جداسازی و شناسایی باکتری‌های تجزیه‌کننده سم آلی کشاورزی فنیتروتیون از باغات پسته استان کرمان

نویسندگان

1 کارشناس ارشد میکروب‌شناسی، دانشگاه علوم و تحقیقات شعبه مرکزی اراک، ایران

2 استادیار میکروب‌شناسی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، ایران،

3 استادیار شیمی تجزیه، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، کرمان، ایران

چکیده

  مقدمه : سموم آلی کشاورزی از ساختار پیچیده مولکولی برخوردارند. همچنین، در اکوسیستم‌ها و بیوسفر زمین دارای پایداری بالایی هستند. این سموم با تاثیر بر شرایط خاک و تخریب و کاهش توان زراعی، اثرات مخربی برکیفیت زندگی انسان می‌گذارند‏‏.   مواد و روش‏‏ها: در این تحقیق ، برای جداسازی باکتری‌های تجزیه کننده سم آلی کشاورزی فنیتروتیون نمونه‌برداری از باغ‌های پسته استان کرمان انجام شد. با استفاده از روش غنی‌سازی در محیط بوشنل- هاس همراه با سم آلی مورد نظر (فنیتروتیون) به عنوان منبع کربن، باکتری‌های تجزیه کننده جداسازی شدند. سپس، با انجام PCR برای تکثیر قسمتی از ژن 16S rRNA سویه‌های برتر تجزیه کننده، تعیین توالی و شناسایی شدند .   نتایج: نتایج به دست آمده نشان داد اکوسیستم خاک باغ‌های پسته دارای باکتری‌های تجزیه کننده مناسبی برای حذف سم فنیتروتیون از خاک و در نهایت محیط زیست هستند. در مجموع، 3 سویه باکتریایی تجزیه کننده سم آلی فنیتروتیون شناسایی شدند. این 3 سویه شامل: باکتری‌های Pseudomonas fluorescens strain F1 ،Bacillus cereus strain F3 و Pseudomonas aeruginosa strain F4 بودند. در ادامه اثر غلظت سم بر رشد سویه‌ برتر تجزیه کننده بررسی شد. تجزیه کننده برتر فنیتروتیون (سویه F4 ) تا غلظت ppm 100 رشد را نشان داد. پس از این غلظت، کاهش رشد باکتری مشاهده شد. نتایج حاصل از گاز کروماتوگرافی قدرت تجزیه سم آلی توسط باکتری‌های تجزیه کننده را تایید نمود.   بحث و نتیجه‏گیری: نتایج این تحقیق نشان داد باکتری‌های تجزیه کننده سم آلی کشاورزی (فنیتروتیون) در اکوسیستم خاک باغ‌های پسته استان کرمان به عنوان قطب پسته کشور وجود دارد. انتظار می‌رود با استفاده از این باکتری‌ها و استفاده از روش‌های احیا زیستی بتوان مشکلات زیست محیطی ناشی از تاثیرات این سم آلی را کاهش داد.  

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and characterization of Fenitrothion-degrading bacteria from pestachio gardens in Kerman Provinance

نویسندگان [English]

  • Mehrnosh Ghafari 1
  • Mehdi Hassanshahian 2
  • Mohammad Mahani 3
1 M.Sc. of Microbiology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Arak , Iran
2 Assistant Professor of Microbiology, Shahid Bahonar University of Kerman, Iran
3 Assistant Professor of Analytical Chemistry, Graduate University of Advanced Technology, Kerman, Iran
چکیده [English]

  Introduction : Pesticides with complex structure have high persistence in ecosystem and biosphere. Pesticides have harmful effects on farmlands, human and natural resources.   Materials and methods: In this study for isolation of pesticide-degrading bacteria (Fenitrothion) soil samples were collected from pistachio gardens in Kerman province. Collected soil samples were enriched in Bushnell Hass medium with this pesticide as only carbon and energy source. Isolated bacteria were identified by amplification of 16S rDNA gene by PCR and sequencing .   Results : In this study three Fenitrothion -degrading bacterial strains were isolated. These isolated bacteria were identified as: Pseudomonas fluorescens strain F1 ، Bacillus cereus strain F3 and pseudomonas aeruginosa strain F4 . The effects of pesticides concentration on each dominant bacterial strain were investigated. For Fenitrothion degrading bacterium (F4 strain) growth continue until 100 ppm and then decreased. The result of Gas Chromatography (GC) analysis confirmed the biodegradation ability of selected bacterial strains .   Discussion and conclusion : The results of this study demonstrated that there is a diversity of pesticide-degrading bacteria (Fenitrothion) in soil ecosystem farmlands of Kerman province. It is seemed by application of these pesticide-degrading bacteria in farmlands and using bioremediation technique the ecosystem contamination of pesticide can be decreased.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Soil Contamination
  • Pseudomonas
  • Biodegradation
  • Fenitrothion
  • Kerman

