تجزیه زیستی سیانید توسط باکتری سراشیا جداشده از خاک آلوده معدن طلا در تکاب

نویسندگان

1 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه مازندران، بابلسر، ایران

2 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه مازندران، بابلسر، ایران

چکیده

  مقدمه: سیانید ترکیبی سمی و بسیار خطرناک برای موجودات زنده است که به طور گسترده توسط بشر تولید شده و موجب آلودگی محیط زیست می‌شود. بهترین روش برای تجزیه سیانید موجود در پساب صنایع، تجزیه زیستی است. جداسازی باکتری‌های بومی تجزیه کننده سیانید از خاک آلوده و مطالعه توانایی آن‏ها در تجزیه سیانید، از اهداف این پژوهش بود‏‏.   مواد و روش‏‏ها: پس از جمع‌آوری نمونه‌های خاک، غنی‌سازی باکتری‌های تجزیه کننده سیانید در محیط کشت پایه حاوی نیم میلی‌مولار پتاسیم سیانید انجام شد. توانایی باکتری جدا شده در استفاده از سیانید به عنوان تنها منبع کربن و نیتروژن بررسی شد. تجزیه سیانید و تولید آمونیاک در محیط کشت توسط روش پیکریک‏اسید ونسلر، سنجیده شد. برای بررسی سمیت ترکیبات مختلف سیانیدی بر رشد باکتری، از روش حداقل غلظت مهارکنندگی رشد استفاده شد. همچنین، توانایی باکتری جداشده در استفاده از ترکیبات مختلف سیانیدی، بررسی شد. شناسایی باکتری جدا شده به کمک بررسی مشخصات ریخت‏شناسی، فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و نیز تحلیل‏ مولکولی، انجام شد.   نتایج: از خاک آلوده معدن طلا، باکتری با توانایی تجزیه سیانید به عنوان تنها منبع کرین و نیتروژن، جداسازی شد. این باکتری با عنوان جدایه MF1 نام ‏ گذاری شد. جدایه MF1 سیانید محیط رشد را در شرایط قلیایی، پس از 40 ساعت تجزیه کرد. همچنین، این جدایه توانایی تحمل بیش از هفت میلی‌مولار سیانید پتاسیم را داشت. نتایج نشان داد که کاهش غلظت سیانید با افزایش غلظت آمونیاک در محیط رشد و نیز رشد جدایه MF1 ، ارتباط مستقیم دارد. همچنین، باکتری جداشده، توانایی استفاده از ترکیبات مختلف سیانیدی به عنوان تنها منبع کربن و نیتروژن را نشان داد. نتایج بررسی مشخصات ریخت‏شناسی و فیزیولوژیکی جدایه MF1 ، نشان داد این باکتری به جنس سراشیا متعلق بود. بررسی توالی ژن 16S rDNA و رسم درخت فیلوژنی نیز نشان داد که جدایه MF1 دارای 99 درصد هومولوژی با سراشیا نماتودیفیلا بود.   بحث و نتیجه‏گیری: نتایج نشان داد باکتری جدا شده، گزینه مناسبی برای تجزیه زیستی سیانید در شرایط قلیایی است. این باکتری می‌تواند برای تجزیه سیانید از پساب صنایع و مکان‏های آلوده، معرفی شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Biodegradation of cyanide using Serratia sp. isolated from contaminated soil of gold mine in Takab

نویسندگان [English]

  • Mojtaba Mohseni 1
  • Sajad Firuzyar 2
1 Assistant Professor of Microbiology, University of Mazandaran, Babolsar, Iran
2 M.Sc. of Microbiology, University of Mazandaran, Babolsar, Iran
چکیده [English]

  Introduction : Cyanide is a toxic and hazardous compound for all organisms which is produced enormously by human being and causes the environment pollution. Biodegradation is the best method for cyanide elimination in industrial wastewater. The aims of this study were isolation of cyanide degrading bacteria from contaminated soil and investigation of their ability for cyanide degradation.   Materials and methods: After soil samples collection, enrichment of cyanide degrading bacteria was performed in a minimal medium containing 0.5 mM potassium cyanide. The ability of isolated bacterium to utilize the cyanide as sole carbon and nitrogen source was investigated. Cyanide degradation and ammonium production was determined in growth medium using picric acid and Nessler’s regent methods. Toxicity effect of different cyanide compounds on bacterial growth was determined using minimum inhibitory concentration. In addition, the ability of the isolated bacterium to utilize different cyanide compounds was investigated . Identification of the isolate was undertaken using morphological, physiological and biochemical characteristics and molecular analysis .   Results : A bacterium with ability to degrade cyanide as sole carbon and nitrogen source was isolated from soil. This bacterium named as isolate MF1. MF1 degraded cyanide in growth medium in alkaline condition after 40 hours. Moreover this isolate tolerated more than 7 mM potassium cyanide. The results showed that there was a direct relation between decreasing of cyanide concentration, increasing of ammonia concentration and growth of MF1. In addition, the isolated bacterium demonstrated the ability to utilize different cyanide compounds as sole carbon and nitrogen source. The results of morphological and physiological characteristics showed that this bacterium belonged to the Serratia sp. Moreover, 16S rDNA sequencing and phylogenetic analyses exhibited that MF1 strain was similar to Serratia nematodiphila with 99% homology .   Discussion and conclusion : The results demonstrated that the isolated bacterium is a suitable candidate for degradation of cyanide in alkaline condition. This bacterium could introduce for treatment of industrial wastewater and sites that contaminated with cyanide.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Biodegradation
  • Cyanide
  • Serratia
  • Wastewater

