جهش‏زا‏‏یی توسط UV و اسید نیترو برای افزایش تولید رنت در Rhizomucor miehei

نویسندگان

1 کارشناس ارشد مهندسی صنایع غذایی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین- پیشوا، ورامین، ایران

2 دانشیار بیوتکنولوژی، سازمان پژوهش‏ها‏ی علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران

3 استادیار بیوتکنولوژی، سازمان پژوهش‏ها‏ی علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران،

4 استادیار صنایع غذایی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد ورامین- پیشوا، ورامین، ایران

چکیده

  مقدمه : در این تحقیق، تکنیک جهش و انتخاب، برای افزایش تولید رنت ‏(‏آنزیم دلمه کننده شیر) ‏در ریزوموکور میه هی استفاده شد. جهش و انتخاب، تکنیکی برای اصلاح سویه‏ها‏ی میکروبی است ‏که طی آن، با استفاده از عوامل جهش‏زا‏‏ در ارگانیسم مورد نظر جهش ایجاد شده، سپس، جهش یافته‏ها‏ی مطلوب با یک استراتژی مشخص انتخاب می‏‏‏شوند‏‏.   مواد و روش‏‏ها: در ابتدا تعدادی جهش یافته با کاربرد دوزهای ‏بهینه از UV ‏(‏به عنوان جهش‏زا‏‏ی فیزیکی) ‏و اسید نیترو ‏(‏به عنوان جهش‏زا‏‏ی شیمیایی) ‏به شکل‏‏ تصادفی ایجاد شد. سپس، از میان جهش یافته‏ها‏ی به دست آمده، بهترین سویه‏ها‏ از نظر تولید، انتخاب شده و از نظر فعالیت دلمه کنندگی، فعالیت پروتئولیتیکی، سینتیک تولید آنزیم، نسبت ‏(‏نسبت فعالیت دلمه کنندگی به فعالیت پروتئولیتیکی)‏، بازدهی، بهره‏وری‏‏ و ضریب رشد ویژه، با سویه والد در 5 تکرار مقایسه شدند.   نتایج: در این تحقیق فعالیت دلمه کنندگی رنت حاصل از سویه والد، SU.mL-1 1183 تعیین شد‏‏. همچنین، جهش یافته‏ها‏یی با نام‏ها‏ی انتخابی U-1113 و ‏ N-0227 ایجاد شد که به ترتیب قادر به تولید 1771 و SU.mL-1 1864 رنت بودند. نسبت ‏ در مورد رنت سویه والد ‏4950 و در مورد جهش یافته‏ها‏ی U-1113 و ‏ N-0227 به ترتیب 8114 و SU.PU-1 ‏8193 به دست آمد.   بحث و نتیجه‏گیری: فعالیت آنزیم در جهش یافته‏ها‏ی U-1113 و ‏ N-0227 نسبت به سویه والد، به ترتیب 7/49 و 6/57 درصد افزایش داشت ‏(‏05/0 P value < ). همچنین، میزان بهره‏وری‏‏، بازدهی و نسبت ‏ ، به طور معنی‏داری نسبت به سویه والد بهبود یافت ‏(‏05/ 0 P value < )؛ ‏که نشان می‏‏‏دهد جهش‏زا‏‏های مورد استفاده بر کیفیت و کمیت رنت سویه یاد شده‏‏ موثر بوده است.  

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Mutagenesis by UV and Nitrous Acid for increase of rennet production in Rhizomucor miehei

نویسندگان [English]

  • Naser Tajik 1
  • Mehrdad Azin 2
  • Masoud Fallahpour 3
  • Rezvan Pourahmad 4
1 M.Sc. of Food Science and Technology, Varamin Branch, Islamic Azad University, Varamin, Iran
2 Associated Professor of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science & Technology, Tehran, Iran
3 Assistant Professor of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science & Technology, Tehran, Iran
4 Assistant Professor of Microbiology, Islamic Azad University, Qom branch, Iran
چکیده [English]

  Introduction : In this study, Mutation and Selection technique was used to increase production of Rennet (milk clotting enzyme) in Rhizomucor miehei. Mutation and Selection is a technique for microbial strain improvement in which, mutation is induced on an organism by mutagen factors, then superior mutants are selected by screening procedures.   Materials and methods Mutations were induced by an optimized dose of UV (as physical mutagen) and Nitrous acid (as chemical mutagen). Superior mutants were selected and compared to the parent strain regarding the clotting activity, proteolytic activity, enzyme production kinetic, yield, productivity and special growth rate in 5 replications.   Results : The milk clotting activity of parent strain was 1183 SU.mL-1. Mutants designated U-1113 and N-0227 were isolated which, produced 1771 and 1864 respectively. ratio was measured 4950, 8114 and 8193 SU.PU-1 in parent, U-1113 and N-0227, respectively.   Discussion and conclusion : Production of enzymes in mutants U-1113 and N-0227 were increased 49.7 and 57.6% respectively, relative to parent strain. Yield of production, productivity and C/P ratio were also increased significantly in mutants, regarding the same figures obtained for parent (p<0.05) that shows mutagens were used, have effected on quantity and quality of strain rennet.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Clotting activity
  • Mutagensis
  • Microbial Rennet
  • Nitrous acid
  • Rhizomucor miehei
  • Strain improvement and UV

مقدمه

کیموزین ‏(‏رنت) ‏یک مخلوط آنزیمی است که در صنایع پنیرسازی برای انعقاد شیر به کار می‏‏‏رود ‏(‏1).
در گذشته، رنت از معده چهارم گوساله‏ها‏ی شیرخوار به دست می‏‏‏آمد. اما با افزایش تقاضا برای مصرف گوشت و پنیر، ضروری بود تا به سایر منابع آنزیم‏ها‏ی دلمه کننده توجه شود. به این ترتیب برخی رنت‏ها‏ی حیوانی جایگزین کشف شدند و امروزه نیز برخی آنزیم‏ها‏ی دلمه کننده شیر با منشا میکروبی، کاربرد تجاری یافته اند ‏(‏2).

