افزایش میزان تولید آنزیم گزیلاناز از باسیلوس موجاونسیس با استفاده از روش جهش‏زایی تصادفی

نویسندگان

1 دانشجوی دکترای میکروبیولوژی، ‏دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران، ‏ایران

2 دانشیار بیوتکنولوژی صنعتی، ‏سازمان پژوهش‏های علمی و صنعتی، ‏تهران، ‏ایران

3 دانشیار میکروبیولوژی، ‏دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال، ‏ایران

چکیده

مقدمه: افزایش میزان تولید آنزیم گزیلاناز از منابع میکروبی همواره مورد توجه پژوهشگران بوده است. مطالعه حاضر با هدف بررسی تاثیر عوامل جهش‏زای القایی کلاسیک بر افزایش میزان تولید آنزیم گزیلاناز باسیلوس موجاونسیس، ‏به منظور دست یافتن به سویه‏های پر تولید انجام شد‏‏.
مواد و روش‏‏‏ها: در این تحقیق، ‏ضمن نشان دادن توانایی باسیلوس موجاونسیسPTCC 1723، ‏به عنوان سویه‏ای جدید برای تولید آنزیم گزیلاناز، ‏به منظور افزایش تولید آنزیم از روش جهش‏زایی کلاسیک استفاده شد. ایجاد جهش‏یافتگان با به کار بردن عوامل جهش‏زا نظیر اشعه فرا بنفش و اسید نیترو انجام شد. غربال اولیه با در نظر‏گیری بالاتر بودن شاخص H/C جهش‏یافتگان درمقایسه با باکتری والد، ‏که معادل 6/1بود، ‏بر روی محیط آگار حاوی گزیلان انجام شد‏.
نتایج: از میان تعداد بیشماری کلونی‏ تیمار شده، ‏در جمع72 سویه جهش‏یافته با شاخص قطر هاله معادل و یا بالاتر از 6/1 انتخاب شدند. در مرحله بعدی غربال‏گری‏، ‏میزان آنزیم تولید شده توسط جهش‏یافتگان در کشت مایع با مقدار آنزیم تولید شده توسط باکتری وحشی مقایسه شد. سپس، ‏از بین 67 جهش‏یافته با توانایی تولید آنزیم بیشتر نسبت به باکتری والد، ‏جهش‏یافته شماره 17 با توانایی تولید IU/mL56/330 و جهش‏یافته شماره 43 با میزان تولید 58/319 انتخاب شدند که به ترتیب افزایش تولیدی معادل 45/3 و 3/3 برابر سویه والد نشان دادند.
بحث و نتیجه‏گیری: در نهایت، ‏این سویه‏ها به عنوان سویه‏های دارای جهش مثبت یا مطلوب و تحت عنوان جهش‏یافتگان پر تولید انتخاب و به عنوان سویه‏های دارای ارزش صنعتی در تولید آنزیم گزیلاناز نگه‏داری شدند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Over production of xylanase from Bacillus mojavensis by classical mutagenesis

نویسندگان [English]

  • shokoofeh ghazi 1
  • Mehrdad Azin 2
  • abbas Akhavan sepahi 3
1 Ph.D student of Microbiology, Science and Research branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
2 Associated Professor of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science & Technology, Tehran, Iran
3 Associated professor of Microbiology, Islamic Azad University, North Tehran Branch, Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: Over production of xylanase, enzyme from microbial resources was always considered by researchers. The present study was conducted to evaluate the effects of inductive mutagenesis, classical type, on enhanced xylanase production from Bacillus mojavensis in order to access to potent mutants with high capacity of production.
Materials and methods: Bacillus mojavenis PTCC20 1723, by proving its potentiality to produce xylanase, was used as a wild strain for over production of the enzyme by classical mutagenesis. After using mutagens such as UV and nitrous acid, screening of different mutants was accomplished. Initial screening was based on the enhanced H/C21 ratios of the colonies in comparison with that of the wild strain on xylan containing agar medium.
Results: Among numerous screened colonies, seventy two mutants with H/C ratio bigger than the parental strain, (H/C≥1.6), were isolated. At the next step, enzyme production of mutants was compared with that of the parental strain in liquid cultures. Overall, among 67 screened mutants, 2 mutants, which produced 319.58 and 330.56 IU/mL xylanase, were selected. These mutants produced 3.3 & 3.45 times more enzyme than the native strain, with preliminary production level of 95.73 IU/mL.
Discussion and conclusion: These mutants, as superior ones & resulted from the classical mutagenesis, were selected as the best strains.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bacillus mojavensis
  • Xylanase
  • Random mutagenesis
  • UV rays
  • Nitrous acid

مقدمه

جهش‏زایی تصادفی فرآیندی است که در آن، ‏با به‏کار بردن عوامل شیمیایی و فیریکی جهش‏زا، ‏تغییراتی در ویژگی‏های محصولات تولید شده توسط ژن‏ها ایجاد می‏شود. گاهی محصول اساساً تولید نمی‏شود و یا محصولاتی غیر طبیعی تولید می‏شوند. ولی گاهی این فرآیند منجر به افزایش تولید محصول در مقایسه با سویه جهش نیافته یا والد می‏شود ‏(‏1 و 2). ‏گزیلاناز، ‏آنزیم اصلی در تجزیه گزیلان، ‏دومین بیوپلیمر فراوان در جهان پس از سلولز است که با حمله به پیوندهای بتا یک به چهار گزیلان باعث شکستن اسکلت اصلی می‏شود ‏(‏3 و 4). ‏گزیلانازها کاربردهای فراوانی در صنایع، ‏از جمله سفید شویی کاغذ، ‏فرآوری نان، ‏هضم غذای دام و طیور و غیره دارد و تولید آن به طور انبوه مورد نیاز است ‏(‏5-9). ‏از آنجا که تولید آنزیم از منابع تولید کننده آن، ‏که بیشتر باکتری‏ها و قارچ‏ها هستند، ‏نمی‏تواند به لحاظ کمیت و ویژگی‏های کیفی آن جواب‏گوی نیازهای تجاری باشد، ‏تغییر ژنتیکی سویه‏های تولید کننده آنزیمی در ازای تولید بیشتر و یا تغییر کیفییت محصول تولیدی مد نظر است. به طور کلی بهبود سویه‏ها به لحاظ صنعتی و استفاده از روش‏های جهش‏زایی تصادفی فرآیندی است که در صورت موفقیت، ‏قابلیت تولید را تا چندین برابر افزایش می‏دهد و این افزایش در میزان تولید آنزیم گزیلاناز بسیار بیشتر و کارآمدتر از روش‏های پر هزینه دیگری نظیر کلونینگ و سایر روش‏های ژنتیکی نظیر جهش‏زایی هدف‏دار است، ‏که شاید با توجه به محدودیت و ویژگی‏های ذاتی خود سویه یا میزبان بیان کننده یک ژن در نهایت کارایی چندانی نداشته باشند ‏(‏7 و 10). ‏پژوهش‏های اندکی در رابطه با افزایش میزان تولید آنزیم گزیلاناز از منشا باکتریایی یا قارچی و با استفاده از روش‏های جهش‏زایی کلاسیک انجام شده است. بیشتر پژوهش‏های انجام شده بر روی کلونینگ ژن گزیلاناز متمرکز شده که میزان تولید را می‏تواند تا حد محدودی افزایش دهد. زیرا محدودیت سویه‏های وحشی تولید کننده و میزبان بیان کننده ژن پس از کلونینگ، ‏خود مانع از تولید بیش از حد محصول کلون شده می‏شود، ‏ضمن اینکه روش‏های بر پایه کلونینگ و یا جهش هدف‏دار گران‏تر نیز هستند. در حالی که ایجاد جهش با اشعه فرا بنفش ‌و یا مواد شیمیایی، ‏نه تنها ارزان‏تر و راحت‏تر بوده بلکه می‏تواند نتایجی به مراتب بهتر در افزایش تولید محصول مورد نظر نسبت به سایر روش‏های ژنتیکی گران قیمت‏تر ارایه دهد ‏(‏1 و 5). ‏مرور مقالات نشان می‏دهد تا به‏حال به تولید گزیلاناز توسط جهش‏یافته‏های باسیلوس موجاونسیس اشاره‏ای نشده است. در این مطالعه، ‏از روش کلاسیک ایجاد جهش‏های القایی با استفاده از اشعه [1]UV و اسید نیترو به‏عنوان ابزاری در بهبود سویه استفاده شد. نتایج به دست آمده در میزان تولید آنزیم از سویه‏های جهش یافته مقایسه شده و در نهایت، ‏بهترین سویه با بیش‏ترین میزان تولید آنزیم برگزیده شد.