مقدمه

سیانید یک ترکیب نیتروژن‌دار است که برای بیشتر موجودات به شدت سمی است (1). در طبیعت بسیاری از قارچ‌ها، باکتری‌ها، جلبک‌ها وگیاهان قادر به تولید ترکیبات سیانید هستند ولی بیش‏‌ترین تولید‌کننده این آلاینده در طبیعت، فعالیت‌ انسان است (2). ترکیبات سیانید به طور گسترده در صنایع شیمیایی مختلف از جمله استخراج فلزات، آب‏کاری، تبخیر زغال سنگ و تولید الیاف مصنوعی استفاده می‏شود (3). سالانه بیش از 834 هزار تن سیانید به وسیله صنایع مختلف در کشور آمریکا مصرف می‌شود (4). همچنین، سیانید به شکل گسترده در صنایع استحصال فلزات گران‌بها نظیر طلا و نقره استفاده می‌شود (5). به این ترتیب حجم در خور توجهی از پساب حاوی سیانید صنایع مختلف وارد طبیعت شده و با آلوده کردن خاک و آب‌های زیرزمینی موجب صدمات جبران ‌ناپذیری به محیط زیست می‌شود. برای مثال‏ شکست سد باطله در معدن بایا[1]در کشور رومانی، باعث ورود یک‏صد هزار متر مکعب سیانید به رودخانه تیزسا شد که باعث مرگ موجودات آب‏زی و حیوانات اطراف رودخانه شد (6). در بدن انسان و سایر موجودات زنده، سیانید به شکل برگشت‌‌ ناپذیر به پروتئین‌های دارای آهن مانند سیتوکرم‌های زنجیره تنفسی متصل شده و می‌تواند موجب مسمومیت و حتی مرگ شود (7). روش‌های مختلفی برای حذف سیانید از پساب آلوده استفاده می‏شود. از جمله می‌توان به حذف شیمیایی با استفاده از هیدروژن پراکسید (8 و 9)، سولفور‌دی‌اکسید (10) و کلریزاسیون قلیایی (8) اشاره کرد. این روش‌ها دارای معایبی از جمله تولید محصولات جانبی نامطلوب و هزینه زیاداست. امروزه استفاده از روش‌های زیستی برای تجزیه آلاینده‌های سیانیدی مورد توجه قرارگرفته است. روش‌های زیستی بسیار کارا، مناسب و کم هزینه‌اند (4). سیانید در شرایط خنثی و اسیدی تبدیل به گاز هیدروژن سیانید می‌شود ولی در شرایط قلیایی پایدار است (11). اگر چه میکرو‌ارگانیسم‌هایی که توانایی سم‌زدایی و تجزیه سیانید آزاد و یا کمپلکس‌های سیانید- فلز را در شرایط خنثی یا اسیدی داشتند، تاکنون شناسایی شدند (12)، اما تحقیقات اندکی برای جداسازی باکتری‌های تجزیه کننده سیانید در شرایط قلیایی انجام شده است. در این تحقیق، جدایه باکتریایی با توانایی مصرف سیانید، از خاک آلوده معدن طلا جداسازی شد. به منظور معرفی این باکتری برای استفاده در تجزیه سیانید در پساب آلوده، توانایی این جدایه در تجزیه سیانید به عنوان تنها منبع کربن و نیتروژن (در شرایط قلیایی) بررسی شد.

 

مواد و روش‏ها

غنی‌سازی و جداسازی باکتری‌های تجزیه‌کننده سیانید

پس از جمع‌آوری خاک آلوده به سیانید معدن طلای پویا زرکان واقع در آذربایجان غربی و انتقال آن به آزمایشگاه، مقدارپنج گرم خاک در 45 میلی‌لیتر محلول نرمال سالین حل شد. برای غنی‌سازی باکتری‌های تجزیه‌کننده سیانید، حجم یک میلی‏‏لیتر نمونه خاک حل شده به محیط کشت حداقل (حاوی 6 گرم Na2PO4، 3‌ گرم KH2PO4، 1‌ گرم NaCl، 01/0‌ گرم CaCl2، 5/0‌ گرم MgSO4، 04/0‌ گرم FeSO4,7H2O و 0015/0 گرم MnSO4 در یک لیتر آب مقطر و 5/0 میلی‌مولار پتاسیم سیانید) افزوده شد (13). اسیدیته محیط کشت به وسیله محلول آمونیوم کلراید 3 مولار، در 9 تنظیم شد. ارلن‌ها در دمای 30 درجه سانتی‌گراد و 180 دور در دقیقه، به مدت 48 ساعت گرمخانه‌گذاری شدند. پس از سه کشت متوالی در محیط کشت حداقل، غنی‌سازی میکروارگانیسم‌های تجزیه کننده سیانید انجام شد. برای جداسازی باکتری‌های تجزیه کننده سیانید، کشت غنی‌شده به محیط کشت سفت حداقل حاوی 5/1 درصد آگار و 5/0میلی‏‏مولار پتاسیم سیانید، تلقیح شد. پلیت‌ها در دمای30 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 ساعت گرمخانه‌گذاری شدند (13).

سنجش تجزیه زیستی سیانید و رشد باکتری

برای بررسی تجزیه سیانید موجود در محیط کشت حداقل (حاوی دو میلی‌مولار سیانید) در شرایط قلیایی (اسیدیته=9)، از روش رنگ سنجی پیکریک‏اسید استفاده شد (14). در حضور سیانیدآزاد، پیکریک‏اسید به رنگ‌های ایزوپروپیک اسید تبدیل می‌شود و شدت رنگ رابطه مستقیم با غلظت سیانید آزاد دارد. حجم 1/0 میلی‌لیتر محیط کشت به محلول 5/0 درصد (w/v) پیکریک‏اسید و 25/0مولار سدیم کربنات اضافه شد و به مدت پنج دقیقه در حمام آب گرم 99 درجه سانتی‌گراد گذاشته شد. سپس، با افزودن آب دیونیزه به حجم یک میلی‌لیتر رسانده شد و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق، خنک شد. جذب نوری محلول در طول موج520 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر، خوانده شد. همچنین، برای اندازه‌گیری مقدار آمونیاک آزاد شده در محیط رشد از روش نسلر[2] (کیت سنجش آمونیاک، شرکت کاریزآب) استفاده شد و پس از انجام مراحل طبق دستورالعمل کیت جذب نوری در طول موج 420 نانومتر اندازه‌گیری شد. منحنی استاندارد به وسیله آمونیوم کلراید رسم شد (15).