مقدمه

توسعه کشاورزی و تنوع آفات از مهم‏ترین عوامل مصرف روز افزون آفت کش‌ها در سراسر جهان به ویژه کشورهای رو به توسعه می‌باشند. ترکیبات ارگانوفسفره گسترده‌ترین حشره کش‌های مورد استفاده در دنیا هستند. گزارش‌ها نشان می‌دهد که قسمت‌های زیادی از آب و اکوسیستم‌های زمین به این ترکیبات آلوده هستند (1). فنیتروتیون حشره‏کش ارگانوفسفره‌ای با طیف گسترده است که در صورت حرارت داده شدن، گازهای سمی تولید می‏کند. این سم آلی در شرایط طبیعی مایعی به رنگ زرد  قهوه‏ای با بوی مشخص است. فنیتروتیون با فرمولاسیون مختلف وارد بازار می‌شود (2). به علت حلالیت کم در آب، نفوذ آن به آب‏های زیرزمینی نیز کم اما اتصال آن به خاک کمابیش شدید است و بسته به میزان هوادهی هفته‏ها تا ماه‏ها در خاک و حتی در آب باقی می‏ماند. مقادیر بسیار کمی از آن تبخیر و در فاصله چند روز تا چند هفته در جو تجزیه می‏شود. البته نمی‌توان اثرات زیست محیطی جهانی آن را نادیده گرفت. امولسیون فنیتروتیون در جانداران آبزی قابلیت تجمع دارد و در آب سخت نیز پایداری خوبی از خود نشان می‌دهد(2 و 3). پسته مهم‏ترین محصول ارز‏-آور کشاورزی و پس از نفت و فرش سومین کالای مهم صادراتی ایران است. استان کرمان، بزرگ‏ترین تولیدکننده پسته در کشور است. میزان تولید پسته استان کرمان حدود 7/89 هزار تن می باشد که شهرستان رفسنجان با 8/39 درصد تولید استان، مقام اول را دارد. برای درختان پسته و میوه آن، حدود ۵۳ تا 60 آفت و حدود ۹ تا ۱۱ بیماری وجود دارد. به شکل تصادفی از ۴۰ تا ۱۰۰ درصد خسارت باغ‌های پسته کشور، به آفات و بیماری‏ها مربوط است. در حال حاضر هم تعداد آفات و بیماری‏ها و هم خسارات آن‏ها در حال افزایش است. فنیتروتیون و دیازینون از مهم‏ترین آفت‌کش‏های فسفره‏ای هستند که در باغ‏های پسته استفاده می‏شوند(4). آفت‏کش‏ها به واسطه عوامل شیمیایی، فیزیکی و زیستی از خاک حذف می‏شوند. برخی از آفت‏کش‏ها بسیار سریع توسط میکروارگانیسم‏ها تجزیه می‏شوند و برخی از آن‏ها در مقابل تجزیه میکروبی بسیار سرسخت هستند. گروه‌های مختلفی از میکروارگانیسم‏ها شامل قارچ‏ها و باکتری‏ها در تجزیه سموم کشاورزی موثرند. باکتری‏هایی از اعضای جنس‏های Alcaligenes، Flavobacterium، Pseudomonasو Rhodococcusدر متابولیزه کردن آفت‏کش­ فنیتروتیون نقش دارند. بسیاری از میکروارگانیسم‏های خاک قابلیت تبدیل آفت‏کش فنیتروتیون به ترکیبات غیر‌سمی را دارند که به این فرایند "تجزیه زیستی"[1] می‌گویند. در این فرایند هم منبع کربن و هم انرژی از طریق آفت کش‌ فراهم می شود. به نظر می‌رسد میکروارگانیسم‏ها بهترین گزینه برای متابولیزه کردن سموم کشاورزی و حذف آن‏ها برای بهبود شرایط خاک، کیفیت زندگی در اکوسیستم هستند (5). محصولات ناشی از هیدرولیز فنیتروتیون به واسطه تجزیه باکتری‌ها شامل: 90 درصد 3-متیل-4-نیتروفنل[2] و 10 درصد فنیترواکسون[3] است؛ که فنیترواکسون حتی با این مقدار کم هم برای پستانداران دارای سمیت بالایی است. در شرایط قلیایی فنیترواکسون نیز به 3-متیل-4-نیتروفنل تبدیل می‌شود. محصولات نهایی اکسیداتیو 3-متیل-4-نیتروفنل، چهار اسید آلیفاتیک کوچک (اسید فرمیک[4]، اسید اگزالیک[5]، اسیدمالئیک[6]، اسید متیل مالئیک[7]) است. پژوهش‏‏ها نشان می‌دهد حداکثر اکسیداتیو فنیتروتیون در اسیدیته 8 تا 12 رخ می‌دهد(1 و 6).

 

 

 

شکل1- مسیر تجزیه فنیتروتیون

 

 

 

هدف از این تحقیق، بررسی وجود باکتری‌های تجزیه کننده سم کشاورزی فنیتروتیون در باغات پسته استان کرمان و سپس، سنجش قابلیت تجزیه زیستی آن ‏برای حذف سم کشاورزی فنیتروتیون است.