رنت مورد استفاده در صنایع پنیرسازی نباید دارای اثر پروتئولیز محسوس روی کازئین شیر باشد. در این صورت ممکن است پپتیدهای آب دوست تشکیل شده و باعث ایجاد طعم تلخ در محصول شود. از این رو لازم است رنت جایگزین، فعالیت دلمه کنندگی بالا و فعالیت پروتئولیتیکی پائینی داشته باشد. به این ترتیب نسبت فعالیت دلمه کنندگی به فعالیت پروتئولیتیکی ‏(‏ ) ‏[1]، به عنوان یک شاخص برای انتخاب سویه‏ها‏ی میکروبی مناسب، توسط محققان به کار رفته است ‏(‏3 و 4).

به طور کلی در میان میکروارگانیسم‏ها‏ی تولید کننده رنت، گونه‏ها‏ی قارچی به علت‏‏ دارا بودن نسبت  ‏بالا، اهمیت بیشتری دارند. در این رابطه رنت به دست آمده از کپک ریزوموکور میه هی[2]، یکی از بهترین جایگزین‏ها‏ی کیموزین گوساله است که به علت‏‏ شاخص‏های کیفی مشابه، دارای اهمیت تجاری است ‏(‏5 و 6).

به منظور اهداف تجاری، یکی از بهترین روش‏ها‏ی افزایش تولید و توسعه سویه‏ها‏ی صنعتی، بهبود ژنتیکی سویه‏ها‏ی میکروبی است. در این رابطه می‏‏‏توان به روش نوترکیبی و تکنیک جهش و انتخاب اشاره نمود. در سال‏ها‏ی گذشته پژوهش‏ها‏ی بسیاری در رابطه با افزایش تولید رنت ‏با روش نوترکیبی انجام شده است‏‏ که در میان آن‏ها‏ می‏‏‏توان به پژوهش‏ها‏ی وارد و همکاران[3]، کاپرالک و همکاران[4] ‏و بادی و همکاران[5] ‏‏اشاره داشت ‏(‏7- 9). سکر و همکاران[6] ‏با بهینه‏سازی‏‏‏ تولید رنت ریزوموکور میه هی در فرمانتور مداوم، تولید این آنزیم را در سطح 5/7 گرم بر لیتر گزارش کردند ‏(‏10). همچنین، می‏‏‏توان به تحقیقات داسیلویرا و همکاران[7] و نیز دلیما و همکاران[8] ‏‏در زمینه بهینه‏سازی‏‏‏ تولید رنت اشاره کرد ‏(‏11 و 12).

به طور کلی تکنیک جهش– انتخاب در 2 مرحله انجام می‏‏‏شود. در مرحله اول با استفاده از عوامل جهش‏زا‏‏ در میکروارگانیسم مورد نظر جهش[9] ایجاد می‏‏‏شود؛ سپس، در مرحله دوم، جهش یافته‏ها‏ی مطلوب با یک استراتژی مشخص انتخاب[10] می‏‏‏شوند ‏(‏2). فونگارو و همکاران[11] ‏با سه سیکل متوالی جهش- انتخاب، موفق به جداسازی سویه ای از
کاندیدا تسوکوبائنسیس[12] شدند که میزان تولید رنت آن حدود 2 برابر نسبت به سویه والد افزایش داشت. ضمن آن که فعالیت پروتئولیتیکی سویه اصلاح شده تقریبا 20 درصد کاهش یافت ‏(‏13).

با این حال با وجود مطالعات فراوانی که تاکنون در زمینه افزایش تولید رنت انجام شد‏‏ه، کمتر به موضوع جهش- انتخاب پرداخته شده است. بنابراین،‏‏ هدف از انجام این تحقیق، استفاده از عوامل جهش‏زا‏‏ مشتمل بر UV ‏(‏به عنوان عامل جهش‏زا‏‏ی فیزیکی) ‏و اسید نیترو [13] ‏(‏به عنوان عامل جهش‏زا‏‏ی شیمیایی)‏، برای تهیه سویه‏ها‏ی جهش یافته از ریزوموکور میه هی بود کهراندمان تولید رنت بیشتری داشتند. مهم‏ترین اثر جهش‏زا‏‏یی پرتوهای UV، ایجاد دایمرهای تیمین در ساختار DNA سلول است که در طول موج 254 نانومتر به حداکثر می‏‏‏رسد ‏(‏14 و 15). اسید نیترو نیز از جهش‏زا‏‏های قوی است که سازوکار تاثیر آن بر DNA، عموما به دآمیناسیون بازهای آدنین، گوانین و سیتوزین مربوط می‏‏‏شود که در نتیجه آن پیوندهای هیدروژنی بازهای یاد شده‏‏ تحت تاثیر قرار می‏‏‏گیرد ‏(‏16).

 

مواد و روش‏ها

میکروارگانیسم مورد استفاده

سویه میکروبی مورد استفاده در این پژوهش، ریزوموکور میه هی(‏PTCC 5145) ‏بود که از مرکز منطقه ای کلکسیون میکروارگانیسم‏ها‏ی ایران، وابسته به سازمان پژوهش‏ها‏ی علمی وصنعتی ایران تهیه شد. محیط کشت مورد استفاده ‏برای نگهداری سویه میکروبی، حاوی عصاره ‏مالت ‏تهیه ‏شده ‏از شرکت ‏بهنوش ‏ایران ‏(‏60 گرم بر لیتر)‏،‏ ‏پودر شیر بدون چربی ساخت شرکت مرک آلمان ‏(‏15 گرم بر لیتر) ‏و آگار ‏(‏15 گرم بر لیتر) ‏بود که در اسیدیته‏ 5 به شکل‏‏ مایل تهیه و پس از کشت و رشد میکروارگانیسم در دمای 40 درجه سلسیوس، در یخچال ذخیره و هر 15 روز تجدید کشت شد.