بررسی اثر سمیت ترکیبات مختلف سیانیدی

برای بررسی سمیت ترکیبات مختلف سیانیدی از آزمون سنجش حداقل غلظت مهارکنندگی رشد باکتری[3] (MIC) استفاده شد. در این روش به 10 میلی‏‏لیتر محیط کشت مایع LB (حاوی 10 گرم تریپتون، 5 گرم عصاره مخمر، 5 گرم سدیم کلراید و 1 گرم گلوکز در یک لیتر آب مقطر)، غلظت‌های مختلف ترکیبات سیانیدی شامل KSCN، NaCN، KCN و K4Fe (CN)6 اضافه شد (16). پس از تلقیح باکتری، لوله‌ها در دمای 30 درجه سانتی‌گراد و 180 دور در دقیقه، به مدت 24 تا 48 ساعت گرمخانه‌گذاری شدند.

توانایی تجزیه ترکیبات مختلف سیانیدی

توانایی جدایه باکتریایی در استفاده از ترکیبات سیانیددار آلی و غیرآلی به عنوان تنها منبع کربن و نیتروژن، بررسی شد. پس از شستشو جدایه با بافر فسفات استریل، حجم 5/0 میلی‌لیتر سوسپانسیون باکتریایی (108 باکتری در میلی‌لیتر) به 50 میلی‌لیتر محیط کشت حداقل حاوی دو درصد (w/v) ترکیبات مختلف سیانیدی شامل استونیتریل، KSCN ،NaCN و K4Fe(CN)6 تلقیح و در دمای30 درجه سانتی‌گراد و 180دور در دقیقه، به مدت 48 ساعت گرمخانه‌گذاری شد. توانایی استفاده جدایه باکتریایی از ترکیبات مختلف به وسیله سنجش رشد توسط اسپکتروفتومتردر 600 نانومتر اندازه‌گیری شد (17). تمام آزمایش‌ها با سه بار تکرار انجام شدند.

شناسایی باکتری تجزیه کننده سیانید

شناسایی باکتری جداشده، بر اساس صفات ریخت‏شناسی و فیزیولوژیکی انجام شد. ویژگی‌های ریخت‏شناسی جدایه تجزیه کننده سیانید روی محیط کشت نوترین آگار (مرک[4]، آلمان) بررسی شد. پس از رنگ آمیزی گرم، شکل باکتری‌ها و واکنش گرم آن‏ها مطالعه شد. همچنین، آزمون‌های بیوشیمیایی شامل فعالیت کاتالازی، اکسیدازی و دکربوکسیلازی، تولید اندول، مصرف گلوکز از مسیر تخمیر اسیدهای مخلوط (متیل رِد[5]) یا مسیر تخمیر بوتاندیول (وژز-پروسکوئر[6])، تولید پیگمان، تولید اسید از قندهای مختلف، تولید سولفید هیدروژن، مصرف سیترات، هیدرولیز اوره و ژلاتین، احیای نیترات انجام و حرکت باکتری مطابق جداول شناسایی کتاب سیستماتیک باکتریولوژی بِرگی[7]، بررسی شد (18). تمام آزمایش‌ها با سه بار تکرار انجام شدند.

استخراج نوکلئیک اسید

برای بررسی مولکولی باکتری‌ جدا شده، DNA ژنومی به کمک روش استاندارد، استخراج شد (19). ابتدا دیواره‌ سلولی باکتری‌ها با دترجنت هگزادسیل‌تری‌متیل‌آمونیوم بروماید (CTAB) (مرک، آلمان) متلاشی شد. سپس، از محلول فنل: کلروفرم: ایزوآمیل الکل (به نسبت 1:24:25) برای حذف پروتئین‌ها و قند‌ها استفاده شد. برای رسوب نوکلئیک‏اسید از محلول نمکی پلی اتیلن گلیکول و نیز برای شستشو و حذف سایر ناخالصی‌ها از اتانول خالص استفاده شد. درستی استخراج نوکلئیک‌اسید، با استفاده از الکتروفورز ژل آگاروز 8/0 درصد و رنگ‌آمیزی شده با اتیدیوم برماید، بررسی شد (20).

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ژن 16S rDNA

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ژن 16S rDNA باکتری تجزیه کننده سیانید، مطابق برنامه‌ زیر انجام شد (21). همچنین، الیگونوکلئوتید پرایمرهای استفاده شده برای تکثیر ژن 16S rDNAشامل پرایمرهای عمومی
PA- F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) و PH- R (5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′) بود. دمای دناتوراسیون اولیه 95 درجه سانتی‌گراد و به مدت 5 دقیقه بود. سپس، 35 چرخه شامل: یک دقیقه دمای 95 درجه سانتی‌گراد، یک دقیقه دمای50 درجه سانتی‌گراد و یک و نیم دقیقه دمای72 درجه سانتی‌گراد انجام شد. در نهایت برای تکمیل واکنش ساخت DNA، دما به مدت 5 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد نگه داشته شد. درستی انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ژن
16S rDNA با الکتروفورز ژل آگاروز 8/0 درصد رنگ آمیزی شده با اتیدیوم برماید، تأیید شد.