 

مواد و روش‏ها

نمونه‌برداری از مناطق آلوده به سموم کشاورزی برای جداسازی باکتری‌های تجزیه کننده

نمونه‏برداری در دو فصل زمستان و بهار در شرایط استریل از باغ‌های پسته انجام شد. با استفاده از دستکش استریل لایه رویی خاک (کاه و کلش) کنار زده شد، سپس از عمق صفر تا 10 سانتی‏متری خاک نمونه برداری شد. نونه‏‏ها داخل کیسه پلاستیکی استریل ریخته، درب پاکت به خوبی بسته شدند و تا زمان رسیدن به آزمایشگاه، در یخچال(درجه سانتی‏گراد4) قرار گرفتند. مناطق نمونه برداری همراه با شماره آن‏ها در جدول شماره(1) نشان داده شده است.

 

جدول1- مناطق نمونه‌برداری همراه با اسم اختصاری

شماره نمونه‌برداری

مناطق نمونه برداری

S1

خاک باغ پسته مرکز آموزش جهاد کشاورزی

S2

خاک باغ پسته(اسلام آباد) رفسنجان

S3

خاک باغ پسته (تلمبه حسین آباد) رباط

S4

خاک باغ پسته (هرمز آباد) رفسنجان

S5

خاک باغ پسته (کبوترخان) رفسنجان

S6

خاک باغ پسته (نوق)، شماره 1، رفسنجان

S7

خاک باغ پسته (نوق)، شماره2، رفسنجان

S8

خاک باغ پسته(داوران) زرند

S9

خاک باغ پسته(چترود) کرمان

S10

خاک باغ پسته، شماره 3، رفسنجان

 

محیط‌های کشت مورد استفاده

  • محیط نوترینت-آگار بر طبق دستورالعمل کارخانه سازنده تهیه شد.
  • محیط پلیت کانت- آگار بر طبق دستورالعمل کارخانه سازنده تهیه شد.
  • ·     محیط بوشنل-هاس[8]براث و آگار با ترکیب : پتاسیمدی‌هیدروژن فسفات[9](1گرم)، دی‌پتاسیم‌ هیدروژن فسفات[10] (1گرم)، دی آمونیوم سولفات[11] (1گرم)، سولفات منیزیم[12] (4/0 گرم)، کلرید آهنIII[13] ( 004/0 گرم)، کلرید کلسیم[14] (02/0 گرم) در هر لیتر محیط و اسیدیته محیط7 است. پس از همگن کردن محیط، در دمای درجه سانتی‏گراد 121 به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شد. برای تهیه محیط بوشنل-هاس، آگار با غلظت 15 درصد اضافه شد. تنها منبع کربن این محیط سم آلی کشاورزی فنیتروتیون است. محیط بوشنل- هاس یا MSM باید در دمای 8 درجه سانتی‏گراد و دور از نور مستقیم نگهداری ‌‌شود(7)

شمارش جمعیت باکتری‌های هتروتروف خاک

شمارش، پس از نمونه برداری در حداقل زمان ممکن انجام شد. رقت‏های سریال ده تایی تهیه و به روش پلیت کانت شمارش شد. پلیت‌ها 24 ساعت در دمای درجه سانتی‏گراد30 گرمخانه‌گذاری شدند. سپس، رقت‌های مختلف حاوی 20 تا 200 کلونی، توسط کلونی کانتر، شمارش و با استفاده از رابطه1 تعداد باکتری‌ها گزارش شد.

تعداد کلونی‏ در هر میلی‏‏لیتر[15] = میانگین تعداد کلونی در سه پلیت × عکس ضریب رقت×10 =رابطه (1)

 

جداسازی باکتری‌های تجزیه کننده سم کشاورزی فنیتروتیون

برای جداسازی باکتری‌های تجزیه‌ کننده سم کشاورزی فنیتروتیون از محیط بوشنل‌- هاس (BH) براث استریل با اضافه کردن غلظتی از سم که در نهایت غلظت آن معادل ppm 50 باشد، استفاده شد. از نمونه‌های خاک 5 گرم به 100سی‌سی از این محیط برای غنی‏سازی اولیه تلقیح شد و در انکوباتور شیکردار در دمای 25 تا 30 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. برای ممانعت از تجزیه نوری سم ارلن‌ها با ورقه آلومینیم پوشانده شد. پس از گذشت 12 روز از این محیط برداشته شد و به محیط جدید BH انتقال یافت. این کار تا 3 پاساژ ادامه یافت. از آخرین پاساژ میزان 100 میکرولیتر روی محیط کشت نوترینت آگار به روش کشت چمنی[16] کشت داده شد. سپس با روش کشت خطی، کلونی‏‌های حاصل از کشت چمنی برداشت شده و به شکل کشت خالص بر روی محیط نوترینت آگار جدید کشت داده شده است. در نهایت برای بررسی قدرت رشد بر روی محیط بوشنل هاس آگار به روش خطی[17] کشت داده شدند(7).

 غربال‏گری بهترین سویه‌های تجزیه کننده سم فنیتروتیون

برای غربال‏گری بهترین سویه‏‌های تجزیه‌‌کننده سم از محیط بوشنل- هاس براث حاوی ppm  50 فنیتروتیون استفاده شد. پس از گذشت12 روز، کلونی‌های باکتری‌ها در رقت‌های یکسانی از سم شمارش و بهترین سویه‌ با توجه به بیش‏ترین تعدادکلونی‌ها انتخاب و غربال‏گری شد.