جهش‏زا‏‏یی با UV

1/0 میلی‏لیتر از سوسپانسیون کنیدیوسپور حاوی
108 × 2 بر میلی‏لیتر، از اسپورهای با عمر 3 روز، در پلیت‏ها‏ی حاوی محیط کشت DRBC Agar ‏(‏ساخت شرکت کیولب[14]) ‏کشت داده شد. سپس، در شرایط تاریکی، پلیت‏ها‏ زیر لامپ UV 30 وات ‏(‏شرکت فیلیپس[15]) ‏با طول موج 280 نانومتر و در زمان‏ها‏ی ‏مختلف 30، 60، 90، 120، 150و180 ثانیه تحت تابش مستقیم UV قرار گرفتند. به طوری که فاصله لامپ UV تا سطح پلیت‏ها‏ 20 سانتی‏متر بود. ضمن آن که در هنگام تیمار با UV درب پلیت‏ها‏ برداشته شد. پلیت‏ها‏ تا زمان ظاهر شدن کلونی‏‏‏ها‏ در دمای 25 درجه سلسیوس گرمخانه‏گذاری و سپس کلونی‏‏‏ها‏ی تشکیل شده، شمارش شدند ‏(‏2 و 17). دوزی به عنوان دوز بهینه UV تعیین شد که در شرایط متعارف فوق، 99/99 درصد اسپورهای اولیه را از بین ببرد ‏(‏18).

جهش‏زا‏‏یی با اسید نیترو

5 میلی‏لیتر از سوسپانسیون کنیدیوسپور حاوی
108 × 2 بر میلی‏لیتر،‏ به 5 میلی‏لیتر محلول نیتریت سدیم ‏(‏شرکت مرک آلمان) ‏2/0 مولار در بافر استات ‏(‏با غلظت 2/0 مولار و اسیدیته 5/4‏) ‏اضافه و به شیکر انکوباتور با دمای 35 درجه سلسیوس و 150 دور در دقیقه انتقال یافت. به منظور توقف جهش‏زا‏‏یی، در فواصل زمانی 10، 20، 30، 40، 50 و 60 دقیقه، 1 میلی‏لیتر از سوسپانسیون تیمار شده، با بافر فسفات ‏(‏با غلظت 2/0 مولار و اسیدیته1/7‏) ‏مخلوط شده و از هر یک، رقت مناسبی برای کشت تهیه شد‏‏. کشت از سوسپانسیون‏ها‏ی یاد شده‏‏ در پلیت‏ها‏ی حاوی محیط DRBC Agar انجام شد‏‏. به دنبال آن گرمخانه‏گذاری در دمای 25 درجه سلسیوس و تا زمان ظاهر شدن کلونی‏‏‏ها‏ انجام و کلونی‏‏‏ها‏ی تشکیل یافته، شمارش شدند. به این ترتیب، دوز بهینه اسید نیترو، میزان غلظتی تعیین شد که قادر بود 4 سیکل لگاریتمی از اسپورهای اولیه را از بین ببرد ‏(‏18).

تولید آنزیم

یک میلی‏لیتر از سوسپانسیون کنیدیوسپور حاوی
 107 × 4 بر میلی‏لیتر به 40 میلی‏لیتر محیط تولید آنزیم در ارلن‏ها‏ی 250 میلی‏لیتری تلقیح شد. محیط تولید حاوی: عصاره مالت ‏(‏40 گرم بر لیتر) ‏و پودر شیر بدون چربی ‏(‏15 گرم بر لیتر) ‏بود که پس از تنظیم اسیدیته‏ روی 6، در اتوکلاو با دمای 121 درجه سلسیوس و فشار 5/1 اتمسفر به مدت 5 دقیقه استریل شد. سپس، ارلن‏ها‏ به شیکر انکوباتور با دمای ‏37 درجه سلسیوس و 180 دور در دقیقه انتقال یافت. پس از 5 روز، زیست توده تولید شده با استفاده از کاغذ صافی و با کمک پمپ خلا جدا شد و از سوپرناتانت شفاف حاصل که حاوی آنزیم رنت است، برای اندازه‏گیری‏‏‏ کمی استفاده شد ‏(‏2).

سنجش کمیت‏ها‏ی آزمایشی

سنجش فعالیت دلمه کنندگی آنزیم

برای اندازه‏گیری‏‏‏ فعالیت دلمه کنندگی، ابتدا محلول 10 درصد پودرشیر بدون چربی، حاوی غلظت 01/0 مولار کلرید کلسیم تهیه شد. سپس، ‏5/0 میلی‏لیتر سوپرناتانت آنزیمی در دمای 35 ‏درجه سلسیوس به 5 میلی‏لیتر سوبسترا ‏(‏محلول فوق) ‏اضافه و زمان انعقاد محلول تا ایجاد نخستین فلوکوله‏ها‏ اندازه‏گیری‏‏‏ شد. فعالیت دلمه کنندگی با استفاده از رابطه 1 به دست آمد ‏(‏19). ‏رابطه 1:      ‏CA =  ×  ×

در رابطه 1: CA فعالیت دلمه کنندگی آنزیم برحسب واحد سوکسله بر میلی‏لیتر ‏(‏SU.mL-1)‏،
M و E به ترتیب حجم سوبسترا و حجم سوپرناتانت آنزیمی بر حسب میلی‏لیتر، T دمای محیط واکنش آنزیم - سوبسترا برحسب درجه سلسیوس و
t زمان انعقاد شیر بر حسب ثانیه ‏است‏‏‏.