تخلیص محصول واکنش زنجیره‌ای پلیمرازبه کمک کیت تخلیص GeneJet[8] انجام شد. سپس توالی
ژن 16S rDNA توسط شرکت GATC آلمان تعیین شد. نتایج توالی نوکلئوتیدها به کمک نرم افزار Chromas Lite (نسخه 01/2) دوباره بررسی شد. شباهت توالی نوکلئوتیدهای ژن 16S rDNAجدایه تجزیه کننده سیانید به کمک نرم‌افزار BLAST با توالی‌های ثبت شده در پایگاه اطلاعاتی ژنومی GenBank و EzTaxon-e مقایسه شد (22). به این ترتیب نزدیک‌ترین سویه‌ها با ترادف 16S rDNA جدایه MF1، تعیین شد. همچنین، توالی به‏دست آمده در این پژوهش در بانک ژنی NCBI ثبت و شماره دستیابی ژنی[9] مربوطه دریافت شد.

تحلیل فیلوژنی باکتری تجزیه کننده سیانید با باکتری‌های نزدیک به آن با نرم‌افزار  ClustalX(نسخه 2) انجام شد. درخت فیلوژنی توالی جدایه MF1 با توالی حاصل از جستجو در پایگاه اطلاعاتی Genbank و EzTaxon-e، به کمک نرم‌افزار MEGA5 و با الگوریتم Maximum likelihood و joiningNeighbour نیز رسم شد. بررسی اعتبار شاخه با الگوریتم bootstrap analysis و با 1000 بار نمونه‌گیری انجام شد.

نتایج

برای جداسازی باکتری‌های تجزیه کننده سیانید در شرایط قلیایی، غنی‏سازی خاک آلوده معدن طلا در محیط کشت حداقل و حاوی سیانید (اسیدیته= 9) انجام شد. برای افزایش جمعیت باکتری‌های تجزیه کننده سیانید، غنی‏سازی محیط رشد با انتقال به محیط کشت تازه استریل انجام شد. پس از سه بار غنی‌سازی، تعداد سه جدایه با توانایی استفاده از سیانید به عنوان تنها منبع کربن و نیتروژن توسط محیط کشت آگاردار حداقل و حاوی سیانید، جداسازی و خالص‏سازی شد. پس از بررسی اولیه توانایی جدایه‌ها در تجزیه سیانید، جدایه به نام MF1 برای ادامه مطالعه انتخاب شد.

تجزیه سیانید با روش اندازه‏گیری پیکریک‏اسید بررسی و غلظت سیانید باقیمانده در محیط کشت، سنجش شد. نتایج سنجش تجزیه سیانید نشان داد که جدایه  MF1توانست سیانید موجود در محیط کشت (2 میلی‏‏مولار سیانید) را پس از 40 ساعت، کاملا تجزیه کند. بیشترین تجزیه در 12 ساعت ابتدای رشد باکتری انجام شد (شکل 1). همچنین، نتایج نشان داد که جدایه MF1 بدون نیاز به منبع کربن و نیتروژن اضافی، توانایی تجزیه سیانید در شرایط قلیایی را داراست.

آمونیاک محصول اصلی تجزیه سیانید است. برای سنجش آمونیاک موجود درمحیط کشت، از روش نسلر استفاده شد. نتایج شکل 2 نشان داد که در طی رشد باکتریMF1، آمونیاک تولید و بیشترین تولید آمونیاک در 12 ساعت ابتدای رشد باکتری، ایجاد شد. این نتیجه با نتایج حاصل از تجزیه سیانید در ساعات اولیه رشد باکتری، مطابقت دارد (شکل 1 و 2).

 

 

 

شکل 1- رشد جدایه  MF1(∎) و تجزیه سیانید (میلی‌مولار) (▲) در محیط کشت حداقل حاوی سیانید (دو میلی‌مولار) در گرمخانه شیکردار
30 درجه سانتی‌گراد. داده‌ها نمایانگر میانگین نتایج سه بار تکرار ± انحراف معیار اند (3=n).

 

 

شکل 2- ارتباط تولید آمونیاک (¿) و تجزیه سیانید (∎) توسط جدایه MF1 در محیط کشت حداقل و حاوی دو میلی‌مولار سیانید در گرمخانه شیکردار 30 درجه سانتی‌گراد

 

 

برای بررسی سمیت ترکیبات مختلف سیانیدی بر باکتری تجزیه کننده MF1، از آزمون سنجش حداقل غلظت مهارکنندگی رشد باکتری (MIC) استفاده شد. نتایج جدول 1نشان داد این جدایه توانایی خوبی در تحمل غلظت‌های بالای ترکیبات سیانیدی را دارد. حداقل غلظت مهارکنندگی رشد ترکیبات سیانیدی K3[Fe(CN)6] و KSCN به ترتیب 170 و 120 میلی‌مولار برای جدایه MF1 بود (جدول 1).

 

جدول 1- حداقل غلظت مهارکنندگی رشد ترکیبات مختلف سیانیدی بر جدایه MF1.

حداقل غلظت (میلی‌مولار)

ترکیبات مختلف سیانیدی

170

K4[Fe(CN)6]

120

KSCN

5/7

KCN

7

NaCN

 

همچنین، توانایی باکتری جدا شده در استفاده از ترکیبات مختلف سیانیدی به عنوان تنها منبع کربن و نیتروژن، بررسی شد. نتایج در جدول 2 خلاصه شده است. جدایهMF1 توانایی رشد روی تمام ترکیبات سیانیدی آزمایش شده به عنوان تنها منبع کربن و نیتروژن، را نشان داد. از میان ترکیبات مختلف سیانیدی، بیشترین رشد جدایه MF1 در حضور K4[Fe(CN)6]، مشاهده شد (جدول 2).

 

جدول 2- توانایی جدایهMF1 در استفاده از ترکیبات مختلف سیانیدی (پس از 48 ساعت گرمخانه‌گذاری).