بررسی اثر غلظت‌های مختلف فنیتروتیون بر روی رشد باکتری‌های برتر

پس از غربال‏گری سویه برتر تجزیه‌کننده سم، اثر 6 غلظت مختلف شامل: (30، 50، 70، 100، 150 و ppm 170) بر روی میزان رشد این باکتر‌ی‌ بررسی شد. برای جلوگیری از تجزیه نوری سموم ارلن‌ها با ورقه آلومینیم پوشانده شد. پس از گذشت 12 روز برای فنیتروتیون، یک میلی‏‏لیتر از این محیط برداشته با مقایسه رقت‌های مختلف نمودار رشد بر حسب غلظت سم با توجه به تعداد کلونی‌ها رسم شد.

شناسایی باکتری‌های جداسازی شده

روش‌های بیوشیمیایی

رنگ آمیزی گرم و آزمون‌های TSI، سیمون سیترات، SIM، اکسایش، تخمیر قندها (OF)، هیدرولیز اوره، اکسیداز، کاتالاز، MR-VP، استفاده از نشاسته برای شناسایی اولیه باکتری‌های جداسازی شده استفاده شد(8).

شناسایی مولکولی باکتری‌های برتر تجزیه‌کننده سم فنیتروتیون

کلونی‏ها‏ی غربال‏گری شده با روش مولکولی دقیق‏تر شناسایی شدند. بدین منظور، ابتدا استخراج DNA از باکتری‏ها‏ با استفاده از کیت شرکت کیاژن طبق دستورالعمل کیت انجام شد. ‏سپس واکنش PCR با استفاده از پرایمرهای ویژه ژن 16S rDNA انجام شد. توالی این پرایمرها عبارت است از:

پرایمر برگشتی:

Uni_1492R 5'- TACGYTACCTTGTTACGACTT-3'

و پرایمر رفت:

Bac27_F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

 

واکنش PCR در حجم 25 میکرولیتر انجام شد (9). غلظت مواد مصرف شده در PCR شامل: بافر PCR ‏(20میلی‏مول Tris، 50 میلی‏مول KCl و 2 میلی‏مولMgCl2 ، پرایمر رفتی و برگشتی(12 پیکومول آنزیم Taq U 1، 200 میکرومولdNTP) و DNA الگو میزان 30  نانوگرم بود. برنامه PCR ‏شامل: دمای دناتوراسیون اولیه94 درجه سانتی‏گراد به مدت 5 دقیقه، دناتوراسیون 94 درجه سانتی‏گراد به مدت یک دقیقه، دمای اتصال پرایمرها 55 درجه سانتی‏گراد به مدت یک دقیقه، دمای تکثیر 72 درجه سانتی‏گراد به مدت یک دقیقه و تعداد سیکل‏ها‏ 35 است. محصول حاصل از PCR در ژل آگاروز 1 درصد بارگذاری شد و سپس باند bp1400 ‏از ژل آگاروز طبق دستورالعمل کیت فرمنتاز (K0513) استخراج و برای تعیین توالی فرستاده شد(10)‏‏. نتایج حاصل از تعیین توالی در بانک‏ها‏ی ژنی بلاست[18] و همولوژی آن‏ها‏ بررسی شد. قرابت بالاتر از 98 درصد به‏عنوان جنس و گونه باکتری مجهول در نظر گرفته شد شد (11).

 سنجش میزان تجزیه سموم کشاورزی (فنیتروتیون) با روش کروماتوگرافی گازی (GC)[19]

100میلی‌لیترمحیط بوشنل‌هاس براث استریل با غلظت ppm 50 سم تهیه شد. به هر ارلن 5/0سی‌سی از باکتری با غلظت نیم ‌مک‌فارلند اضافه و داخل انکوباتور شیکردار با دمای 30 درجه سانتی‏گراد به مدت 12 روز قرار داده شد. سپس، 10 میلی‏‏لیتر از محیط داخل ارلن را برداشته و با آب دیونیزه به حجم 50 میلی‏‏لیتر رسانده شد. سپس دو بار، هر بار به مدت نیم ساعت با 20میلی‏‏لیتر، n- هگزان بر روی شیکر قرار داده شد. پس از آن، با استفاده از قیف جداکننده فاز آلی را از فاز آبی جدا شده و ماده استخراج شده با استفاده از سولفات سدیم بدون آب، آب‏گیری شد. با استفاده از روتاری در دمای 45 درجه سانتی‏گراد، آن را خشک کرده و با 5 میلی‏‏لیتر استون به حجم رسانده شد. سپس، توسط دستگاه GC[20] با دتکتور FID، ستون [21]Hp-5، گاز حامل هیدروژن، گاز جبران کننده نیتروژن، دمای اولیه ستون 60 درجه سانتی‏گراد در 1 دقیقه، دمای نهایی ستون 270 درجه سانتی‏گراد، دمای تزریق 250درجه سانتی‏گراد و دمای دتکتور 300 درجه سانتی‏گراد تحلیل شد(7 و 9).

