اثر ترمیمی عصاره متانولی پروتوپارملیوپسیس مورالیس بر زخم آلوده با استافیلوکوکوس اورئوس در ‏موش‌‏ ویستار

نویسندگان

1 استادیار زیست شناسی- گلسنگ‏شناسی، دانشگاه ایلام، ایران

2 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه ایلام، ایران،

چکیده

  مقدمه : گلسنگ‏‌ها اجتماعات همزیستی از قارچ همراه با جلبک سبز ‏‌ یا سیانوباکتر ی هستند. متابولیت‏‌های ثانویه آن‏ها توسط مایکوبیونت تولید و به شکل کریستال‏‌های کوچک خارج سلولی روی سطح خارجی هایفه انباشته می‏‌شود. این متابولیت‏‌ها خواص زیستی منحصر به فردی مانند خواص ضد باکتری، ضد ‏ قارچ، ضد ویروس، ضد پروتوزوا،
ضد تکثیر، ضد تومور، آنتی اکسیدان و ضد تب دارند ‏‏.

  مواد و روش‏‏ها: پروتوپارملیوپسیس مورالیس از کوه‏های کان گنبد استان ایلام جمع‏آوری و با آزمون‏های شیمیایی و بررسی ویژگی‏های آناتومیکی شناسایی شد. سپس، کروماتوگرافی لایه نازک و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا انجام شد. جراحت (طول 5 سانتی‏متر و عمق 2 میلی‏متر) روی پوست ایجاد شد. سپس زخم‏ها با یک سوآپ استریل به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس آلوده شدند. ‏موش‌‏ها به طور تصادفی در سه گروه: 1- گروه کنترل، 2- گروه تحت درمان با پماد 5 درصد عصاره متانولی پروتوپارملیوپسیس مورالیس و 3- گروه تحت درمان با پماد10 درصد عصاره قرار گرفتند. در نهایت میزان بهبود زخم در روزهای سوم، پنجم، هفتم، نهم و یازدهم اندازه‏‌گیری شد.

  نتایج: با استفاده از کروماتوگرافی لایه نازک و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا وجود ترکیبات آترانورین، پزورمیک اسید، اسنیک اسید، زئورین و فومارپروتوستراریک‏اسید اثبات شد. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که عصاره متانولی پروتوپارملیوپسیس مورالیس مساحت زخم را در گروه درمان نسبت به گروه کنترل به طور در خور توجهی کاهش داد.

  بحث و نتیجه‏گیری: ترکیب اصلی در ریسه اسنیک‏‌اسید است، به نظر می‏‌رسد که این ماده مسئول اثرات
ضد میکروبی و ترمیم زخمی ویژه این گونه باشد. عصاره متانولی پروتوپارملیوپسیس مورالیس روند ترمیم زخم آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس را تسریع کرده و مدت زمان لازم برای بهبودی کامل زخم را کاهش می‏‌دهد .

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Wound Healing Activity of Methanolic Extract of Protoparmeliopsis muralis on Wounds Infected with Staphylococcus aureus in Wistar Rat

نویسندگان [English]

  • tahere valadbeigi 1
  • somaye Rashki 2
1 Associate Professor of Biology- Lichenology, Ilam University, Iran
2 M.Sc. Student of Microbiology, Ilam University, Iran
چکیده [English]

  Introduction: Lichens are symbiotic associations of a fungus with green alga or cyanobacteria. Their secondary metabolites are produced by the mycobiont, and accumulate as extracellular tiny crystals on the outer surfaces of the hyphae. Th metabolites have unique biological activities such as antimicrobial, antifungal, antiviral, antiprotozoal, anti-proliferative, anti-tumor, antioxidant, and anti-inflammatory.