رشد جدایه (OD600 nm)

ترکیبات سیانیدی

027/0

Acetonitrile

023/0

KSCN

023/0

NaCN

035/0

K3[Fe(CN)6]

 

برای شناسایی باکتری تجزیه کننده سیانید MF1، رنگ‌آمیزی گرم انجام شد و ویژگی‏های ریخت‏شناسی کلونی‏ جدایه، بررسی شد. ریخت‏شناسی کلونی‏ به رنگ کرم، شفاف، براق و نرم بود. نتایج حاصل از رنگ‌آمیزی گرم نشان داد که جدایه به شکل سلول‌های میله‌ای کوتاه و گرم ‌منفی است. همچنین، نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی (جدول3) بر اساس جداول شناسایی کتاب سیستماتیک باکتریولوژی بِرگی (18)، نشان داد که جدایه MF1 به جنس سراشیا[10] متعلق است.

 

 

جدول 3- نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی باکتری تجزیه کننده سیانیدMF1.

آزمون

نتیجه

آزمون

نتیجه

آزمون

نتیجه

Oxidase

-

Hydrogen sulfide production

-

Acid from maltose

+

Indole production

-

Acid from glucose

+

Acid from mannitol

+

Methyl Red

-

Motility

+

Acid from sucrose

+

Voges-Proskaeur

+

Gelatin hydrolysis, 22 °C

+

Nitrate reduction

+

Citrate (Simmons)

+

Acid from lactose

-

Deoxyribonuclease, 25 °C

+

Urea hydrolysis

-

Pigment

-

Catalase production (24 h)

+

 

 

همچنین، شناسایی مولکولی جدایه با استفاده از توالی ژن 16S rDNA بررسی شد. به این منظور واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ژن 16S rDNA انجام شد. پس از تعیین توالی، هومولوژی قطعه ژن 16S rDNA (به طول 1049 نوکلوتید) باکتری‌ تجزیه کننده سیانید با سایر توالی‌های ثبت شده در بانک اطلاعاتی
EzTaxon-e، تعیین شد. نتایج BLAST نشان داد که جدایه MF1 دارای 99 درصد هومولوژی با
 سراشیا نماتودیفیلا[11] بود. توالی ‌ژن 16S rDNA باکتری‌های مشابه و جدایه MF1 به کمک نرم افزار ClustalX، هم‌ردیف‌سازی شد و درخت فیلوژنی آن به روشNeighbor joining  و به کمک نرم افزار Mega5 رسم شد. موقعیت فیلوژنی جدایه MF1 با
 سراشیا نماتودیفیلا در شکل 3 نشان داده شد. توالی ژن 16S rDNA جدایه MF1 نیز در بانک ژنی NCBI به شماره دستیابی ژنی KF476657 ثبت شد.

 

 

 

Citrobacter koseri(NR102823)

 

Escherichia fergusonii (NR027549)

 

Escherichia coli K-12 (NR102804)

 

Erwinia tasmaniensis (HM582879)

 

Enterobacter asburiae (AB675718)

 

Klebsiella variicola B12-12 KF (KF019099)

 

Salmonella enterica (AB680018)

 

Enterobacter cloacae (AJ251469)

 

Yersinia enterocolitica (HE803764)

 

MF1 (KF476657)

 

Serratia nematodiphila KK1 (HQ123466)

 

Serratia nematodiphila (KF036188)

 

Serratia nematodiphila (EU914257)

 

Serratia plymuthica (AB681876)

 

Proteus mirabilis HI4320 (NR074898)

 

Microbacterium oxydans (AY509223)

 

91

 

47

 

100

 

81

 

28

 

31

 

19

 

30

 

41

 

38

 

0. 02

شکل 3- دندوگرام توالی ژن 16S rDNA باکتری تجزیه کننده سیانید MF1 که به جنس سراشیا نزدیکی نشان داد. اعداد ذکر شده در محل انشعاب نشانگر درصد نمونه‌گیری bootstrap از 1000 نمونه است. باکتری Microbacteriumoxydans به عنوان out group قرار داده شد.


بحث و نتیجه‏گیری

امروزه تجزیه زیستی سیانید به عنوان یک روش مقرون به صرفه و سازگار با محیط زیست در مقایسه با روش‌های متداول شیمیایی، مورد توجه قرار گرفته است.
میکروارگانیسم‌های مختلفی با توانایی تجزیه زیستی سیانید، شناسایی و بررسی شده‌اند. جدول 4 میکروارگانیسم‌های مختلف تجزیه کننده سیانید شامل انواع قارچ‌ها، باکتری‌ها و جلبک‌ها را نشان می‌دهد.

 

 

جدول 4- برخی میکروارگانیسم‌های گزارش شده برای تجزیه زیستی سیانید

میکروارگانیسم

منابع

میکروارگانیسم

منابع

Stemphylium loti

23

Pseudomonas diminuta

31

Bacillus stearothermophilus

24

Burkholderia cepacia

17

Pseudomonas fluorescens

25 و 26

Agrobacterium radiobacter

31

Rhizopus oryzae

27

Citrobacter sp.

32

Klebsiella oxytoca

28

Trichoderma sp.

33، 34

Pseudomonas sp.

29

Fusarium oxysporum

35، 36، 37 و 38

Scenedesmus obliquus

30

Bacillus pumilus

39

 

 