 

نتایج

نتایج حاصل از شمارش جمعیت باکتری‌های هتروتروف خاک در دو فصل

شمارش باکتری‌های هتروتروف در نمونه‌های خاک آلوده به سم کشاورزی فنیتروتیون، در محیط پلیت کانت آگار در دو فصل بهار و زمستان انجام شد. نتایج حاصل از این شمارش در جدول(2) آمده است. همان‏طور که انتظار می‌رفت جمعیت باکتری‌های تجزیه‌کننده در همه نمونه‌ها در فصل بهار نسبت به فصل زمستان بیشتر است که می‌تواند دلیل آن کاربرد بیشتر سموم در فصل بهار باشد.

 

جدول2- شمارش جمعیت باکتری‌های هتروتروف در نمونه‌های خاک باغات پسته در (CFU/ml)

نام نمونه

تعداد باکتری‌های هتروتروف در بهار

تعداد باکتری‌های هتروتروف در زمستان

S1

105×215

105×38

S2

106×30

106×12

S3

105×179

105×21

S4

104×95

104×25

S5

104×202

104×54

S6

104×165

104×20

S7

104×130

104×22

S8

105×97

105×22

S9

105×98

105×20

S10

105×38

105×10

 

نتایج حاصل از شمارش جمعیت باکتری‌های تجزیه‌کننده سم فنیتروتیون در نمونه‌های خاک

نتایج حاصل از شمارش جمعیت باکتری‌های تجزیه‌کننده در جدول (3) آمده است. همان گونه که در جدول مشاهده می‌شود. بیش‏ترین جمعیت باکتری‌های تجزیه‌کننده برای سم فنیتروتیون به نمونه S7 مربوط است.

 

جدول3- نتایج حاصل از شمارش جمعیت باکتری‌های تجزیه‌کننده سم

نام نمونه

وجود تجزیه‌کننده فنیتروتیون

S1

104×86

S2

104×40

S3

105×160

S4

-

S5

-

S6

-

S7

104×203

S8

104×22

S9

-

S10

-

 

نتایج حاصل از بررسی توانایی رشد باکتری‌های جداسازی شده از نمونه‌های خاک در محیط بوشنل-هاس آگار

همه باکتری‌های جداسازی شده و خالص شده توانایی رشد روی محیط بوشنل-هاس‌ ‌آگار را نداشتند. کلونی‌های باکتری‌های تجزیه‌کننده فنیتروتیون در مدت 3 تا 4 روز، روی محیط بوشنل-هاس‌ ‌آگار نمودار شدند. نتایج حاصل از این آزمایش در جدول (4) آمده است. همان‌طور که در جدول دیده می‌شود در نمونه‌های خاک S4، S5، S6، S9 و S10 باکتری تجزیه کننده‌ای برای فنیتروتیون شناسایی نشد.

جداسازی باکتری‌های تجزیه کننده سموم: ویژگی‏های باکتری‌ها

در طی این تحقیق 5 سویه باکتریایی تجزیه‌کننده فنیتروتیون از نمونه‌های خاک باغ‌های پسته در استان کرمان با حداقل فاصله 18 کیلومتری از یکدیگر جداسازی شدند که در جدول(4) برخی از ویژگی‏های باکتری‌ها آمده است.

 

 

جدول4- باکتری‌های جداسازی شده تجزیه کننده فنیتروتیون و ویژگی‏های آن‏ها

نام سویه

شکل باکتری و واکنش گرم

ویژگی‏های کلونی

TSI

سیمون سیترات

اکسیداز

کاتالاز

SIM

اوره‌آز

MR

O/F

ژلاتیناز

استفاده از نشاسته

F1

باسیل گرم منفی

گرد و محدب، موکوییدی لبه صاف به قطر mm1-2

Alk/Al K بدون گاز و H2S

+

+

+

---

-

+

-/+

+

-

F2

دیپلوباسیل گرم منفی

گرد و محدب به قطر mm1-2

A/A با گاز بدون H2S

+

-

+

+--

-

+

+/+

-

-

F3

دیپلوباسیل گرم مثبت

گرد و محدب خشن

A/A با گاز بدون H2S

+

-

+

+--

-

-

+/+

-

-

F4

باسیل گرم منفی

پیگمان‌دار به رنگ سبز- آبی

Alk/Al K بدون گاز و H2S

+

+

+

---

-

+

-/+

+

-

F5

باسیل گرم منفی

گرد و محدب موکوییدی

A/A بدون گاز و H2S

+

-

+

+--

-

+

+/+

-

-

 


انتخاب سویه‌های برتر از طریق بررسی ویژگی‏های باکتری‌ها و CFU

با توجه به صفات رشدی باکتری‌های جداسازی شده در محیط حاوی سم آلی کشاورزی (فنیتروتیون) به عنوان تنها منبع کربن برخی از سویه‌های باکتریایی جداسازی شده، که رشد پایینی در این شرایط داشتند، حذف شدند. معیار دیگر غربال‏گری برای انتخاب سویه‌های برتر در تجزیه سموم آلی شباهت‌های ریخت‏شناختی و فیزیولوژیک سویه‌های باکتریایی نزدیک به هم بود. در مجموع در چند مرحله غربال‏گری سویه‌های F1، F3، F4 برای مراحل بعدی کار انتخاب شدند. در نتیجه از 5 سویه جداسازی شده 3 سویه به عنوان سویه برتر انتخاب شدند.