سنجش فعالیت پروتئولیتیکی آنزیم

برای انجام آزمایش، ابتدا لازم بود تا سوبسترای پروتئینی تهیه شود. به همین منظور محلول 5 گرم پودر کازئین در 80 میلی‏لیتر آب مقطر تهیه و در دمای ‏37 ‏درجه سلسیوس به مدت 60 دقیقه گرمخانه گذاری شد. سپس 50 میلی‏لیتر بافر فسفات ‏‏(‏25/7 اسیدیته‏ و غلظت 25/0 مولار) ‏به آن افزوده و با آب مقطر به حجم 250 میلی‏لیتر رسانده شد. به منظور سنجش فعالیت پروتئولیتیکی آنزیم، 5 میلی‏لیتر از سوبسترای کازئینی تهیه شده در دمای 35 درجه سلسیوس به 1 میلی‏لیتر سوپرناتانت آنزیمی افزوده شد. پس از 15 دقیقه، واکنش با اضافه کردن 10 میلی‏لیتر تری کلرواستیک اسید 5 درصد ‏‏‏ متوقف شد. پس از 30 دقیقه و پایدار شدن محلول‏ها‏، جذب نمونه‏ها‏ در طول موج 280 نانومتر، با استفاده از اسپکتروفتومتر ‏(‏بیو کروم بیو ویو 2[16]- انگلستان) ‏خوانده شد. یک واحد فعالیت پروتئولیتیکی، معادل مقدار آنزیمی تعریف شد که جذب نمونه را در طول موج 280 نانومتر از مسیری به طول 1 سانتی متر، به میزان یک واحد افزایش دهد. به این ترتیب نتایج سنجش فعالیت پروتئولیتیک بر حسب PU.mL-1گزارش شد ‏(‏20).

ترسیم منحنی سینتیک تولید آنزیم ‏

برای رسم منحنی سینتیک تولید آنزیم، ابتدا هر کدام از سویه‏ها‏ی اصلی و جهش یافته، با سه تکرار کشت داده شدند. محیط‏ها‏ در دمای ‏37 درجه سلسیوس و 180 دور بر دقیقه در شیکرانکوباتور ‏(‏ان بیوتک[17] - کره جنوبی) ‏گرمخانه گذاری شدند. در هر 24 ساعت، 3 ارلن از محیط‏ها‏ی تلقیح شده مربوط به هر سویه را از شیکر خارج کرده و فعالیت دلمه کنندگی آن‏ها‏ اندازه‏گیری‏‏‏ شد. با قرار دادن میانگین فعالیت دلمه کنندگی آنزیم هر سویه نسبت به زمان، منحنی سینتیک تولید آنزیم رسم شد ‏(‏11)

 

ارزیابی بهره‏وری‏‏ آنزیم

از رابطه 2، به منظور تعیین میزان بهره‏وری‏‏ آنزیم استفاده شد ‏(‏21). ‏رابطه 2:      ‏P =

در رابطه 2: P بهره‏وری‏‏ آنزیم بر حسب سوکسله بر میلی‏لیتر ساعت ‏(‏SU.mL-1h-1)‏، CA فعالیت دلمه‏کنندگی آنزیم بر حسب واحد سوکسله بر میلی‏لیتر ‏(‏SU.mL-1)‏، v حجم محیط تولید بر حسب میلی‏لیتر و t زمان بر حسب ساعت ‏است‏‏‏.

ارزیابی بازدهی آنزیم

میزان بازدهی نسبت به منابع کربن و نیتروژن محیط تولید، با استفاده از رابطه‏های 3 و 4 تعیین شد ‏(‏22):

‏‏رابطه 3:      YCA/C =

‏‏رابطه 4:      ‏‏‏‏YCA/N =

در رابطه‏های 3 و 4: YCA/C، بازدهی تولید آنزیم نسبت به منبع کربن بر حسب واحد سوکسله بر گرم کربوهیدرات ‏‏ (‏SU.g-1C)‏، YCA/N، بازدهی تولید آنزیم نسبت به منبع نیتروژن بر حسب واحد سوکسله بر گرم نیتروژن ‏(‏SU.g-1N) ‏وMC ‏و MN به ترتیب جرم کربوهیدرات و نیتروژن محیط بر حسب گرم ‏(‏g) ‏است‏‏‏.

سنجش ضریب رشد ویژه

در ابتدا، سوسپانسیون کنیدیوسپور حاوی 107 × 4 بر میلی‏لیتر به محیط تولید تلقیح و به شیکر انکوباتور با دمای 40 درجه سلسیوس و 150 دور در دقیقه منتقل شد. پس از 24 ساعت، 10 درصد ‏(‏حجمی/حجمی) ‏از محیط فوق به محیط جدید تلقیح و وزن خشک اولیه آن‏ها‏ اندازه‏گیری‏‏‏ شد. پس از ‏4 روز گرمخانه‏گذاری در شیکر انکوباتور با شرایط یاد شده‏‏، زیست توده تولید شده با استفاده از صافی کاغذی و پمپ خلا جدا شده و وزن خشک ثانویه آن‏ها‏ نیز تعیین شد. برای تعیین وزن خشک، صافی‏ها‏ی کاغذی محتوی زیست توده به مدت 24 ساعت در دمای 70 درجه سلسیوس در فور قرار گرفتند ‏(‏23). با محاسبه وزن خشک اولیه و ثانویه و استفاده از رابطه مونود ‏(‏رابطه 5)‏، ضریب رشد ویژه به دست آمد ‏(‏24). (‏رابطه 5):

 

 

تجزیه و تحلیل آماری داده‏ها‏

تمام داده‏ها‏ی به دست آمده از آزمایش‏ها‏ی مختلف، در قالب طرح کاملا تصادفی بررسی‏ها‏ی آماری شد. در آزمایش‏ها‏ی نهایی مربوط به هریک از میکروارگانیسم‏ها‏، تعداد 3 تیمار با 5 تکرار در نظر گرفته شد. در این پژوهش، به منظور بررسی ویژگی کمی داده‏ها‏، از تحلیل‏‏ واریانس و نرم افزار اس پی اس اس نگارش 16[18] و برای مقایسه میانگین‏ها‏ از آزمون چند دامنه ای دانکن استفاده شد. همچنین، رسم نمودارها به کمک نرم افزار ‏مایکروسافت آفیس اکسل 2007[19] انجام شد.