سیانید در شرایط اسیدی و خنثی، به شکل گاز هیدروژن سیانید تبخیر می‌شود ولی در شرایط قلیایی پایدار است (11). بنابراین، جداسازی میکروارگانیسم‌ها با توانایی تجزیه سیانید در شرایط قلیایی، می‌تواند برای حذف این آلاینده از محیط زیست، بسیار موثر باشد. در این تحقیق، باکتری‌های تجزیه کننده سیانید، با غنی‏سازی خاک آلوده معدن طلا و تحت شرایط قلیایی، جداسازی شد. برای سنجش تجزیه سیانید، از روش اندازه‌گیری پیکریک‏اسید استفاده شد. این روش برای سنجش سیانید آزاد و کمپلکس‌های ضعیف سیانید- فلز استفاده می‏شود (14). نتایج مطالعه حاضر نشان داد که جدایه MF1 توانست مقدار 132 میلی‌گرم بر لیتر سیانید موجود در محیط کشت (دو میلی‏‏مولار سیانید) را کاملا تجزیه کند. بیشترین تجزیه در 12 ساعت ابتدای رشد باکتری انجام شد. در مطالعه مشابه در سال 2003، کائو[xii] و همکاران تجزیه سیانید با کلبسیلا اُکسیتوکا[xiii]را بررسی کردند. این جدایه 9/0 میلی‌مولار سیانید را در مدت 80 ساعت تجزیه کرد (40). همچنین، در سال 2013، مانیام[xiv] و همکاران تجزیه زیستی سیانید توسط باکتری رودوکوکوس را بررسی کردند.
این باکتری تنها با افزودن منبع کربن و نیتروژن اضافی به محیط رشد، قادر به تجزیه 1/0 میلی‏‏مولار سیانید بود (41). نتایج مطالعه دیگری که از سودوموناس فلورسانس برای تجزیه سیانید استفاده شد، نشان داد که این باکتری علاوه بر توانایی استفاده از یون‌های سیانید آهن به عنوان تنها منبع نیتروژن، 79درصد سیانید محیط رشد را در اسیدیته 5 و در مدت 48 ساعت تجزیه کرد (25). در سال 2010 اُزل[xv] و همکاران توانایی تجزیه سیانید توسط جدایه‌های مختلف قارچ‌ها از گروه بازیدیو‌میست را بررسی و 5 جدایه مختلف تجزیه کننده سیانید را شناسایی کردند. این جدایه‌ها توانایی تجزیه 60 تا80 درصد سیانید محیط کشت را در مدت 60 ساعت دارا بودند. قارچ فوزاریوم سولانی[xvi] توانایی تجزیه 50 میلی‌گرم بر لیتر سیانید در مدت 96 ساعت در شرایط قلیایی را دارا است (15). نتایج تحقیق حاضرنشان می‌دهد جدایه MF1 علاوه بر توانایی خوب در تجزیه کامل سیانید، دارای سرعت تجزیه مناسب بوده و سیانید را در مدت حدود 40 ساعت تجزیه کرد.

همچنین، نتایج نشان داد که جدایه MF1 بدون نیاز به منبع کربن و نیتروژن اضافی، توانایی تجزیه سیانید در شرایط قلیایی را داراست. در سال 1999 اَدجئی و اوهتا[xvii] تجزیه سیانید توسط بورخولدریا سپاسیا[xviii] را در شرایط قلیایی مطالعه کردند. این باکتری توانایی استفاده از سیانید به عنوان تنها منبع نیتروژن را داشت ولی نیازمند به افزودن گلوکز به عنوان منبع کربن بود (17). در سال 2005 جدایه‌ای به نام سودوموناس سودوآلکالیژنز[xix] از پساب صنایع جواهر‏سازی اسپانیا جداسازی شد. این باکتری توانایی استفاده از سیانید به عنوان تنها منبع نیتروژن را در شرایط قلیایی دارا بود اما این جدایه نیز به استات، به عنوان منبع کربن اضافی نیاز داشت (11). کمبود منبع کربن محیط رشد، یک عامل بازدارنده در تجزیه زیستی سیانید خاک‌های آلوده به شمار می‌آید (8). بنابراین، جدایه MF1 با توانایی تجزیه سیانید بدون افزودن منبع کربن و نیتروژن، دارای برتری نسبت به سایر جدایه‌هاست.

نتایج بررسی سمیت ترکیبات مختلف سیانیدی بر باکتری تجزیه کننده MF1، نشان داد که جدایه MF1 توانایی خوبی در تحمل غلظت‌های بالای ترکیبات سیانیدی را دارد. ترکیبات پایدار سیانید نظیر کمپلکس‌های آهن و نیکل به علت پیوند قوی با گروهCN، سمیت کمتری نشان می‌دهند اما ترکیبات با پیوند ضعیف‌تر همانند سدیم سیانات و پتاسیم سیانات به علت انحلال پذیری بیشتر در آب و آزاد کردن گروه CN-، سمیت بیشتری دارند (11). سوزا[xx]و همکاران حداقل غلظت مهارکنندگی رشد ترکیب سیانیدی NaSCN بر باکتری سودوموناس را 45 میلی‌مولار گزارش کردند (42).

نتایج این پژوهش توانایی جدایه MF1 در استفاده از ترکیبات مختلف سیانیدی به عنوان تنها منبع کربن و نیتروژن، را نشان می‌دهد. این جدایه توانایی رشد روی تمام ترکیبات سیانیدی آزمایش شده را به عنوان تنها منبع کربن و نیتروژن دارا بود. جدایه‌هایی از اسینتوباکتر[xxi] (43) و بورخولدریا سپاسیا (17) شناسایی شدند که توانایی استفاده از ترکیبات مختلف سیانیدی (ترکیبات سیانید-فلز و نیتریل) به عنوان تنها منبع کربن ونیتروژن را نشان دادند. نتایج تحقیق حاضر نشان داد از میان ترکیبات مختلف سیانیدی، بیشترین رشد جدایه MF1 در حضور K4[Fe(CN)6]، انجام شد. ترکیبات سیانید- فلز را بر اساس انحلال آن‏ها در اسیدیته مختلف می‌توان به دو دسته حل شونده به وسیله اسید ضعیف[xxii]CNWAD)) و حل شونده به وسیله اسید قوی[xxiii] ( (CNSADتقسیم کرد. ترکیب سیانید با فلزاتی نظیر آهن و کبالت در دسته  CNSADقرار می‌گیرند. این ترکیبات بسیار پایدارند و گروه سیانیدی خود را در اسیدیته صفر آزاد می‌کنند (11). میکروارگانیسم‌هایی نظیر
 فوزاریم سولانی[xxiv] (44)، سودوموناس فلورسانس[xxv] (9) و سودوموناس سودوآلکالیژنز (11) شناسایی شدند که توانایی استفاده از ترکیبات CNSAD به عنوان تنها منبع نیتروژن را دارند.