شناسایی مولکولی سویه‌های برتر تجزیه کننده سم آلی فنیتروتیون

شناسایی مولکولی باکتری‌های قوی در تجزیه سموم آلی کشاورزی با تکثیر قسمتی از ناحیه ژنی 16S rRNAبا پرایمرهای ویژه این ژن (27F,1492R) انجام شد. سپس محصول bp  1400 حاصل از PCR از ژل استخراج، خالص‌سازی و تعیین توالی شد. توالی به دست آمده در بانک‌های ژنی بلاست شد و بالا‏ترین همولوژی (بالاتر از 98 درصد) به عنوان جنس و گونه‌ی باکتری تعیین شد. توالی به دست آمده و بالا‏ترین همسانی پس از بلاست کردن توالی به‏دست آمده، در بانک‌های ژنی به همراه شماره دستیابی توالی این سویه در پایگاه EMBL به شکل جداگانه برای هر سویه در جدول (5) آمده است. فیلوژنی و نزدیکی این سه سویه در شکل (2) آمده است.

 

جدول5- شناسایی مولکولی سویه‏های جداسازی شده

درصد شباهت

شماره دستیابی

شناسایی سویه

نام سویه

99

HF572853

Pseudomonas fluorescens

F1

98

HF572847

Bacillus cereus

F3

99

HF572851

Pseudomonas aeruginosa

F4

 

 

 

الف

 

ب

شکل2- درخت فیلوژنی سویه‌های شناسایی شده الف) سودوموناس ب) باسیلوس. درخت فیلوِنی با نرم افزار MEGA 5 و با روش Neighbor Joining رسم شده است.

 


بررسی میزان تجزیه با مقایسه نتایج به‏دست آمده از گازکروماتوگرافی

در شکل 3 پیک‌ها به سم فنیتروتیون و باکتری تجزیه کننده فنیتروتیون F1 باغلظت ppm 50 مربوط است که تمامی مراحل استخراج روی آن انجام شده است. شکل 4 نیز مقایسه تجزیه فنیتروتیون کنترل را با تجزیه توسط سویه‏های F3 و F4 نشان می‏دهد. همان‏طور که در نمودارها دیده می‏شود پیک مربوط به سم فنیتروتیون در همه باکتری‏های تجزیه کننده در مقایسه با شاهد کاهش در خور توجهی داشته است. اما این کاهش پیک در هر سه باکتری جداسازی شده به یک میزان نبوده است. بیش‏ترین میزان کاهش پیک سم فنیتروتیون مر بوط به باکتری F4 است در مجموع نتایج به دست آمده از گاز کروماتوگرافی تایید کننده تجزیه سم فنیتروتیون هستند.

 

 

 

 

شکل 3- نمودار فنیتروتیون کنترل(میزان تجزیه سم فنیتروتیون باغلظت ppm 50، بدون حضور باکتری می‌باشد که تمامی مراحل استخراج روی آن انجام شده است.) و تجزیه فنیتروتیون توسط باکتری F1( میزان تجزیه سم فنیتروتیون باغلظت ppm 50، باحضور باکتری Pseudomonas fluorescens است که تمامی مراحل استخراج روی آن انجام شده است). علامت فلش به پیک فنیتروتیون مربوط است.

 


 

شکل 4- نمودار تجزیه فنیتروتیون توسط باکتری F3 و باکتری F4 (تجزیه سم فنیتروتیون باغلظت ppm 50، باحضور باکتری Bacillus cereus و Pseudomonas aeruginosa  است که تمامی مراحل استخراج روی آن انجام شده است). علامت فلش به پیک فنیتروتیون مربوط است.

 

 

شکل4- ادامه

 

 

شکل 5- اثر غلظت‌های مختلف سم فنیتروتیون بر رشد سویه برتر F4 (Pseudomonas aeruginosa)


اثر غلظت‌های مختلف سموم آلی کشاورزی بر رشد باکتری‌های برتر تجزیه کننده

تاثیر غلظت‌های مختلف سم آلی فنیتروتیون بر رشد باکتری‌های تجزیه کننده که غربال‏گری شده بودند، با کشت این باکتری‌ها در غلظت‌های فزاینده سموم آلی از ppm 30- 170 انجام شد. نتایج برای این سم در شکل 5 نشان داده می‌‌شود. برترین سویه تجزیه‌کننده فنیتروتیون F4 که در این پژوهش Pseudomonas aeruginosa شناسایی شده است. تا غلظت ppm  100 افزایش رشد داشته است و پس از آن در غلظت‌های بالاتر رشد کاهش می‌یابد.

میزان تجزیه هر یک از سموم

با محاسبه سطح زیر منحنی و مقایسه با شاهد میزان تجزیه‌پذیری سم توسط باکتری‌های تجزیه‌کننده آن محاسبه شد که در جدول6 آمده است.