 

نتایج

منحنی لگاریتمی مرگ اسپورهای
ریزوموکور میه هی در اثر UV و اسید نیترو، به ترتیب در شکل‏ها‏ی 1 و 2 آمده است. همان گونه که مشاهده می‏‏‏شود. دوز بهینه UV برای کاهش 4 سیکل لگاریتمی ‏(‏99/99 درصد‏‏‏ اسپورهای تلقیح شده)‏، در زمان تقریبی 52 ثانیه به دست آمد؛ در مورد اسید نیترو، این زمان حدود 40 دقیقه بود.

 

 

شکل 1- ‏منحنی لگاریتمی مرگ اسپورهای ریزوموکور میه هی در اثر UV

 

 

شکل 2- ‏منحنی لگاریتمی مرگ اسپورهای ریزوموکور میه هی در اثر اسید نیترو

 

 

شکل 3- مقایسه فعالیت دلمه کنندگی سویه‏ها‏ی والد و جهش یافته ریزوموکور میه هی

‏(‏error bar‏ها‏ نشان دهنده انحراف معیار 5 تکرار است‏‏‏) ‏

مقدار فعالیت دلمه کنندگی رنت حاصل از سویه والد SU.mL-1 1183 اندازه‏گیری‏‏‏ شد. این مقادیر در مورد ‏جهش یافته‏ها‏ی N-0227 و U-1113 به ترتیب SU.mL-1 1864 و SU.mL-1 1771 به دست آمد ‏(‏شکل 3).

همچنین، فعالیت پروتئولیتیکی رنت حاصل از سویه والد PU.mL-1 239/0 اندازه‏گیری‏‏‏ شد که این مقادیر برای جهش یافته‏ها‏ی N-0227 و U-1113 به ترتیب PU.mL-1 231/0 و PU.mL-1 222/0 به دست آمد ‏(‏شکل 4).

 

 

شکل 4 - مقایسه فعالیت پروتئولیتیکی سویه‏ها‏ی والد و جهش یافته ریزوموکور میه هی

(‏error bar‏ها‏ نشان دهنده انحراف معیار 5 تکرار است‏‏‏) ‏

 

نتایج مربوط به نسبت  ‏آنزیم سویه‏ها‏ی والد و جهش یافته ریزوموکور میه هی ‏در شکل 5 آمده است. همان گونه که ملاحظه می‏‏‏شود، این کمیت برای سویه والد، ‏U-1113 ‏و N-0227 به ترتیب 5037، 8193 و SU.PU-1 8114 به دست آمده است.

 

شکل 5- ‏مقایسه نسبت  ‏آنزیم سویه‏ها‏ی والد و جهش یافته ریزوموکور میه هی

(‏error bar‏ها‏ نشان دهنده انحراف معیار 5 تکرار است‏‏‏) ‏

 

شکل 6 سینتیک تولید آنزیم را تا 144 ساعت نشان می‏‏‏دهد. همان گونه که مشاهده می‏‏‏شود، تولید رنت از ‏سویه‏ها‏ی جهش یافته و والد تا زمان 96 ساعت، با آهنگ کمابیش یکسانی افزایش یافته است. اما پس از 96 ساعت، تولید رنت از سویه‏ها‏ی جهش یافته در مقایسه با سویه والد، شتاب بیشتری گرفته، به طوری که در زمان 144 ساعت پس از کشت، این اختلاف کاملا مشخص شده است.

 

شکل 6- ‏مقایسه سینتیک تولید رنت حاصل از سویه والد و جهش یافته‏ها‏

 

در مورد سویه والد، بازدهی تولید آنزیم نسبت به منابع کربن و نیتروژن به ترتیب 44308 و
SU.g-1 230245 محاسبه شد؛ این کمیت‏ها‏ برای
N-0227 به ترتیب 69822 و 362828 و برای U-1113 به ترتیب66308 و SU.g-1 344571 به دست آمد
(‏شکل 7). ‏

 

شکل 7- ‏مقایسه بازدهی تولید رنت از سویه والد و جهش یافته‏ها‏ نسبت به منابع کربن و نیتروژن محیط تولید

(‏error bar‏ها‏ نشان دهنده انحراف معیار 5 تکرار است‏‏‏) ‏

 

همچنین، بهره‏وری‏‏ آنزیم نیز در سویه والد، 22/8 و در جهش یافته‏ها‏ی ‏N-0227وU-1113، به ترتیب ‏95/12 و SU.h-1.mL-1 3/12 محاسبه شد ‏(‏شکل 8). ‏

 

شکل 8- ‏مقایسه بهره‏وری‏‏ تولید رنت از سویه والد و جهش یافته‏ها‏

(‏error bar‏ها‏ نشان دهنده انحراف معیار 5 تکرار است‏‏‏) ‏

نتایج ارزیابی ضریب رشد ویژه در شکل 9 نمایش داده شده است. همانگونه که ملاحظه می‏‏‏شود این کمیت برای سویه والد 97/1 و برای جهش یافته‏ها‏ی
N-0227وU-1113، به ترتیب 9/1 وh-1 ‏78/1 اندازه‏گیری‏‏‏ شد.

 

شکل 9- ‏مقایسه ضریب رشد ویژه سویه والد و جهش یافته‏ها‏

(‏error bar‏ها‏ نشان دهنده انحراف معیار 5 تکرار است‏‏‏)

 

بحث و نتیجه‏گیری

پیش از القای جهش، دوز‏ها‏ی بهینه عوامل جهش‏زا‏‏ی مورد استفاده ‏(‏اسید نیترو و UV) ‏‏برای از بین بردن 99/99 درصد‏‏‏ از اسپورهای تلقیح شده، تعیین شد. در نتیجه احتمال یافتن جهش یافته در بین کلونی‏‏‏ها‏ی تشکیل شده، بیشتر شد. به همین دلیل ابتدا منحنی‏ها‏ی مرگ اسپورهای ریزوموکور میه هی در اثر تیمار با اسید نیترو و UV رسم شد ‏(‏25 و 26).

پس از آن، به منظور القای جهش و ایجاد سویه‏ها‏ی جهش یافته از دوز‏ها‏ی بهینه اسید نیترو و UV استفاده شد. به منظور یافتن جهش یافته برتر از نظر تولید رنت، جهش یافته‏ها‏ی ایجاد شده از نظر فعالیت دلمه کنندگی آنزیم شده و از میان آن‏ها‏، سویه‏ها‏ی با فعالیت پروتئولیتیکی کمتر انتخاب شدند.