  Materials and methods: Protoparmeliopsis muralis was collected from KaneGonbad mountains in Ilam province and identified by using chemical tests and survey of the anatomical characters. Then TLC and HPLC were carried. The excision wound (5cm long and 2mm deep) was created on skin. Then wounds were infected with Staphylococcus aureus by sterile swab . Rats were randomly placed into three groups: 1- control group, 2- treated group with 5 percent ointment of methanolic extract of P. muralis , and 3- treated group with 10 percent ointment of the extract . Finally an amount of wound healing were measured on days 1, 3, 5, 7, 9 and 11 .

  Results: By using Thin layers Chromatography and High Performance Liquid Chromatography, the existence of psoromic acid, usnic acid, zeorin and fumarprotocetraric acids were confirmed. The result of the present study demonstrated that methanolic extract P. muralis considerably decreased the area of wound in the treatment group to the control group.

  Discussion and conclusion: Usnic acid is the major compound in the thallus, it seems that this substance is responsible for special anti-microbial effects and wound healing of this species. Methanolic extract of P. muralis accelerates S. aureus infected wound healing process and decreases the necessary duration of complete wound healing .

کلیدواژه‌ها [English]

  • Protoparmeliopsis muralis
  • Wound healing
  • Staphylococcus aureus
  • Rat

مقدمه

ترمیم زخم روندی است که بلافاصله پس از آسیب پوست و بافت‏‌های نرم انجام می‏شود. پس از بروز آسیب پاسخ التهابی به وجود آمده و سلول‏‌ها در زیر پوست شروع به افزایش تولید کلاژن می‏کنند. سپس، به تدریج بافت اپی‏‌تلیال ترمیم می‏شود(1). در طول ترمیم بافت تخریب شده، رگ‏‌های خونی به آزاد شدن پلاک‏‌های خون پرداخته و سلول‏‌های خونی به داخل محل جراحت آزاد می‏‌شوند. نخستین علامت ترمیم زخم آزاد شدن مولکول‏هایی مانند ATP و آشکار شدن کلاژن در دیواره مویرگ‏‌های خونی است(2). لخته پس از تشکیل، مانند سدی فوری جلوی خونریزی بیشتر را می‏گیرد و از گسترش عوامل بیماری‏زا به داخل سرم جلوگیری می‏کند(3).

یکی از اهداف اصلی درمان در علم پزشکی، ترمیم زخم در زمان کوتاه تر و با عوارض جانبی کمتر است. زخم به عنوان اصلی‏ترین و مهم ترین مسأله در جراحی از دیرباز مورد توجه خاص پزشکان و فیزیولوژیست‏ها بوده است(4). امروزه عفونت به عنوان یکی از علل در خور توجه در مرگ و میر به ویژه پس از جراحی مطرح است(5). از زمان‏های بسیار قدیم استافیلوکوکوس اورئوس[1] و در سال‏های اخیر استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به وانکومایسین نقش مهمی در عفونت‏های بعد از عمل جراحی داشته اند. در این راستا، از داروها و پماد‏های متعددی برای درمان استفاده می‏شود که هر کدام دارای محدودیت‏هایی هستند. برای مثال:‏ مصرف موضعی آنتی‏سپتیک‏ها می‏تواند منجر به تأخیر روند اپی‏تلیالی شدن در موضع زخم شود. طبق بررسی‏های انجام شده مصرف آنتی‏بیوتیک‏های موضعی نیز که به منظور کاهش عفونت زخم استفاده می‏شود، می‏تواند باعث درماتیت تماسی شود(6). بنابراین، باید از روش‏های درمانی استفاده شود که عوارض جانبی کمتر و اثر ترمیمی بیشتری داشته و در عین حال کم‏‌هزینه باشند. یکی از بهترین روش‏هایی که می‏تواند ما را در رسیدن به هدف فوق یاری کند استفاده از مواد زیستی خالص شده است(7). همچنین، در سال‏‌های اخیر استفاده از گلسنگ‏ها در آمریکا و اروپا برای درمان عفونت‏‌های تنفسی، ادراری و ذات الریه مورد توجه قرار گرفته است(8). برای مثال‏، کوزانیک و همکاران[2] فعالیت ضد باکتریایی و ضد‏قارچی عصاره‏های استونی، متانولی و اتری
 Lecanora frustulosa و Parmelopsis hyperopta
بر علیه میکروارگانسیم‏های باسیلوس مایکوئیدز[3]، باسیلوس سوبتلیس[4]، استافیلوکوکوس اورئوس، انتروباکتر کلواکه[5]، اشریشیا کلی، کلبسیلا پنومونیه[6]، آسپرژیلوس فلاووس[7]، آسپرژیلوس فومیگاتوس[8]، کاندیدا آلبیکنز[9]، فوزاریوم اگزوفوریوم[10]، پنیسلیوم وروکوزوم [11]و تریکودرما هارسیانوم[12] را بررسی کردند. دراین بررسی، فعالیت ضد‏‌باکتریایی(با استفاده از روش انتشار دیسک) عصاره اتانولی بر علیه کلبسیلا پنومونیه (11/33±0/56 میلی‏متر) و سالمونلا تیفی(13/33±0/88 میلی‏متر) نسبت به عصاره نفت خام- اتری بیشتر است. همچنین، عصاره نفت خام- اتری نسبت به عصاره اتانولی، فعالیت ضد‏‌باکتریایی موثرتری بر علیه سالمونلا پارا تیفی (13/83±0/75 میلی‏متر) و اشریشیا‏کلی (18/67±1/15 میلی‏متر) دارد (8).