جدول6- میزان تجزیه سم فنیتروتیون توسط باکتری‏های غربال شده

میزان تجزیه (درصد)

نام باکتری

بازده استخراج حلال (درصد)

82

F1

70

20

F3

54

85

F4

78

بحث و نتیجه­گیری

تاکنون باکتری‌های تجزیه‌کننده سموم آلی کشاورزی توسط پژوهشگران در محیط‌های مختلف و اکوسیستم‌های خاکی متفاوت بررسی شده‌اند. باکتری‌ها از جنس‌های مختلف قادر به تجزیه سموم آلی کشاورزی هستند. گستردگی استفاده از آفت‌کش‌های ارگانوفسفره در سراسر جهان، افزایش آگاهی از ماندگاری و سمیت آن‏ها و اثرات جبران ناپذیرشان بر انسان و اکوسیستم‌های مختلف زمین، تجزیه میکروبی این حشره‌کش‌ها را بیشتر مورد توجه قرار داده است. در سال 1973 تجزیه زیستی آفت‌کش‌های ارگانوفسفره توسط گیاهان، خاک‌ها و حیوانات توسط بینون[xxii] و همکاران گزارش شد (12 و 13). در سال 1979 روزنبرگ[xxiii] و آلکساندر[xxiv] شکافت میکروبی[xxv] را عامل اصلی تجزیه حشره‌کش‌های ارگانوفسفره دانستند (5). در سال 2001 ببهید[xxvi] با بررسی گسترده تجزیه میکروبی در 10 نمونه خاک در هند توانست از خاک‌هایی که مدت زمان زیادی در معرض حشره‌کش‌های ارگانوفسفره بودند 22 سویه باکتری متعلق به جنس‌های Bacillus، Arthrobacter، Pseudomonas، PlanococcusوStomatocucusجداسازی کند (10). در سال 2002 دشپند[xxvii] از خاک‌های سیلابی، کود حیوانی گاو و لجن فعال صنعتی 26 سویه باکتری تجزیه‌کننده‌ی حشره‌کش ارگانوفسفره دایمتوات[xxviii] جدا کرد که با تعیین توالی 16S rRNAمتعلق به جنس‌های Bacillus،    Pseudomonas،    Klebsiellaو
Brevundimonasبودند (10). در سال 2003 کانکار[xxix] و همکاران با بررسی خاک‌های کشاورزی هند که مدت‌ زیادی از این سموم کشاورزی استفاده می‌کردند، برای سم‌های مختلفی از این گروه آفت‌کش باکتری‌های تجزیه‌کننده‌ای از جنس‌های مختلف Pseudomonas sp. و Flavobacterium sp. را شناسایی کردند؛ ژنتیک و مسیرهای آنزیمی نیز در آن‏ها بررسی شد (11 و 14). در این تحقیق، باکتری‌های تجزیه‌کننده سم آلی متداول کشاورزی فنیتروتیون از اکوسیستم‌های خاک کشاورزی (باغ‌های پسته) آلوده به سموم به عنوان منبع جداسازی به کاربرده شد. در واقع این خاک‌ها، مدت زمان طولانی در معرض این نوع آلاینده‌ها بوده‌اند. اکوسیستم انتخاب ‌شده در این پژوهش با اکوسیستم‌های انتخابی توسط بسیاری از پژوهشگران هم‌خوانی دارد، زیرا طبق اصل تطابق باکتری‌های تجزیه‌کننده یک آلاینده در مکان‏هایی یافت می‌شود که در تماس با آلاینده باشد. در این پژوهش از همین اصل برای دستیابی به باکتری‌ها استفاده شد. در این پژوهش، تعداد 5 باکتری تجزیه کننده سم، برای سم فنیتروتیون، جداسازی شد. پس از غربال‏گری 3 سویه برتر که می‌توانستند رشد بالاتری در این سموم از خود نشان دهند انتخاب شدند. سویه‏های باکتریایی تجزیه کننده سم آلی فنیتروتیون شناسایی شدند، این 3 سویه شامل: باکتری‌های Pseudomonas fluorescens strain F1، Bacillus cereus strain F3وPseudomonas aeruginosa strain F4 هستند. افزایش غلظت سم فنیتروتیون بر باکتری برتر شناسایی شده تا غلظت ppm 100 باعث افزایش رشد آن می‌شود. این نتیجه را می‌توان این‏گونه تفسیر کرد که این باکتری تا غلظت مشخص ppm 100 دارای تطابق نسبت به تجزیه است و از سم به عنوان منبع کربن و انرژی استفاده می‌کند و غلظت بالاتر از ppm 100 برای این باکتری سمی است.

تاکنون روش‌های مختلفی برای بررسی میزان تجزیه زیستی سموم کشاورزی بکار رفته است. از این روش‌ها می‌توان به زیست‌سنجی[xxx]، کروماتوگرافی لایه نازک[xxxi]، کروماتوگرفی گازی، کروماتوگرفی گاز و مایع طیف جرمی[xxxii] اشاره کرد (1 و 12).