 

مواد و روش‏ها

میکروارگانیسم

سویه میکروبی Bacillus mojavensis PTCC1723 [2] به شکل لیوفیلیزه از مرکز منطقه‏ای میکروارگانیسم‏های صنعتی ایران تهیه شد. برای تجدید کشت باکتری اقدامات لازم انجام و با انتفال سویه به محیط غنی برین هارت اینفوژین آگار مرحله احیای آن با موفقیت انجام شد.

برای بررسی توانایی باسیلوس موجاونسیس PTCC 1723 در تولید آنزیم گزیلاناز[3]، ‏از سوبسترای اختصاصی آنزیم گزیلاناز استفاده شد. محیط اختصاصی گزیلان آگار، ‏حاوی گزیلان خالص پوسته جو، ‏تهیه شده از شرکت فلوکا[4]، ‏با اسیدیته 7 و ترکیبات زیر ‏(‏گرم در لیتر) ‏تهیه شد: گزیلان خالص 5، ‏پپتون 5، ‏عصاره مخمر 5، ‏سولفات منیزیم هفت آبه 2/0، ‏دی‏پتاسیم هیدروژن فسفات 1 و آگار 15.

کشت نقطه ای از باکتری وحشی بر روی محیط اختصاصی تهیه شد. درچنین محیط کشتی، ‏میکروارگانیسم مولد آنزیم گزیلاناز، ‏هاله شفاف ناشی از تجزیه گزیلان تولید می‏کند. برای رویت بهتر هاله‏ها، ‏پلیت‏ها با محلول 1/0 درصد قرمز کنگو به مدت 15 دقیقه رنگ آمیزی و سپس، ‏با محلول کلرید سدیم یک مولار چندین بار شسته شدند ‏(‏6، ‏7 و 11). ‏

تهیه سوسپانسیون باکتریایی

از کشت 24 ساعته باسیلوس به میزان یک لوپ وارد 50 میلی‏لیتر از محیط غنی لوریا برتانی حاوی ‏(‏گرم در لیتر)‏: تریپتون 10، ‏پپتون 5 و کلرید سدیم 10 شد. گرماگذاری برروی شیکر انکوباتور به مدت 18 ساعت در 37 درجه سانتی‏گراد با دور rpm 160 انجام شد. سپس، 10 میلی‏لیتر از کشت مایع در دورrpm9000 به مدت 5 دقیقه و دمای 4 درجه سانتی‏گراد سانتریفوژ شد تا بیوماس جدا شود. بیوماس در 10 میلی‏لیتر از محیط سترون لوریا برتانی و در شرایط استریل حل شد. به‏طوری که کدورت سوسپانسیون به دست آمده در طول موج 625 نانومتر معادل 08/0 تا 1/0، ‏برابر نیم‏ درجه مک فارلند شود. به این شکل سوسپانسیونی حاوی حدود 108×5/1 سلول در هر میلی‏لیتر به دست آمد ‏(‏12-14). ‏

تیمار با اشعه فرابنفش

از سوسپانسیون باکتریایی یاد شده سری رقت‏هایی مختلف از 1-10 تا 9-10 تهیه و از هر رقت به میزان 50 میکرولیتر در پلیت کشت داده شد. پلیت‏های نوترینت آگار برای شمارش تعداد کلونی‏های بازمانده و پلیت‏های گزیلان آگار اختصاصی برای مشاهده هاله هیدرولیز کلونی‏‏های جهش‏یافته و مقایسه شاخص H/C[5]کلونی‏‏های جهش یافته با باکتری والد استفاده شدند ‏(‏15). ‏از لامپ اشعه فرابنفش میله ای شکل فیلیپس 30 وات با طول موج 280 نانومتر برای ایجاد جهش استفاده شد. پلیت‏ها در فاصله 20 سانتی‏متری لامپ قرار داده شدند ‏(‏16). ‏بازه زمانی اشعه دهی از صفر تا 400 ثانیه در نظر گرفته شد و پلیت‏های کشت شده با فواصل 30 ثانیه‏ای از معرض اشعه دهی فرا بنفش خارج شدند. برای جلوگیری از فعال شدن سیستم ترمیم نوری، ‏پلیت‏ها در کیسه‏های نایلونی سیاه رنگ و در یک جعبه مقوایی قرار داده شدند. پس از 24 ساعت پلیت‏های اشعه دیده از انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد و شرایط تاریکی خارج شده تا کلونی‏های ظهور یافته بر روی پلیت‏ها شمارش شوند. پلیت یا نمونه متعلق به زمان صفر که همان نمونه شاهد و بدون تیمار با اشعه فرابنفش است، ‏برای تعیین تعداد کلونی‏‏های اولیه و تیمار نشده استفاده شد. در نهایت، ‏براساس شمارش تعداد کلونی‏های بازمانده در پلیت‏ها منحنی میزان مرگ- میزان بازماندگان در اثر عامل جهش‏زا ترسیم شدکه نشان دهنده تغییر تعداد بازماندگان در مقابل زمان است ‏(‏1، ‏15، ‏17 و 18). ‏