نتایج پژوهش‏ها در مورد کاربرد تجاری و سنتی گلسنگ‏‌ها در هند نیز نشان می‏‌دهد که 38 گونه مختلف به شکل تجاری به فروش می‏‌رسند. در اروپا
 Cetraria islandicaدر درمان بیماری‏‌های مختلف دستگاه تنفسی و زکام کاربرد دارد(9).
همچنین، Ramalina pacificaعملکرد آنتی‏‌بیوتیکی مؤثری بر علیه باکتری‏‌های گرم مثبت و گرم منفی(استافیلوکوکوس اورئوس، پسودوموناس آئروژینوزا[13]، کلبسیلا پنومونیه، سالمونلا تیفی[14] و اشرشیا کلی[15]) دارد. با این حال، در زمینه کاربرد دارویی گلسنگ‏‌ها در ایران و همچنین، خواص ترمیم زخم گونه مورد نظر در دنیا مطالعه موثری انجام نشده است.

به طور کلی خواص ضد‏قارچی و ضدباکتری گونه‏های گلسنگ را می‏توان به ترکیبات الکتوسارمتین[16](علیه استافیلوکوکوس اورئوس
1- کلروپانارین[17] و پانارین(علیه لیشمانیا[18])، امودین[19] (علیه باسیلوس برویس[20])، اورنیک‏‌اسید[21](علیه استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سوبتلیس و باسیلوس مگاتریوم[22])، مشتقات لپراپینیک‏‌اسید[23] شامل: لپراپینیک‏‌اسید گلیسینامید(علیه میکروسپوریوم کانیس[24]و ورتیسلیوم آچلی[25]β- متیل ارسلینات[26](علیه باسیلوس سوبتلیس، استافیلوکوکوس اورئوس، پسودوموناس آئروجینوزا، اشرشیا کلی و کاندیدا آلبیکنز)، (+)- پروتولیکسترینیک اسید[27](علیه هلیکوباکتر پیلوری[28]) و مشتقات اسنیک اسید(علیه استافیلوکوکوس اورئوس و باسیلوس سوبتلیس) نسبت داد(10- 13).

 

مواد و روش‏ها

جمع‏آوری و شناسایی گونه گلسنگ

گونه گلسنگ پروتوپارملیوپسیس مورالیس[29] در تاریخ 18/6/1382 از کوه‏‌های منطقه کان‏‌گنبد استان ایلام توسط مولف اول جمع‏‌آوری شد(هرباریوم دانشگاه شهید بهشتی، شماره 11). نمونه‏ها با استفاده از کلید شناسایی استاندارد، آزمون‏های شیمیایی و همچنین، با مقایسه با نمونه‏های معتبر در هرباریوم برلین شناسایی شدند(14 و 15).