کیکن[xxxiii] و همکاران در سال 2009 با استفاده از روش کروماتوگرافی گازی با دتکتور [xxxiv]TSD میزان تجزیه سم دیازینون توسط سویه‌ها Serratia Pseudomonas را بررسی و تایید کردند (11). در سال 2010 ابوعامر[xxxv] و همکاران با استفاده از روش کروماتوگرافی گازی میزان تجزیه دیازینون توسط Serratia marcescens را بررسی کردند (7 و 14). در این تحقیق از روش گاز کروماتوگرافی با دتکتور FID برای بررسی میزان تجزیه پذیری سموم بکار رفته استفاده شد. نتایج به دست آمده از GC نشان داد که برخی از سویه‌ها کاهش فوق‌العاده‌ای در پیک‌های به دست آمده دارند و برخی نیز میزان تجزیه‌پذیری آن‏ها متوسط و ضعیف است. نتایج به دست آمده از GC با نتایج به‏دست آمده از رشد باکتری‌ها در سموم همخوانی دارد.

 

References

 

(1) Singh B, Walker A, Microbial degradation of organophosphorus compounds. FEMS Microbiol Rev. 2006; 30( 3): 428–71.

(2) Australian Pesticides and Veterinary Medicines Authority (APVMA). The reconsideration of approvals of the active constituent fenitrothion, registrations of products containing fenitrothion and their associated labels 2004; 9-50.

(3) Environmental Protection Agency. US EPA, Office of Pesticide Programs, Registration Div. , Washington, DC. 1987; Pesticide Fact Sheet Number14.

(4) Mehrnejad M, The current status of pistachio pests in Iran. CIHEAM 2001; 56: 315- 22.



[1]- Biodegradation

[2]- 3-methyl-4-nitrophenole

[3]- fenitrooxon

[4]- Formic acid

[5]- Oxalic acid

[6]- Maleic acid

[7]- Methyl maleic acid

[8] -Bushnell- Hass

[9]- KH2Po4

[10]- K2HPo4

[11]- [NH4]2SO4

[12]- MgSO4

[13]- FeCl(III)

[14]- CaCl2

[15]- Colony Forming Unit

[16]- Spread culture

[17]- Streak culture

[18]- Blast

[19]- Gas Chromatography

[20]- Germany(Agillent6890)

[21]- - 30 متر×32/0 میلی‏متر×25/0 میکرومتر

[xxii]- Beynon

[xxiii]- Rosenberg

[xxiv]- Alexander

[xxv]- Microbial cleavage

[xxvi]- Bhadbade

[xxvii]- Deshpande

[xxviii]- Dimethoate

[xxix]- Kanekar

[xxx]- Bioassay

[xxxi]- Thin-Layer chromatography

[xxxii]- GC-Mass

[xxxiii]- Cycoń

[xxxiv]- Thermionic Specified Detector

[xxxv]- Abo Amer

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

References

(1) Singh B, Walker A, Microbial degradation of organophosphorus compounds. FEMS MicrobiolRev. 2006; 30( 3): 428–71.

(2) Australian Pesticides and Veterinary Medicines Authority (APVMA). The reconsideration of approvals of the active constituent fenitrothion, registrations of products containing fenitrothion and their associated labels 2004; 9-50.

(3) Environmental Protection Agency. US EPA, Office of Pesticide Programs, Registration Div. , Washington, DC. 1987; Pesticide Fact Sheet Number14.

(4) Mehrnejad M, The current status of pistachio pests in Iran. CIHEAM 2001; 56: 315- 22.

(5) Rosenberg A, Alexander, M. Microbial cleavage of various Organophosphorus insecticides. Apple Environ. Microbiol 1979; 37(5): 886-91.

(6) Robert TR, Hutson D. Metabolic Pathways of Agrochemicals. Cambridge, UK: Royal Society of Chemistry; 1999.

(7) Abo A, Aly E. Biodegradation of Diazinon by Serratia marcescens DI101 & its use in bioremediation of contaminated Environment . J. Microbial Biotecnol 2011; 21(1): 71-80.

(8) Willams S. T, Sharpe M. E, Holt J. G. Bergey's manual of Systematic Bacteriology. Vol. 1-6 .New York: Springer-Verlag; 1989.

(9) Hassanshahian M, Emtiazi G, Cappello S, Isolation and characterization of crude-oil-degrading bacteria from the Persian Gulf and the Caspian Sea. Mar. Pollut. Bull. 2012; 64(1); 7-12.

(10)  Smartbook J, Rusell D. Molecular cloning III: A laboratory manual cold spring harbor laboratory. 53rd. New York: Springer; 2011.

(11)   CycońM,Wójcik M, Piotrowska-Seget Z. Biodegradation of the organophosphorus insecticide diazinon by Serratia sp. and Pseudomonas sp. and their use in bioremediation of contaminated soil. Chemosphere. 2009; 76(4): 494-501.

(12)  Yakimov M. M, Cappello S, Crisafi E, Tursi A. Phylogenetic survey of metabolically active microbial communities associated with the deep-sea coral Lophelia pertusa from the Apulian Plateau, Central Mediterranean Sea. Deep Sea Res. Part I. 2006; 53, 62-75.

(13)    Beynon K, Hutson D, Wright. A. The metabolism & degradation of Vinyl phosphate insecticides; Res. Rev. 1973; (47): 55-142.

(14)   . Kanekar. P, Bhadbhade. B, Deshpande N, Sanaik S. , Biodegreadtion of Organophosphorus Pseticides, Proc. Indian natn Sci Acad. 2004; 70(1): 57-70.