 از بین جهش یافته‏ها‏ی مورد ارزیابی که با اسید نیترو تیمار شده بودند، در نهایت جهش یافته ای با نام انتخابی ‏N-0227، جداسازی شد. به همین ترتیب جهش یافته دیگری با نام انتخابی U-1113 که حاصل تیمار با UV بود، جدا شد. به منظور اطمینان از پایداری جهش‏ها‏ی ایجاد شده در جهش یافته‏ها‏ی یاد شده‏‏، 10 بار تجدید کشت متوالی انجام شد و فعالیت آنزیم آن‏ها‏ اندازه‏گیری‏‏‏ شد. در نهایت پس از حصول اطمینان از پایداری، رنت تولیدی از آن‏ها‏ از نظر کیفی و کمی با رنت سویه والد مقایسه شد‏‏.

در این پژوهش، فعالیت دلمه کنندگی اندازه‏گیری‏‏‏ شده برای سویه والد ‏(‏SU.mL-1 1183)‏، با نتایج داسیلویرا و همکاران ‏(‏SU.mL-1 1105) ‏کاملا منطبق بود ‏(‏11). ضمن آن که نتایج ‏تجزیه ‏واریانس ‏داده‏ها‏ی مربوطه ‏نشان ‏داد که ‏فعالیت ‏دلمه کنندگی ‏رنت ‏حاصل ‏از ‏N-0227وU-1113، به ترتیب 6/57 و 7/49 درصد در مقایسه با سویه والد افزایش یافته است ‏(‏05/0P value<)‏؛ در حالی که فعالیت پروتئولیتیکی سویه جهش یافته یاد شده‏‏ تغییر معنی داری در مقایسه با سویه والد نشان نداد
‏(‏05/0P value>). به این ترتیب با افزایش فعالیت دلمه کنندگی و ثبات نسبی فعالیت پروتئولیتیکی، نسبت  آنزیم، 6/62 درصد در N-0227 و 1/61 درصد در U-1113 افزایش یافت‏(‏05/0P value<). هر چه مقدار نسبت  آنزیم بیشتر باشد، آنزیم اختصاصی تر عمل کرده و راندمان دلمه در فرآیند تهیه پنیر بیشتر خواهد بود. به عبارت دیگر هر چه این نسبت بیشتر باشد، کیفیت رنت بیشتر و کارایی آن بالاتر است‏‏‏ (‏27).

همچنین، نتایج به دست آمده از سینتیک تولید آنزیم، با گزارش‏ها‏ی سکر و همکاران، روی ریزوموکور میه هی منطبق است. طبق گزارش یاد شده، منحنی سینتیک تولید آنزیم تا حدود 420 ساعت پس از تلقیح، حالتی صعودی داشته و پس از آن نزول پیدا می‏‏‏کند ‏(‏10). در این پژوهش، سینتیک تولید آنزیم تا 144 ساعت ارزیابی شد.

همچنین، نتایج به دست آمده برای بازدهی آنزیم سویه والد، نسبت به منبع کربن و نیتروژن محیط که به ترتیب 44308 و SU.g-1 230245 اندازه‏گیری‏‏‏ شد، نسبت به نتایج دلیما و همکاران به ترتیب 5/62 و 5/53 درصد بیشتر بود ‏(‏12). این تفاوت می‏‏‏تواند با در نظر گرفتن ترکیب محیط کشت و شرایط حاکم بر آزمایش توجیه شود؛ به طوری که فرمولاسیون محیط کشت و شرایط آزمایشی در این پژوهش نسبت به تحقیق دلیما و همکاران، در افزایش بازدهی آنزیم تاثیرگذارتر بوده است. ضمن آن که نتایج تجزیه واریانس داده‏ها‏ی مربوط به بازدهی آنزیم سویه والد و جهش یافته‏ها‏، وجود تفاوت معنی‏دار را نشان داد ‏(‏05/0P value<). بنابراین،‏‏‏‏ ‏بازدهی آنزیم در سویه‏ها‏ی N-0227 و U-1113 به ترتیب 6/57 و 7/49 درصد نسبت به سویه والد افزایش یافت. این نتایج به خوبی نشان می‏‏‏دهد که در ازای مقدار یکسان مواد موجود در محیط تولید، سویه‏ها‏ی جهش یافته نسبت به سویه والد، توانایی بیشتری در سنتز آنزیم داشته اند.

نتایج به دست آمده برای بهره‏وری‏‏ آنزیم در سویه والد ‏(‏SU.h-1.mL-1 22/8) ‏با نتایج داسیلویرا و همکاران ‏(‏SU.h-1.mL-1 88/8) ‏قابل مقایسه است ‏(‏11). این رقم در مورد جهش یافته‏ها‏ی N-0227و U-1113، به ترتیب 6/57 و 7/49 درصد نسبت به سویه والد افزایش یافت ‏(‏05/0p<). نتایج حاصل از محاسبه بهره‏وری‏‏ نشان داد که به ازای حجم تولید و زمان یکسان، تولید آنزیم توسط جهش یافته‏ها‏نسبت به سویه والد بیشتر است.

بر اساس مطالعات سکر و همکاران، روند تولید زیست توده در کپک ریزوموکور میه هی تا حدود 190 ساعت پس از تلقیح، به شکل‏‏ خطی و با آهنگی کمابیش یکنواخت ادامه یافته و پس از آن تقریبا ثابت می‏‏‏شود ‏(‏10). بنابراین،‏‏ نتایج به دست آمده با نتایج دلیما و همکاران منطبق است. به طوری که ضریب رشد ویژه در مطالعات آن‏ها‏ رقمی در حدود h-1 13/2 محاسبه شد که با ضریب رشد ویژه اندازه‏گیری‏‏‏ شده برای سویه والد در این پژوهش ‏(‏h-1 97/1) ‏قابل مقایسه است ‏(‏12).

