dose A. The best penicillin for resistant bacteria. Journal of Antibiotics. 2004; 48 (5): 562-9.

(13)  Tong W Y, Darah I, Latiffeh Z. Antimicrobial activities of endophytic fungul isolation from medicinal herb Orthosiphon stamineus benth. Journal of Medicinal Plants Research. 2011; 5 (5): 831-6.

(14)  Hajji M, Jellouli K, Hmidet N, Balti R, Kamoun A S, Naseri M. A highly thermostable antimicrobial peptide from Aspergillus clavatus ES1: biochemical and molecular characterization. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 2010; 37 (5): 805-13.

Steiner H, Hultmark D, Engström A, Bennich H, Boman H G. Sequence and specificity of two antibacterial proteins