تیمار با اسید نیترو

غلظت 2/0 مولار از نیتریت سدیم در بافر استات 2/0 مولار و اسیدیته 5/5 تهیه و پس از سترون شدن با فیلتر 2/0 میکرون به عنوان محلول پایه اسید نیترو در تمام مراحل بعدی جهش‏زایی استفاده شد ‏(‏15). ‏سوسپانسیون باکتریایی با کدورت نیم درجه مک فارلند تهیه و 10 میلی‏‏لیتر از آن وارد ارلنی شد که حاوی 10 میلی‏‏لیتر محلول اسید نیترو دربافر استات بود. این ارلن در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد قرار گرفت. برای ارزیابی تاثیر اسید نیترو بر سلول‏های باکتریایی، ‏تحت شرایط سترون، ‏از سوسپانسیون سلولی سویه وحشی هر 5 دقیقه یک‏بار، ‏تا 75 دقیقه، ‏به میزان 5/0 میلی‏لیتر نمونه‏گیری شد و به لوله‏های حاوی5/4 میلی‏لیتر بافر سدیم فسفات 05/0 مولار با اسیدیته 7 انتقال یافت. از بافر سدیم فسفات برای توقف اثر اسید نیترو روی سلول‏ها استفاده شد ‏(‏16). ‏سپس، ‏از لوله‏های یاد شده، ‏5/0 میلی‏‏لیتر نمونه گرفته و به درون لوله‏های حاوی سرم فیزیولوژی استریل برده شد. پس از هم زدن تمامی لوله‏ها،‏‏ از هر لوله 50 میکرولیتر بر روی پلیت‏های نوترینت آگار و گزیلان آگار استریل کشت داده شد. پلیت‏های نوترینت آگار برای شمارش تعداد کلونی‏های بازمانده و پلیت‏های گزیلان آگار برای مشاهده هاله هیدرولیز کلونی‏‏های دچار جهش و مقایسه شاخص قطر هاله کلونی‏‏های جهش یافته با سویه والد در نظر گرفته شدند. پلیت‏ها پس از کشت، ‏به انکوباتور37 درجه سانتی‏گراد منتقل و پس از 24 ساعت برای شمارش تعداد کلونی‏های باقی مانده خارج شدند ‏(‏16 و 19). ‏
به عنوان کنترل، ‏از سوسپانسیون باکتریایی سویه وحشی و تیمار نشده با اسید نیترو استفاده شد.

منحنی دوز بقا

معمولاً برای افزایش اطمینان از موثر بودن جهش‏های ایجاد شده، ‏ضریب مرگ سلول‏ها در اثر عامل جهش‏زا بین 99 تا 99/99 درصد در نظر گرفته می‏شود. ابتدا با تعیین منحنی مرگ میکروارگانیسم در اثر هریک از عوامل جهش‏زا، ‏زمان تیمار برای فرایند جهش‏زایی بهینه شد (‏20). ‏پس از تیمار سوسپانسیون باکتریایی با اشعه فرابنفش و اسید نیترو، با شمارش تعداد کلونی‏های تشکیل شده، ‏منحنی دوز- بقا در مقابل زمان رسم شد. مدت زمانی که 99/99 درصد سلول‏ها دچار مرگ شده‏اند به عنوان زمان بهینه ایجاد جهش در نظر گرفته شد (‏16). ‏از آن پس مراحل جهش‏زایی با اشعه فرابنفش و اسید نیترو چندین مرتبه تکرار شد و کلونی‏های جهش‏یافته به دست آمده وارد مرحله غربال‏گری کیفی و کمی شدند.

غربال اولیه جهش‏یافتگان بر اساس شاخص قطر هاله

در این مرحله از غربال‏گری‏ از شاخص نیمه کمی قطر هاله، ‏برای انتخاب کلونی‏‏هایی که تولید آنزیم آن‏ها بیش از سویه وحشی است استفاده شد. شاخص قطر هاله با تقسیم قطر هاله شفاف ناشی از هیدرولیز گزیلان بر قطر کلونی به دست آمد. پس از خالص‏سازی جهش‏یافتگان، از هر یک از کلونی‏‏ها بر روی محیط گزیلان آگار، ‏دوباره کشت نقطه‏ای داده شد و شاخص قطر هاله کلونی‏ها باشاخص قطر هاله باکتری شاهد مقایسه شد. کلونی‏هایی که نسبت شاخص قطر هاله آن‏ها از سویه والد بزرگتر بود به عنوان کلونی‏های بالقوه پر تولید بررسی و سنجش بیشتر شدند.

غربال ثانویه جهش‏یافته‏ها بر اساس میزان تولید آنزیم گزیلاناز در کشت مایع

جهش‏یافتگان برگزیده شده از مرحله اول به لحاظ میزان تولید آنزیم در محیط کشت مایع سنجش شدند تا میزان تولید آنزیم در آن‏ها با میزان تولید آنزیم سویه وحشی مقایسه شود.برای این منظور در ارلن‏های 250 میلی‏‏لیتری مقدار 50 میلی‏‏لیتر محیط تولید پایه آنزیم گزیلاناز حاوی ‏(‏گرم در لیتر)‏: گزیلان خالص 5، ‏پپتون 5، ‏عصاره مخمر 5، ‏سولفات منیزیم هفت آبه 2/0 و دی‏پتاسیم هیدروژن فسفات 1 تهیه شد. برای تنظیم اسیدیته از محلول 10 درصدکربنات سدیم سترون استفاده شد که به طور جداگانه و پس از اتوکلاو محیط‏های تخمیری به آن‏ها اضافه شد. اسیدیته محیط‏ها روی 7 تنظیم شد (‏21). ‏

سوسپانسیون‏های باکتریایی تازه از جهش‏یافته‏ها با کدورتی معادل 5/0 درجه مک فارلند تهیه و برای تلقیح آماده شدند. سپس، ‏از محیط‏های پیش کشت متعلق به هر یک،‏‏ به میزان ‏(‏v/v) ‏2 درصد وارد محیط‏های تخمیری شد. ارلن‏های محیط کشت تولید آنزیم به مدت 96 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد با دور rpm 160 قرار داده شد. از هر ارلن در فواصل زمانی 24 ساعت نمونه‏گیری انجام شد. نمونه‏های گرفته شده با انتقال به لوله‏های اپندورفدر دور rpm 9000 به مدت 10 دقیقه در سانتریفوژ دارای یخچال با دمای4 درجه سانتی‏گراد سانتریفوژ شد. از عصاره شفاف رویی به‏عنوان منبع آنزیم گزیلاناز خام برای سنجش فعالیت آنزیمی استفاده شد (‏21 و 22). ‏از کشت سویه والد در همان شرایط به عنوان شاهد استفاده شد.