سیانید ترکیب بسیار سمی است که با فعالیت صنعتی انسان، باعث آلودگی گسترده طبیعت به این آلاینده شده است. با جداسازی و شناسایی باکتری‌های تجزیه کننده سیانید از خاک‌های آلوده و ایجاد شرایط بهینه تجزیه زیستی، می‌توان با صرف هزینه کمتر و نیز مشکلات زیست ‌محیطی کمتر، پساب آلوده به این ترکیب سمی را پالایش کرد. نتایج نشان داد که جدایه MF1 توانست پس از 40 ساعت گرمخانه‌گذاری، سیانید موجود در محیط رشد را تجزیه کند. همچنین، این جدایه توانایی استفاده از ترکیبات مختلف سیانیدی به عنوان تنها منبع کربن و نیتروژن را داشت. نتایج این تحقیق نشان می‌دهد باکتری سراشیاسویهMF1 جدا شده از خاک معدن طلا، گزینه مناسبی برای تجزیه زیستی سیانید در شرایط قلیایی است و می‌تواند برای تجزیه سیانید از پساب صنایع و مکان‏های آلوده، به‌کار گرفته شود.



[1]- Baia Mare

[2]- Nessler’s methods

[3]- Minimum inhibitory concentration

[4]- Merck

[5]- Methyl Red

[6]- Voges-Proskauer

[7]- Bergey's Manual of Systematic Bacteriology

[8]- Thermo Scientific, Lithuania

[9]- Accession Number

[10]- Serratia

[11]- Serratia nematodiphila

[xii]- Kao

[xiii]- Klebsiella oxytoca

[xiv]- Maniyam

[xv]- Özel

[xvi]- Fusarium solani

[xvii]- Adjei and Ohta

[xviii]- Burkholderia cepacia

[xix]- Pseudomonas pseudoalcaligenes

[xx]- Souza

[xxi]- Acinetobacter sp

[xxii]- CN weak acid-dissociable

[xxiii]- CN strong acid-dissociable

[xxiv]- Fusarium solani

[xxv]- Pseudomonas fluorescens

References

(1)   Kwon HK, Woo SH, Park JM. Degradation of tetracyanonickelate (II) by Cryptococcus humicolus MCN2. FEMS Microbiology Letters 2002; 214 (2): 211- 16.

(2)   Jones DA. Why are so many food plants cyanogenic?. Phytochemistry 1998; 47 (2): 155- 62.

(3)   Dursun AY, Çalik A, Aksu Z. Degradation of ferrous (II) cyanide complex ions by Pseudomonas fluorescens. Process Biochemistry 1999; 34 (9): 901- 08.

(4)   Baxter J, Cummings SP. The current and future applications of microorganism in the bioremediation of cyanide contamination. Antonie van Leeuwenhoek 2006; 90 (1): 1- 17.

(5)   Arslan F, Ozdamar DY, Muduroglu M. Cyanidation of Turkish gold-silver ore and the use of hydrogen peroxide. European Journal of Mineral Processing and Environmental Protection 2003; 3 (3): 309-15.

(6)   Soldan P, Pavonic M, Boucek J, Kokes J. Baia Mare accident brief ecotoxicological report of Czech experts. Ecotoxicology and environmental safety 2001; 49 (3): 255-61.

(7)   Leavesley HB, Li L, Prabhakaran K, Borowitz JL, Isom GE. Interaction of cyanide and nitric oxide with cytochrome c oxidase: implications for acute cyanide toxicity. Toxicological Sciences 2008; 101 (1): 101-11.

(8)   Young CA, Jordan TS. Cyanide remediation: current and past technologies. In Conference Proceeding, Proceedings of the 10th Annual Conference on Hazardous Waste Research. Kansas State University: Manhattan, KS; 1995. p. 104-29.

(9)   Akcil A, Mudder T. Microbial destruction of cyanide wastes in gold mining: process review. Biotechnology Letters 2003; 25 (6): 445- 50.

 

(10)     Demopoulos GP, Cheng TC. A case study of CIP tails slurry treatment: comparison of cyanide recovery to cyanide destruction. European Journal of Mineral Processing and Environmental Protection 2004; 4 (1): 1-9.

(11)           Luque-Almagro VM, Huertas MJ, Martinez-Luque M, Moreno-Vivian C, Roldan MD, Garcia-Gil LJ, Castillo F, Blasco R. Bacterial degradation of cyanide and its metal complexes under alkaline conditions. Applied and Environmental Microbiology 2005; 71 (2): 940- 47.

(12)           Ezzi MI, Lynch JM. Biodegradation of cyanide by Trichoderma spp. and Fusarium spp. Enzyme and Microbial Technology 2005; 36 (7): 849-54.

(13)           Kwon HK, Woo SH, Park JM. Thiocyanate degradation by Acremonium strictum and inhibition by secondary toxicants. Biotechnology Letters 2002; 24 (16): 1347-51.

(14)     Fisher FB, Brown JS. Colorimetric determination of cyanide in stack gas and waste water. Analytical Chemistry 1952; 24 (9): 1440-44.

(15)           Özel YK, Gedikli S, Aytar P, Ünal A, Yamaç M, Çabuk A, Kolankaya N. New fungal biomasses for cyanide biodegradation. Journal of Bioscience and Bioengineering 2010; 110 (4): 431-35.

(16)           Silva-Avalos JUAN, Richmond MG, Nagappan O, Kunz DA. Degradation of the metal-cyano complex tetracyanonickelate (II) by cyanide-utilizing bacterial isolates. Applied and Environmental Microbiology 1990; 56 (12): 3664- 70.