در این طرح، ضریب رشد ویژه در N-0227در مقایسه با سویه والد، رقمی کم و بیش معادل بوده و اختلاف معنی‏داری ندارد ‏(‏05/0P value>). اما ضریب رشد ویژه جهش یافته ‏U-1113، حدود 6/9 درصد کاهش یافته است ‏(‏05/0P value<). به طوری که این مقدار از h-1 97/1 در سویه والد به h-1 78/1 در سویه جهش یافته U-1113 کاهش داشته است. با توجه به این که از یک سو القای جهش توسط تابش UV به طور تصادفی روی ساختار DNA تاثیرگذار است و از سوی دیگر برنامه انتخاب جهش یافته برتر، بر اساس فعالیت دلمه کنندگی بالا و فعالیت پروتئولیتیکی پائین آنزیم رنت تولیدی انجام گرفت، کاهش ضریب رشد ویژه توجیه می‏شود. هر چند مقدار این کاهش کمابیش ناچیز بوده است، اما با توجه به تحقق هدف اصلی طرح ‏(‏افزایش نسبت )‏، این مقدار کاهش در ضریب رشد ویژه در سویه U-1113 قابل چشم پوشی است.

به این ترتیب دستاورد‏ها‏ی این تحقیق به طور خلاصه به شرح زیر است‏‏‏:

  • در این پژوهش، با استفاده از تکنیک جهش و انتخاب و با کاربرد دوز بهینه از عامل جهش‏زا‏‏ی اسید نیترو، ‏سویه ای از اصلاح و جهش یافته ای به نام
     ‏N-0227 ایجاد شد که فعالیت دلمه کنندگی رنت حاصل از آن، 6/57 درصد بیشتر بود.
  • همچنین، با استفاده از تکنیک جهش و انتخاب و با کاربرد دوز بهینه از عامل جهش‏زا‏‏ی UV، ‏سویه ای از اصلاح و جهش یافته ای به نام ‏U-1113 ایجاد شد که فعالیت دلمه کنندگی رنت حاصل از آن، 7/49 درصد بیشتر بود.
  • با توجه به این که فعالیت دلمه کنندگی افزایش و فعالیت پروتئولیتیکی تقریبا بدون تغییر بوده است، طبق محاسبات انجام گرفته نسبت  ‏رنت تولیدی در N-0227وU-1113، به ترتیب ‏6/62 و 1/61 درصد افزایش یافت. به این ترتیب کیفیت رنت تولید شده توسط سویه جهش یافته بیشتر بوده و رنت حاصل از آن برای فرآیند پنیرسازی مناسب تر است.
  • جهش یافته‏ها‏ی یاد شده‏‏ برای تولید رنت، دارای بازدهی و بهره‏وری‏‏ بیشتری نسبت به سویه والد بودند. بدیهی است که استفاده از سویه ای با بازدهی و بهره‏وری‏‏ بیشتر، برای تولید صنعتی رنت مناسب‏تر است.

 

 

جدول 1- ‏مقایسه شاخص‏های سنجش شده برای سویه‏ها‏ی جهش یافته ‏نسبت به سویه والد

کمیت مورد بررسی

سویه مورد بررسی ‏(‏درصد تغییر) ‏

سویه والد

N-0227

U-1113

فعالیت دلمه کنندگی ‏(‏SU.mL-1) ‏

1183

(‏6/57) ‏1864

(‏7/49) ‏1771

فعالیت پروتئولیتیکی ‏(‏PU.mL-1) ‏

239/0

(‏ns*) ‏231/0

(‏ns) ‏222/0

نسبت

5037

(‏7/62) ‏8193

(‏1/61) ‏8114

بهره‏وری‏‏ ‏(‏SU.h-1.mL-1) ‏

22/8

(‏6/57) ‏95/12

(‏7/49) ‏3/12

بازدهی نسبت به منبع کربن ‏(‏SU.g-1) ‏

44308

(‏6/57) ‏69822

(‏7/49) ‏66408

بازدهی نسبت به منبع نیتروژن ‏(‏SU.g-1) ‏

230245

(‏6/57) ‏362828

(‏7/49) ‏344571

ضریب رشد ویژه ‏(‏h-1) ‏

97/1

(‏ns) ‏9/1

(‏6/9-) ‏78/1

* ns: تغییر اندازه‏گیری‏‏‏ شده معنی‏دار نیست.

 


تشکر و قدردانی

از همکاری‏ و کمک‏های خانم‏ها‏ شکری، غازی، سجادی و نوری و نیز آقایان آهی و شرفی و همین‏طور تمام کارکنان پژوهشکده زیست فناوری سازمان پژوهش‏ها‏ی علمی و صنعتی ایران، به ویژه آقایان مرادی و عربی که در انجام دادن این تحقیق ما را یاری نموده‏اند، تشکر و قدردانی می‏شود‏‏.

 

 

 

 



[1]- Milk-Clotting activity to Proteolytic activity ratio

[2]- Rhizomucor miehei

[3]- Ward et al.

[4]- Kapralek et al.

[5]- Bodie et al.

[6]- Seker et al.

[7]- da Silveira et al.

[8]- de Lima et al.

[9]- Mutagenesis

[10]- Screening

[11]- Fungaro et al.

[12]- Candida Tsukubaensis

[13]- Nitrous Acid ‏(‏HNO2) ‏

[14]- Quelab

[15]- Philips

[16]- Biochrom Biowave II

[17]- N-Biotek NB-205VL

[18]- SPSS ver.16 ) ‏‏SPSS Inc., Chicago, USA (‏‏

[19]- Microsoft Office Excel 2007

References

(‏1) ‏Crabbe MJC. Rennets: general and molecular aspects. In: Westwood F, editor. Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology. 3rd edition. London: Oxford University Press; 2004. p 24-53.

(‏2) ‏Fungaro MHP, de Souza Junior ‏CL, de Azevedo JL, Pizzirani-Kleiner AA. Recurrent mutation- selection to improve rennet production in Candida tsukubaensis. Rev. Brasil Genet 1994; 14 ‏(‏2): 377-82.