سنجش فعالیت آنزیم گزیلاناز

از محلول ‏(‏w/v) ‏5/0 درصد گزیلان خالص پوسته جو در بافر سدیم فسفات05/0 مولار، ‏اسیدیته 7، ‏به عنوان سوبسترا استفاده شد. میزان 5/0 میلی‏لیتراز سوبسترا به همراه 5/0 میلی‏لیتر ازمحلول آنزیمی، ‏که به میزان مناسبی در بافر فوق رقیق شده بود، ‏به مدت 20 دقیقه در 40 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شد. فعالیت آنزیمی با سنجش میزان قندهای احیا کننده آزاد شده با استفاده از معرف دینیترو سالیسیلیک اسید محاسبه شد‏ ‏(‏‏23 و 24). ‏از منحنی استاندارد قند د-گزیلوز برای تعیین غلظت قندهای آزاد شده استفاده شد‏. یک واحد از فعالیت آنزیمی برابر با مقداری از آنزیم در نظر گرفته شد که موجب آزاد شدن یک میکرومول قند د-گزیلوز از سوبسترای به کار رفته در واکنش در هر دقیقه می‏شد‏ (‏25). ‏

نتایج

همان‏گونه که در شکل شماره 1 مشاهده می‏شود، باکتری والد با نشان دادن هاله شفاف نارنجی رنگ حاصل از تجزیه گزیلان به عنوان تولید کننده آنزیم گزیلاناز معرفی و شناخته شد. قطر کلونی‏های 24 ساعته باکتری از سویه وحشی حداقل 15 میلی‏متر و حداقل قطرناشی از هاله هیدرولیز 25 میلی‏متر بود در نتیجه شاخص قطر هاله آن معادل 6/1 به دست آمد.

 

 

شکل 1- ظهور هاله‏های نارنجی رنگ شفاف تجزیه گزیلان در اثر تولید آنزیم گزیلانازدر سویه وحشی

 

منحنی مرگ سلولی باسیلوس موجاونسیس در اثر اشعه فرابنفش

در شکل 2 منحنی مرگ سلول‏های باسیلوس موجاونسیس در اثر اشعه فرابنفش مشاهده می‏شود. بررسی نمودار نشان می‏دهد پس از 200 ثانیه 99/99 درصد سلول‏ها از بین رفته‏اند. در واقع در منحنی نشان داده شده که در زمان 210 ثانیه احتمال دسترسی به کلونی‏‏های جهش‏یافته در اثر اشعه بالاست. بنابراین، ‏از این پس کلونی‏‏هایی که پس از 210 ثانیه مجاورت با اشعه زنده ماندند، ‏از نظر وقوع جهش مطلوب غربال اولیه و ثانویه شدند.

 

 

شکل 2- تاثیر تابش اشعه فرابنفش بر میزان زنده ماندن سلول‏های باسیلوس موجاونسیس PTCC 1723. ‏

نقاط نمایش داده شده بر اساس میانگین داده‏ها در سه تکرار رسم شده است.

 


منحنی مرگ سلولی باسیلوس موجاونسیس در اثر اسید نیترو

در شکل 3 منحنی مرگ سلول‏های باسیلوس موجاونسیس در اثرتیمار بااسید نیترو مشاهده می‏شود.
با دقت به نمودار برای تعیین دوز بهینه جهش‏زایی اسید نیترو روی باسیلوس موجاونسیس، ‏زمان بهینه تیمار با اسید نیترو 52 دقیقه به دست آمد که طی آن 99/99 درصد سلول‏ها از بین رفتند.


در واقع طبق منحنی نشان داده شده که در زمان 52 دقیقه احتمال دسترسی به کلونی‏‏هایی که در اثر اسید نیترو دچار جهش شده اند حداکثر است. بنابراین، ‏از این پس کلونی‏هایی که پس از 52 دقیقه تیمار با اسید نیترو زنده ماندند، ‏از نظروقوع جهش مطلوب غربال اولیه و ثانویه شدند.

 

 

 

شکل 3-تاثیر محلول اسید نیتروبر میزان زنده ماندن سلول‏های باسیلوس موجاونسیس PTCC 1723.

نقاط نمایش داده شده بر اساس میانگین داده‏ها در سه تکرار رسم شده است.

 

 

 

 

 

شکل 4- نتیجه غربال‏گری‏ اولیه. الف) ‏شاخص قطر هاله در جهش‏یافته‏های اشعه فرابنفش، ‏ب) ‏فراوانی جهش‏یافته‏های اشعه فرابنفش از نظر شاخص قطر هاله، ‏ج) ‏شاخص قطر هاله در جهش‏یافته‏های اسید نیترو، ‏د) ‏فراوانی جهش‏یافته‏های اسید نیترو از نظر شاخص قطر هاله.
نقاط نمایش داده شده بر اساس میانگین داده‏ها در سه تکرار رسم شده است.

 

 

 

 

شکل 5- نتیجه غربال‏گری‏ ثانویه. الف) ‏تولید آنزیم در جهش‏یافته‏های اشعه فرابنفش، ‏ب) ‏فراوانی جهش‏یافته‏های اشعه فرابنفش از نظر تولید آنزیم، ‏ج) ‏تولید آنزیم در جهش‏یافته‏های اسید نیترو، ‏د) ‏فراوانی جهش‏یافته‏های اسید نیترو از نظر تولید آنزیم ‏

نقاط نمایش داده شده در نمودار الف و ج بر اساس میانگین داده‏ها در سه تکرار رسم شده اند.


نتایج غربال اولیه جهش‏یافتگان

طی انجام مرحله اول جهش‏زایی، ‏در مجموع 72 کلونی‏ با جهش مثبت غربال شد که شاخص قطر هاله بزرگتری در مقایسه با باکتری وحشی از خود نشان دادند. همان‏گونه که در شکل 4 مشاهده می‏شود. تعداد 36 سویه پس از تیمار با اشعه فرا بنفش و نیز تعداد 36 سویه پس از تیمار با اسید نیترو با شاخص قطر هاله بزرگتر از سویه وحشی از میان تعداد بیشماری از جهش‏یافتگان غربال شدند. بر اساس شکل 4 قسمت الف و ج، ‏جهش‏یافته شماره 17 با شاخص قطر هاله برابر با 2/3 از بین تیمار شده‏های اشعه فرابنفش و جهش‏یافته شماره 43 با شاخص قطر هاله برابر با 3 از بین تیمار شده‏های اسید نیترو، ‏به‏طور مشخصی شاخص قطر هاله بزرگتری را نشان دادند.

گزینش جهش‏یافته پر تولید:

در راستای انجام آزمایش‏های تاییدی و در مرحله غربالگری ثانویه، ‏میزان کمی تولید آنزیم در جهش‏یافتگان مطلوب سنجش و با میزان آنزیم تولید شده توسط باکتری وحشی مقایسه شد.نتایج این مقایسه در شکل 5 گنجانده شده است. از بین 36 جهش‏یافته به دست آمده از تیمار با اشعه فرابنفش سویه جهش‏یافته شماره 17 به عنوان جهش‏یافته برتر با میزان تولید آنزیمی IU/mL56/330 توانست نسبت به باکتری والد، ‏با میزان تولید اولیه IU/mL 73/95، ‏افزایش تولید 45/3 برابری را نشان دهد.