(17)     Adjei MD, Ohta Y. Isolation and characterization of a cyanide-utilizing Burkholderia cepacia strain. World Journal of Microbiology and Biotechnology 1999; 15 (6): 699-704.

(18)           Brenner DJ, Krieg NR, Staley JT. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2nd edition, volume 2, USA: Springer; 2004.

(19)           Stephen JR, McCaig AE, Smith Z, Prosser JI, Embley TM. Molecular diversity of soil and marine 16S rRNA gene sequences related to beta-subgroup ammonia-oxidizing bacteria. Applied and Environmental Microbiology 1996; 62 (11): 4147- 54.

(20)      Sambrook J, Russell DW. The Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2006.

(21)     Edwards U, Rogall T, Blocker H, Emde M, Bottger EC. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucl Acids Res 1989; 17 (19): 7843-53.

(22)     Kim OS, Cho YJ, Lee K, Yoon SH, Kim M, Na H, et al. Introducing EzTaxon-e: a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2012; 62: 716- 21.

(23)     Fry WE, Millar RL. Cyanide degradion by an enzyme from Stemphylium loti. Archives of Biochemistry and Biophysics 1972; 151 (2): 468-74.

(24)     Atkinson A. Bacterial cyanide detoxification. Biotechnology and Bioengineering 1975; 17 (3): 457-60.

(25)     Harris RE, Knowles CJ. The conversion of cyanide to ammonia by extracts of a strain of Pseudomonas fluorescens that utilizes cyanide as a source of nitrogen for growth. FEMS Microbiology Letters 1983; 20 (3): 337- 41.

(26)      Dash RR, Balomajumder C, Kumar A. Treatment of metal cyanide bearing wastewater by simultaneous adsorption and biodegradation (SAB). Journal of Hazardous Materials 2008; 152 (1): 387- 96.

(27)      Padmaja G, Balagopal C. Cyanide degradation by Rhizopus oryzae. Canadian Journal of Microbiology 1985; 31 (8): 663-9.

(28)     Wang PY, Tsai SW, Chen TL. Improvement of enantioselectivity and stability of Klebsiella oxytoca hydrolase immobilized on Eupergit C 250L. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008; 83 (11): 1518-1525.

(29)     Akcil A, Karahan AG, Ciftci H, Sagdic O. Biological treatment of cyanide by natural isolated bacteria (Pseudomonas sp.) Minerals Engineering 2003; 16 (7): 643-49.

(30)     Gurbuz F, Ciftci H, Akcil A. Biodegradation of cyanide containing effluents by Scenedesmus obliquus. Journal of Hazardous Materials 2009; 162 (1): 74-79.

(31)     Kowalska M, Bodzek M, Bohdziewicz J. Biodegradation of phenols and cyanides using membranes with immobilized microorganisms. Process Biochemistry 1998; 33 (2): 189-97.

(32)     Patil YB, Paknikar KM. Development of a process for biodetoxification of metal cyanides from waste waters. Process biochemistry 2000; 35 (10):1139-51.

(33)     Ezzi MI, Lynch JM. Cyanide catabolizing enzymes in Trichoderma spp. Enzyme and Microbial Technology 2002; 31 (7): 1042-47.

(34)     Ezzi MI, Pascual JA, Gould BJ, Lynch JM. Characterisation of the rhodanese enzyme in Trichoderma spp. Enzyme and Microbial Technology 2003; 32 (5): 629-34.

(35)     Pereira PT, Arrabaça JD, Amaral-Collaco MT. Isolation, selection and characterization of a cyanide-degrading fungus from an industrial effluent. International Biodeterioration and Biodegradation 1996; 37 (1): 45-52.

(36)     Pereira P, Pires AS, Roseiro JC. The effect of culture aging, cyanide concentration and induction time on formamide hydro-lyase activity of Fusarium oxysporum CCMI 876. Enzyme and Microbial Technology 1999; 25 (8):736-44.

(37)     Barclay M, Tett VA, Knowles CJ. Metabolism and enzymology of cyanide/metallocyanide biodegradation by Fusarium solani under neutral and acidic conditions. Enzyme and Microbial Technology 1998; 23 (5): 321-30.

(38)     Campos MG, Pereira P, Roseiro JC. Packed-bed reactor for the integrated biodegradation of cyanide and formamide by immobilised Fusarium oxysporum CCMI 876 and Methylobacterium sp. RXM CCMI 908. Enzyme and Microbial Technology 2006; 38 (6): 848-54.

(39)     Meyers PR, Rawlings DE, Woods DR, Lindsey GG. Isolation and characterization of a cyanide dihydratase from Bacillus pumilus C1. Journal of Bacteriology 1993; 175 (19): 6105-12.

(40)           Kao CM, Liu JK, Lou HR, Lin CS, Chen SC. Biotransformation of cyanide to methane and ammonia by Klebsiella oxytoca. Chemosphere 2003; 50 (8):1055-1061.

(41)           Maniyam MN, Sjahrir F, Ibrahim AL, Cass AE. Biodegradation of cyanide by Rhodococcus UKMP-5M. Biologia 2013; 68 (2): 177- 85.

(42)     SouzaFagundes EM, Rosa LH, Gomes N, Santos M,H, Pimentel PF. Thiocyanate degradation by pure and mixed cultures of microorganisms. Brazilian Journal of Microbiology 2004; 35 (4): 333- 36.

(43)     Finnegan I, Toerien S, Abbot L, Smit F, Raubenheimer HG. Identification and characterisation of an Acinetobacter sp. capable of assimilation of a range of cyano-metal complexes, free cyanide ions and simple organic nitriles. Applied Microbiology and Biotechnology 1991; 36 (1): 142-44.

(44)           Barclay M, Tett VA, Knowles CJ. Metabolism and enzymology of cyanide/metallocyanide biodegradation by Fusarium solani under neutral and acidic conditions. Enzyme and Microbial Technology 1998; 23 (5): 321- 30.