(‏3) ‏McSweeney PLH. Biochemistry of cheese ripening. Dairy Tech 2004; ‏57 ‏(‏4): 127-44.

(‏4) ‏Rotaru G, Mocanu D, Uliescu M, Andronoiu D. Research studies on cheese brine ripening. Food Biotechnol2008; 2 ‏(‏2): 30-39.

(‏5) ‏Sardinas JL. Rennin Enzyme of Endothia parasitica. App microbiol 1968; 16 ‏(‏3): 248-55.

(‏6) ‏Tubesha ZA, Al-Delaimy KS. Rennin-like milk coagulant enzyme produced by a local isolate of Mucor. Dairy Tech; 2003; 16 ‏(‏1): 237-241

(‏7) ‏Ward ‏M, Wilson LJ, Komada KH, Rey MW, Berka RM. Improved production of chymosin in Aspergillus by expression as a glucoamylase-chymosin fusion. Biotech 1990; 8: 435-40.

(‏8) ‏Kaprálek F , Jecmen P, Sedlaècek J, Fábry M, Zadrazil S. Fermentation conditions for high-level expression of the tac-promoter-controlled calf prochymosin cDNA in Escherichia coli HB101. Biotech ‏Bioeng 1991; 37: 71-79.

(‏9) ‏Bodie EA, Armstrong GL, Dunn-Coleman NS. Strain improvement of chymosin-producing strains of Aspergillus niger var. awamori using parasexual recombination. Enz. and Microl. Tech 1994; 16 ‏(‏5): 376-82.

(‏10) ‏Seker S, Beyenal H, Ayhan F, Tanyolac, A. Production of microbial rennin from Mucor miehei in a continuously fed fermenter. Enzyme and Microbial Tech 1998; 23 ‏(‏2): 469-74.

(‏11) ‏Da Silveira GG, de Oliveira GM, Ribeiro EJ, Monti R, Contiero J. Microbial rennet produced by Mucor miehei in solid-state and submerged fermentation. Brazilian archives of biology and tech 2005; ‏48 ‏(‏2): 931-37.

‏(‏12) ‏de Lima C, Cortezi M, Lovaglio RB, Ribeiro EJ, Contiero J, de Araujo E. Production of rennet in submerged fermentation with the filamentous fungus Mucor miehei NRRL 3420. World app sci ‏2008; 4 ‏(‏1): 578-85.

(‏13) ‏Fungaro MHP, de Souza Junior CL, de Azevedo JL, Pizzirani-Kleiner AA. Recurrent mutation-selection to improve rennet production in Candida tsukubaensis. Rev. Brasil Genet 1994; 14: 377-82.

(‏14) ‏Smith KC. Experiments: UV radiation effects on molecules and cells. Plenum Press 2010; 113-42.

‏(‏15) ‏Ikehata H, Ono T. The mechanisms of UV mutagenesis. Journal of Radiat Res 2011; 52 (‏2):115-25.

(‏16) ‏Faisal RM. The application of the mutagen nitrous acid to improve the free living nitrogen fixation ability of Azotobacter spp. Raf.J.Sci 2013; 24 (1) : 44-53.

(‏17) ‏Bayram O, Biesemann C, Krappmann S, Galland P, Braus GH. More Than a Repair Enzyme: Aspergillus nidulans Photolyase-like CryA Is a Regulator of Sexual Development. Molecular Biol Cell 2008; 19 ‏(‏2): 3254-62.

(‏18) ‏Carlton BC, ‏Brown AJ. Gene mutation. In: Gerhardt P, editor. Manual of Methods for General Bacteriology. Washington DC: American Society for Microbiol; 1981. P 222- 42.

(‏19) ‏El-Bendary MA, Moharam ME, Ali TH. Purification and characterization of milk clotting enzyme produced by Bacillus sphaericus. Journal of App Sci Research 2007; 3 (‏8): 695-99.

(‏20) ‏Beynon R, Bond JS. Proteolytic enzymes: a practical approach. 2nd Edition. USA: Oxford University Press; 2001. P 47-48.

(‏21) ‏Savergave LS, Gadre RV, Vaidya BK, Narayanan K. Strain improvement and statistical media optimization for enhanced erythritol production with minimal by-products from Candida magnoliae mutant R23. Biochem Engineering Journal 2010; 55 ‏(‏1): 92–100.

(‏22) ‏Goshadrou A, Karimi K, Taherzadeh MJ. Bioethanol production from sweet sorghum bagasse by Mucor hiemalis. Indus Crops and Products2011; ‏34 ‏(‏4): 1219-25.

(‏23) ‏Belewu MA, Yahaya AA. Effects of Aspergillus niger treated Shea butter cake based diets on nutrient intake and weight gain of Red Sokoto goat. African Journal of Biotechnol  2008; 7 ‏(‏9): 1357-61.

(‏24) ‏Lin S, Mao S, Guan Y, Lue L, Pan Y. Effects of dietary chitosan oligosaccharides and Bacillus coagulans on the growth, innate immunity and resistance of koi ‏(‏Cyprinus carpio koi). Aquaculture 2012; ‏342 ‏(‏6): 36-41.

(‏25) ‏Parry JM, Cox BS. Photoreactivation of Ultraviolet Induced Reciprocal Recombination, Gene Conversion and Mutation to Prototrophy in Saccharomyces cerevisiae. H. gen. Microbiol 1965; 402 ‏(‏4): 235-41.

(‏26) ‏Besoain XA, Perez LM, Araya A, Lefever L, Sanguinetti M, Montealegre JR. New strains obtained after UV treatment and protoplast fusion of native Trichoderma harzianum: their biocontrol activity on Pyrenochaeta lycopersici. Electronic journal of biotechnol. 2007; 10 (‏4): 605-617.

(‏27) ‏Chitpinityol S, Crabbe MJC. Review: Chymosin and aspartic proteinases. Food Chem. ‏1998; 61 ‏(‏4): 395-418.