از طرفی همان‏گونه که در شکل 5 بارز است چندین سویه جهش یافته با میزان تولید آنزیم بالاتری از باکتری وحشی نیز به دست آمدند، ‏از جمله جهش‏یافته پر تولید شماره 43 که ناشی از تیمار سویه والد با اسید نیترو بود؛ زیرا توانست افزایش تولید 3/3 برابری را نسبت به آن نشان دهد. در نتیجه این سویه نیز به لحاظ میزان آنزیم تولید شده که معادلIU/mL 58 /319 است دارای ارزش و اهمیت بوده و نگه‏داری شد. از آنجا که بیش‏ترین میزان تولید آنزیم در سویه والد 48 ساعت پس از گذشت فرایند تخمیر به دست آمد ملاک سنجش و مقایسه میزان تولید آنزیم برای سویه‏های جهش‏یافته نیز همان 48 ساعت در نظر گرفته شد. اگر چه نمونه‏برداری و سنجش میزان تولید آنزیم برای جهش‏یافتگان نیز در زمان‏های 24، ‏48 و 96 ساعته انجام شد، ‏جهش‏یافتگان نیز بالاترین میزان تولید آنزیم را همانند سویه والد پس از گذشت 48 ساعت نشان دادند.

طبق شکل 6 قسمت الف و ب ضریب همبستگی بین نتایج حاصل از غربال‏گری‏ اولیه و ثانویه در تیمار با اشعه فرابنفش و اسید نیترو ‏(‏هر دو با فاکتور آلفا کوچکتر از 001/0) ‏به ترتیب برابر 853/0 و 793/0 بود که نشان دهنده همبستگی قوی بین نتایج این دو مرحله است‏. ضریب تشخیص همبستگی این‏ دو به ترتیب برابر 727/0 و 636/0 محاسبه شد که نشان می‏دهد در 7/72 درصد موارد می‏توان با دانستن نسبت شاخص قطر هاله کلونی‏‏های جهش‏یافته ناشی از تیماربا اشعه فرابنفش، ‏مقدار آنزیم قابل تولید توسط آن‏ها را در غربالگری‏ ثانویه به‏ درستی حدس زد. این احتمال در مورد جهش‏یافتگان ناشی از اسید نیترو6/63 درصداست‏. در هر دو مرحله نیمه کمی و کمی، ‏سویه‏ها اختلاف مشابهی را با والد نشان می‏دهند. به‏علاوه در مرحله دوم اختلاف جهش‏یافتگان با سوش والد خیلی نمایان‏تر است‏. در نهایت جهش‏یافتگانی که میزان تولید آنزیم آن‏ها کمتر از سویه وحشی بود و یا افزایش تولید آنزیم در آن‏ها خیلی چشمگیر نبوده کنار گذارده شدند.

 

 

 

 

شکل 6- همبستگی بین نتایج حاصل از غربال‏گری‏ اولیه و ثانویه. الف) ‏تیمار با اشعه فرابنفش، ‏ب) ‏تیمار با اسید نیترو

 

بحث و نتیجه‏‏گیری

همان‏گونه که مشاهده می‏شودفراوانی جهش‏یافتگان با شاخص قطر هاله 2 تا 2/2 بیش از بقیه است و حدود 45 جهش‏یافته با این حد از شاخص قطر هاله حاصل شده است. در شکل 4 و 5 قسمت ب و دال واضح است که فراوانی آن دسته از جهش‏یافتگان مطلوب که نسبت به والد تنها 5 تا 10 درصد افزایش تولید آنزیم داشتند، ‏بالاست. این کلونی‏‏ها دارای جهش‏های کوچک هستند و احتمال دستیابی به چنین جهش‏هایی در یک فرایند جهش‏زایی زیاد است، ‏اگر چه افزایش میزان تولید آنزیم در آن‏ها در مقایسه با باکتری وحشی خیلی چشمگیر نیست اما می‏توان با روش‏های بهبود سویه‏ای و ایجاد جهش‏های پی در پی در آن‏ها به نتایج مطلوبی در بالاتر بردن توانایی تولید محصول دست یافت. از طرفی دیگر، ‏احتمال دست یافتن به جهش‏یافتگانی با توانایی تولید آنزیم بسیار بیشتر، ‏نسبت به باکتری وحشی، ‏در اولین مرحله بسیار اندک و نیازمند تکرار آزمایش‏های طولانی مدت است‏ به‏طوری‏که ممکن است زمان زیادی صرف دسترسی به چنین جهش‏یافتگانی شودکه به اصطلاح جهش‏های بزرگ گفته می‏شود. اگرچه افزایش تولید محصول در آن‏ها نسبت به باکتری والد بسیار چشمگیر است اما همان‏طور که در شکل 5 ملاحظه می‏شود فراوانی این جهش‏یافتگان بسیار کمتر است. مقایسه افزایش تولید آنزیم در جهش‏یافتگان گویای آن است که تاثیر اشعه فرا بنفش در مقایسه با اسید نیترو در ایجاد جهش‏های مطلوب و کلونی‏‏های پر تولید بیشتر بوده است (‏شکل 4- قسمت ب و دال). ‏نتایج قطعی‏تر را می‏توان با مقایسه نسبت فراوانی جهش‏یافتگانی که میزان آنزیم بیشتری نسبت به باکتری وحشی تولید می‏کنند و ناشی از تیمار با اشعه فرا بنفش هستند ابراز داشت. همان‏گونه که در شکل 5- قسمت ب و دال مشاهده می‏شود، ‏نسبت فراوانی جهش‏یافتگان با میزان تولید آنزیم بین 100 تا 130 واحد بیش از سایر مقادیر است و در این میان، ‏این افزایش تولید، ‏فراوانی بیشتری را در میان جهش‏یافتگان تیمار یافته با اشعه فرا بنفش به خود اختصاص داده است. مقایسه قسمت الف و ج شکل 4 و 5 با یکدیگر می‏رساند که دقیقا آن دسته از جهش‏یافتگان با شاخص قطر هاله بزرگتر از باکتری والد لزوماً آنزیم بیشتری نیز تولید کرده اند و ضریب همبستگی این دو آزمایش بسیار نزدیک شده است. در واقع با دقت به منحنی توزیع فراوانی جهش‏یافتگان با شاخص قطر هاله بزرگتر از والد در شکل 4 قسمت ب و دال و مقایسه آن با منحنی توزیع فراوانی جهش‏یافتگان پر تولید در قسمت بو دال شکل 5 متوجه می‏شویم که بیش از 70 درصد تـوزیع فراوانی جهش‏یافتگان با شاخص قطر هاله بالاتر، ‏با نحوه توزیع فراوانی جهش‏یافتگان پر تولید مطابقت می‏کند. ضریب همبستگی مرحله نیمه کمی و مرحله غربال ثانویه بسیار نزدیک به هم بوده و این می‏رساندکه نتایج برآمده به قدری دقیق بوده که حتی می‏توان گفت نیازی به انجام روش تاییدی نبوده است؛ به عبارتی دیگر اگر چه شاخص قطر هاله یک روش نیمه کمی است، ‏اما نتایج برگرفته از روش کمی کاملاً با آن مطابقت می‏کند. منحنی توزیع فراوانی کل جهش‏یافتگان به دست آمده در حالت تمام شماتیک یک منحنی ناقوسی شکل است. در نمودارهای شکل 4 و 5 توزیع فراوانی جهش‏یافتگان منفی با شاخص قطر هاله کمتر از باکتری والد و توزیع فراوانی کلونی‏‏های بدون جهش نشان داده نشده است. این کلونی‏‏ها در همان مرحله اول از غربال‏گری‏ حذف شده و میزان تولید آنزیم در آن‏ها سنجش نشده است. بنابراین، ‏توزیع فراوانی مشاهده شده در مورد جهش‏یافتگان، ‏فقط متعلق به فراوانی جهش‏یافتگان مطلوب است که دقیقاً پس از باکتری والد و با میزان تولید بیشتر در نمودارهای شکل 4 و 5 مشخص شده اند. اما آنچه در این مورد مهم جلوه می‏کند نحوه توزیع این فراوانی است‏. فراوانی جهش‏یافتگانی که میزان شاخص قطر هاله آن‏ها بالاتر از 6/1 است در شکل 4 قسمت الف و ج گنجانده شده است. نحوه توزیع فراوانی کلونی‏‏های با شاخص قطر هاله بالاتر دقیقاً مشابه توزیع جهش‏یافتگانی است که آنزیم بیشتری نسبت به والد طبق شکل 5 قسمت الف و ج تولید می‏کنند. نتایج قطعی‏تر را می‏توان با دقت به شکل 6 متوجه شد.

شایان ذکر است افزایش تولید گزیلاناز همواره مورد توجه پژوهشگران بوده و برای دستیابی به مقادیر هر چه بالاترآنزیم،‏‏ محققان به راه‏های گوناگونی متوسل شده اند. عده‏ای نظیر آنچه به اختصار در جدول شماره 1 یاد شده است در جستجوی میکروارگانیسم‏هایی هستند که ذاتا توانایی تولید گزیلاناز بالایی را دارند و به طور طبیعی و دست نخورده مقادیر مناسبی از آنزیم را تولید می‏کنند (‏26-28). ‏برخی دیگر به دنبال بالا بردن میزان تولید از سویه‏های میکروبی طی بهینه‏سازی ترکیبات محیط کشت و شرایط تخمیری هستند (‏30 و 29). ‏به عنوان مثال، ‏گزیلاناز باسیلوس موجاونسیس 137 بومی، ‏جداسازی شده از خاک مزرعه پنبه در حوالی کاشان،‏‏ با تولید اولیه حدود IU/mL 68/194، ‏طی بهینه‏سازی ترکیبات محیط کشت و شرایط تخمیر به میزانی معادل IU/mL 466/302 افزایش یافت (‏21). ‏همچنین، ‏در سویه 137-12p از گونه ای از استرپتومایسس، ‏با به کارگیری روش‏های بهینه‏سازی ترکیبات محیط کشت و شرایط تخمیر، ‏افزایش تولید آنزیم تا حدود 27 واحد به دست آمد (‏3). ‏


 

 

جدول 1- مقادیر آنزیم گزیلاناز تولید شده از میکروارگانیسم‏های مختلف

نام محقق

سال

نام میکروارگانیسم

تولیدگزیلاناز

 (‏IU/mL) ‏

الیویرا و همکاران[6] (‏31) ‏

2006

Penicillium janthinelum CRC 87M-115

8/54

پورنا و همکاران[7] (‏26) ‏

2006

Bacillus pumilus

500

کاپورو همکاران[8] (‏27)

2008

MK001 سویهBacillus pumilus

1300

ینگو همکاران[9] (‏7)‏

1995

Bacillus v1-4

52

کوردییرو وهمکاران[10] (‏30)‏

2002

Bacillus thermoglucosidasius

17

اخوان سپهی وهمکاران[11] (‏21)‏

2011

Bacillus mojavensis

466/302

سریدوی و همکاران[12] (‏28)

2011

Trichoderma sp CDC-140

495

پورسوکو همکاران[13] (‏23)

2013

Streptomyces Sp.CA24

255

آنامالی و همکاران[14] (‏33)

2009

Bacillus subtilis

238

دویودی و همکاران[15] (‏4)

2009

Penicillium oxalicumسویه جهش‏یافته SAUE-3.510

5/488

تحقیق حاضر

2013

Bacillus mojavensisجهش‏یافته شماره 17

56/330

 

 

از طرفی برخی دیگر نظیر آنچه در جدول شماره 1 و مثال‏های زیر عنوان شده است با ایجاد جهش در سویه‏های میکروبی سعی در بالا بردن میزان تولید داشتند ‏(‏4). ‏بر اساس گزارش تاسنیم و همکارانش[xvi] در سال 2003 تولیدگزیلاناز از آسپرژیلوسنایجر سویه جهش یافته GCBCX-20، طی روش‏های جهش‏زایی با مواد شیمیایی به حدود IU/mL 200 افزایش یافت، که توانسته بود 7/1 برابر بیش از سویه والد آنزیم تولید کند ‏(‏2). ‏در تحقیقی مشابه در سال 2011 عبدل عزیز و همکارانش[xvii] توانستند با به کار گیری اشعه فرابنفش با طول موج 254 نانومتر به سویه ای جهش یافته از Streptomyces pseudogriseolus دسترسی یابندکه بتواندگزیلاناز را تا 160 درصد بیش از سویه والد تولید کند (‏11). ‏همچنین، ‏در بررسی که توسط اکرام الحق و همکارانش[xviii] در سال 2008 انجام شد نتایج برآمده در روند افزایش تولید آنزیم پس از تیمار قارچ آسپرژیلوس نایجر با جهش‏زای شیمیایی نیتروزوگوانیدین[xix] بسیار کارآمد گزارش شد؛ زیرا منجر به جداسازی سویه جهش‏یافته RH12 با تولید آنزیم به مقدار IU/mL31/172 شد که افزایش 65/1 برابری را نسبت به قارچ وحشی نشان داد. سپس، ‏آن‏ها توانستند آنزیم گزیلاناز تولید شده را ضمن بهینه سازی ترکیبات محیط کشت و شرایط تخمیری در نهایت به IU/mL86/289 برسانند که 7/2 برابر نسبت به میزان اولیه افزایش تولید داشت (‏5). ‏در گزارشی دیگردر سال 2009 تولید گزیلاناز و سلولاز از قارچ والد نروسپورا کراسا[xx]توسط محققانی چون رحیم و همکارانش[xxi] بررسی شد. این محققان با به کار گیری روش جهش‏زایی کلاسیک و به کار بردن عواملی نظیر اشعه فرابنفش با طول موج 254 نانومتر به یک سویه جهش یافته دست یافتند که اگر چه توانایی بیشتری در تولید این دو آنزیم را دارد اما این افزایش تولید در مقایسه با سویه والد خیلی چشمگیر نبود (‏34). ‏همچنین، ‏محققان از این روش‏ها در بالا بردن میزان تولید دیگر آنزیم‏های با ارزش صنعتی و بیوتکنولوژیکی نظیر پروتئازها ‏(‏13)، ‏لیپاز ‏(‏20)، ‏آمیلازها ‏(‏12-15 و 35) ‏سلولازها ‏(‏10، ‏34 و 36-39)، ‏پولولاناز ‏(‏40)، ‏کیتیناز ‏(‏18)، ال- آسپاراژیناز ‏(‏41) ‏و سایر آنزیم‏های با ارزش از جهش کلاسیک بهره جسته اند. گرایش در استفاده از این روش‏ها در بالا بردن تولیدات میکروبی با ارزش دیگر نظیر اسید کلاوولانیک ‏(‏1)، ‏ملانین ‏(‏42)، ‏استوئین ‏(‏19)، ‏باسیتراسین ‏(‏43)، ‏بیواتانل ‏(‏16)، ‏تولید زایلیتول و اتانل ‏(‏44) ‏و دیگر متابولیت‏های ضد میکروبی نیز مشاهده می‏شود ‏(‏45). ‏

همان‏گونه که در جدول شماره 1 مقایسه شده است، ‏سویه جهش‏یافته باسیلوس موجاونسیس شماره 17 با تولید آنزیم IU/mL 56/330 قابلیت بالایی برای استفاده در فرایندهای تجاری دارد. هدف از این مراحل رسیدن به جهش‏یافته پرتولید بوده تا با اعمال فرایند بهینه‏سازی شرایط تخمیر و ترکیبات محیط کشت بتوان میزان تولید آنزیم را بیش از بیش بالا برد. بنابراین، ‏پرتولید‏ترین جهش‏یافته ‏(‏جهش‏یافته شماره 17) ‏انتخاب شده تا برای انجام مراحل بعدی تحقیقات از آن استفاده شود و میزان تولید آنزیم بالاتر رود.

تشکر و قدردانی

به این وسیله از سازمان پژوهش‏های علمی و صنعتی ایران بابت تهیه امکانات و تجهیزات لازم برای انجام این پروژه صمیمانه سپاسگزاری می‏شود‏. همچنین، ‏از سرکار خانم سپیده شکری به دلیل همکاری‏های ارزنده‏شان در انجام آزمایش‏ها تشکر و قدردانی ویژه می‏شود‏.

 



[1]- Ultra Violet Light

[2]- PTCC: Persian Type Culture Collection

[3]- Xylanase

[4]- Fluka

[5]-H/C: Hallow zone diameter/ Colony diameter

[6]- Oliveira et al

[7]- Poorna et al

[8]- Kapoor et al

[9]- Yang et al

[10]- Cordeiro et al

[11]- Akhavan Sepahi et al

[12]- Sridevi et al

[13] - porsuk et al

[14]- Annamali et al

[15]-Dwiwdei et al

[xvi]- Tasneem et al

[xvii]- Abdel-Aziz et al

[xviii]- Haq et al

[xix]- Nitrosoguanidine

[xx]- Neurospora crassa

[xxi]- Rahim et al

 

 

 

References

(1)  Korbekandi H, Darkhal P, Hojati Z, Abedi D, Hamedi J, Pourhosein M. Overproduction of Clavulanic Acid by UV mutagenesis of Streptomyces clavuligerus. Iranian Journal of Pharmaceutical Research 2010; 9 (2): 177-81.

(2)  Tasneem M, Khan A, Ashraf H, Haq I. Xylanase Biosynthesis by chemically mutated strain of Aspergillus niger.Journal of Food Technology 2003; 1 (4): 178-81.

(3)  Coman G and Bahrim G. Minimizing cellulase biosynthesis from cellulase–free xylanase production with Streptomyces ssp. P12-137 using optimization by response surface methodology. Cellulose chemistry and technology 2011; 45 (3-4): 245-50.

(4)   Dwivedi P, Vivekanand V,Ganguly R, Singh R P. Parthenium sp. as a plant biomass for the production of alkalitolerant xylanase from mutant Penicilliumoxalicum SAUE-3.510 in submerged fermentation. Biomass & Bioenergy 2009; 33: 581-8.

(5)   HAQ I,Hussain R, Hameed U, and Javad M. Selection of Aspergillus niger mutant using antimetabolite 2-deoxy D-glucose after N-methyl N-nito N-nitroso guanidine (MNNG)  treatment. Pakistan Journal of Botany 2008; 40 (6): 2613-23.

(6)  Sa-Pereira P, Mesquita A, Duarte JC, Aires Barros MR, Costa-Ferreira M. Rapid production of thermostable Cellulase-free xylanase by a strain of Bacillus subtilis and its properties. Enzyme and Microbial Technology 2002; 30: 924-33.

(7)    Yang VW, Zhuang Z, Elegir G, Jeffries TW. Alkaline-active xylanase produced by an alkaliphilic Bacillus sp isolated from Kraft pulp. Journal of Industrial Microbiology 1995; 15: 434-41.

(8)   Guimarães NCA, Sorgatto M, Peixoto-Nogueira SC, Betini JHA, Zanoelo FF, Marques MR, Polizeli MLTM, and Giannesi GC. Xylanase production from Aspergillus japonicus var aculeatus: Production using Agroindustrial Residues and Biobleaching Effect on Pulp.Journal of Biocatalysis and Biotransformation 2013; 2 (1): 1-6.

 

(9)  Terrasan CRF, Temer B, Sarto C, Silva Junior FG, Carmona EC. Xylanase and B-Xylosidase from Penicillium janczewskii: Production, Physico-chemical Properties, and application of the crude extract to pulp Biobleaching.BioResources 2013. 8 (1): 1292-305.

(10)   Muhammad M.J, Haq I, Irfana M. Multistep mutagenesis for the over-expression of cellulase in Humicola insolens. Pakistan Journal of Botany 2011; 43 (1): 669-77.

(11)   Abdel-Aziz MS, Talkhan FN, Fadel M, AbouZeied AA, and Abdel-Razik AS. Improvement of xylanase production from Streptomyces Pseudogriseolus via UV mutagenesis. Australian Journal of Basic & Applied Sciences 2011; 5 (5): 1045-50.

(12)  HAQ I, Ali S, Javed MM, Hameed U, Saleem A, Adnan F, et al. Production of alpha amylase from a randomly induced mutant strain of Bacillus amyloliquefaciens andits application as a desizer in textile industry. Pakistan Journal of Botany 2010; 42 (1): 473-84.

(13)  Nadeem M, Qazi JI, Baig SH. Enhanced production of alkaline protease by a mutant of Bacillus licheniformis N-2 for dehairing. Brazilian Archives of Biology and Technology 2010; 53 (5): 1015-25.

(14)  Abo-State M.A.M, Ghaly M.F, and Abdellah E.M. Optimization of Cellulase (s) and Xylanase Production by Thermophilic and Alkaliphilic Bacillus Isolates. American-Eurasian Journal of Agricultural & Environmental Sciences 2013; 13 (4): 553-64.

(15)   Azin M, Noroozi E. Random mutagenesis and use of 2-deoxy-D-glucose as an antimetabolite for selection of α-amylase-overproducing mutants of Aspergillus oryzae. World Journal of Microbiology & Biotechnology 2001; 17: 747-50.

(16)  Zarif B, Azin M, Amirmozafari N. Increasing the bioethanol yield in the presence of furfural via mutation of a native strain of Saccharomyces cerevisiae. African Journal of Microbiology Research 2011; 5 (6): 651-6.

(17)  Thein A, Prathuangwong S. Novel strains of Xanthomonas oryzae pv. oryzae UV mutated induce systemic resistance in rice against bacterial leaf blight disease. Kasersart Journal (Natural Science) 2010; 44: 1026-43.

(18)  Aly MM, Tork S, Alakilli SY. Molecular characterization of chitiniolytic Bacillus pumilus isolated from marine habitats and enhancement of chitinase production by mutation. Universal scholar in Biotechnology 2011; 1 (2): 14-21.

(19)   Xu H, Jia SH, Liu J. Development of a mutant strain of Bacillus subtilis showing enhanced production of acetoin. African Journal of Biotechnology 2011; 10 (5): 779-88.

(20)  Tehreema I, Mubashir N, Seyed Qaiser A, Muhammad AZ, Iffat A, Kyejoon L, et al.Mutation induced enhanced biosynthesis of lipase by Rhizopus oligosporus var. microsporus. Pakistan Journal of Botany 2010; 42 (2) :1235-49.

(21)    Akhavan Sepahi A, Ghazi SH, Akhavan Sepahi M. Cost effective production and optimization of alkaline xylanase by indigenous Bacillus mojavensis AG137 fermented on agricultural waste. Enzyme Research 2011; 10 (11): 1-9.

(22)   Khandepakar RDS, Bhosle NB. Isolation, Purification and characterization of the Xylanase produced by Arthrobacter sp. MTCC5214 when grown in solid state fermentation. Enzyme and Microbial Technology 2006; 39: 732-42.

(23)   PORSUK I, ÖZAKIN S, BALİ B, İNCE YILMAZ E. A cellulase-free, thermoactive, and alkali xylanase production by terrestrial Streptomyces sp. CA24. Turkish Journal of Biology 2013; 37: 370-5.

(24)    Bailey M J M, Biely P, Poutanen k. Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity. Journal of Biotechnology 1992; 23: 257-70.

(25)  Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Annual Chemistry 1959; 31 (3): 426-8.

(26)  Poorna CA, Prema P. Production and partial characterization of endoxylanase by Bacillus pumilus using agro industrial residues. Biochemical Engineering Journal 2006; 33: 106-12.

(27)  Kapoor M, Nair LM, Kuhad RC. Cost-effective xylanase production from free and immobilized Bacillus pumilus strain MK001 and its application in saccharification of Prosopis juliflora. Biochemical Engineering Journal 2008; 38: 88-97.

(28) Sridevi B and Charya MAS. Isolation, identification and screening of potential cellulase free xylanase producing fungi. African Journal of Biotechnology 2011; 10 (22): 4624-30.

(29)  Gupta G, Sahai V, Gupta RK. Optimization of xylanase production from Melanocarpus albomyces using wheat straw extract and it’s scale up in stirred tank bioreactor. Indian Journal of Chemical Technology 2013; 20:282-9.

(30)  Sugumaran KR, Kiran Kumar B, Mahalakshmi M, Ponnusami V. Cassava bagasse- Low cost substrate for thermotolerant xylanase production using Bacillus subtilis. International Journal of Chemical Technology Research 2013; 5 (1): 394-400.

(31) Oliveira LA. Production of xylanase and protease by Penicillium janthinellum CRC 87M-115 from different agricultural wastes. Bioresource Technology 2006; 97: 862-7.

(32) Cordeiro CAM, Martins MLL, Luciano AB, Da Silva RF. Production and properties of xylanase from thermophilic Bacillus sp. Brazilian Archives of Biology and Technology 2002. 45 (4): 413-8.

(33) Annamalai N, Thavasi R, Jayalakshmi S, Balasubramanian T. Thermostable and alkaline tolerant xylanase production by Bacillus subtilis isolated from marine environment. Indian Journal of Biotechnology 2009; 8: 291-7.

(34) Rahim T, Ray AL, Beauty SP, Gomes DJ. Induction of mutation in Neurospora crassa with Ultraviolet radiation and evaluation of cellulase and xylanase activities. Bangladesh Journal of Boiology 2009; 38 (2): 201-3.

(35) HAQ I, Ali S, Saleem A, and Javed MM. Mutagenesis of Bacillus licheniformis through ethyl methanesulfonate for Alha amylase production. Pakistan Journal of Botany 2009; 41 (3): 1489-98.

(36) Kotchoni S, Gachmo EW, Omafuvbe BO, Shonukan OO.Purification and biochemical characterization of carboxymethyl cellulose (CMCase) from a catabolite repression insensitive mutant of Bacillus pumilus. International Journal of Agriculture and Biology 2006; 8 (2): 286-92.

(37) Li XH, Yang HJ, Roy B, Park EY, Jiang LJ, Wang D, et al. Enhanced cellulase production of the Trichoderma viride mutated by microwave and ultraviolet. Microbiological Research 2009; 10:1-10.

(38) Hao XC, Yu XB, Yan ZL. Optimization of the medium for the production of cellulase by the mutant Trichoderma reesei WX-112 using response surface methodology. Food Technology and Biotechnology 2006; 44 (1): 89-94.

(39) Reddi Pradeep M and Narasimha G. Utilization of pea seed husk as a substrate for cellulase production by mutant Aspergillus niger. Insight Biotechnology 2011; 1 (2): 17-22.

(40)Nair SU, Singhal RS, Kamat MY. Enhanced production of thermostable Pullulanase type 1 using Bacillus cereus FDTA 13 and its mutant. Food Technology and Biotechnology 2006; 44 (2): 275-82.

(41)Amena S, Lingappa K, Prabhakar M, Vishalakshi N. Production of L-Asparaginase by strain improvement and whole-cell immobilization of Streptomycesgulbargensis. Journal of the Renin Angiotensin Aldosterone System 2012; 27: 93-8.

(42)Abdel Latif HAM, Abdel Fatah MR, Sabbour MM, El-Sharkawey AZ, El-sayed RS. Genetic modification of Bacillus thuringiensis var Kurstaki HD-73 to overproduce melanin, UV resistance and their insecticidal potentiality against potato tuber moth. International Journal of Academic Research 2010; 2 (6): 73-81.

(43)Aftab MN, Haq I , Baig SH. Enhanced production of bacitracin by a mutant strain Bacillus licheniformis UV-MN-HN-8 (Enhanced bacitracin production by mutagenesis). Pakistan Journal of Botany 2010; 42 (3): 2095-103.

(44)Usama F, Ali, Zeinab M, Ibrahim, and Georg S, Isaac. Ethanol and Xylitol Production from Xylanase Broth of Thermomyces Lanuginosus Grown on Some Lignocellulosic Wastes using Candida tropicalis EMCC2. Life Science Journal 2013; 10 (1): 968-78.

(45)Radha Krishna E, Shamsher Kumar P, Veerendra Kumar B. Strain improvement of selected strain Bacillus subtilis (MTCC No.10619) for enhanced production of antimicrobial Metabolites. Journal of Microbiology and Biotechnology Research 2011; 1 (3): 32-8.