آزمون‏های شیمیایی

ابتدا برش‏های بسیار نازکی با میکروتوم از مدولا و کورتکس تهیه شد و با ریختن مقدار بسیار کمی از معرف‏‌های C (محلول آبی هیپوکلریت کلسیم)،
K (محلول آبی 10 درصد هیدروکسید پتاسیم)،
KC (معرف‏‌های K و سپس (C و Pd (محلول اتانولیک 5 درصد –P فنیل‏‌ان‏‌دی‏‌آمین) اثر آن‏ها در تغییر رنگ زیر میکروسکوپ نوری یادداشت شد(کورتکس و مدولا به طور جداگانه‏ای آزمون شدند). در ادامه کار برای مشاهده تغییرات رنگ ریسه گلسنگ نسبت به معرف‏‌های ذکرشده از کاغذ صافی استفاده شد. به این ترتیب که ابتدا گلسنگ مورد نظر با استفاده از استون 5 درصد عصاره‏‌گیری شد. سپس،10 تا20 قطره از عصاره مورد نظر روی کاغذ صافی اضافه شد. به ازای هر قطره عصاره اضافه شده اطراف گلسنگ حلقه‏‌هایی از ترکیبات شیمیایی تشکیل، معرف‏ها به اطراف این حلقه‏ها اضافه و تغییرات رنگی ایجاد شده یادداشت شد(14 و 15).

عصاره‏گیری

گونه پروتوپارملیوپسیس مورالیس چند بار با آب مقطر شستشو و در سایه خشک شد. نمونه در هاون چینی خرد و از پودر به دست آمده برای تهیه عصاره استفاده شد. عصاره‏‌گیری با استفاده از سوکسله[30] انجام شد. برای تهیه عصاره متانولی برای هر 50 گرم به مقدار یک لیتر متانول استفاده شد(1 و 2). عصاره‏گیری تا زمانی که درون ستون آن بی‏رنگ شد (یعنی فقط حلال باقی بماند) ادامه یافت. سپس، محلول به دست آمده در دمای 35 تا 40 درجه سانتی‏گراد در آون خشک شد(16).

 

کروماتوگرافی لایه نازک(TLC)[31]

کروماتوگرافی لایه نازک طبق روش ارنج[32]و همکاران (2001) انجام شد(17). به این ترتیب که از سه سیستم حلال کروماتوگرافی شامل: حلال A، مخلوط پاستوسکا (بنزن: دی‏‌اگزان: استیک اسید، 4: 25: 90)؛ حلال B، هگزان: اتیل اتر: فرمیک‏اسید (5:4:1) و حلال C، تولوئن، استیک‏اسید (85:15) و پلیت‏‌های شیشه‏‌ای (20×20 سانتی‏متر) با جاذب سیلیکاژل 245F 60 (مرک) استفاده شد. آترانورین و نورستیک‏‌‏اسید به‏عنوان کنترل بکار رفتند. برای مشاهده باندها از سولفوریک‏اسید 10 درصد و گرما دادن برای چند دقیقه در 110 درجه سانتی‏گراد و همچنین، نور UVλ (254 نانومتر) استفاده شد. ترکیبات با استفاده از روش استاندارد‏سازی مواد گلسنگتعیین شدند(18 و 19).

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا(HPLC)[33]

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا طبق روش کنسرن[34] و همکاران (2007) انجام شد. در این روش از دستگاه HPLC[35] مجهز به ستون
(Phenomenex Hypersil C18 5µm) استفاده شد. از دو سیستم حلال A(ارتوفسفریک‏اسید آبی 1 درصد و متانول با نسبت 7:3) و B (متانول) و همچنین، بنزوئیک‏اسید و سولورینیک‏اسید به عنوان استانداردهای داخلی با اضافه کردن مایع عصاره (استون) استفاده شد. ترکیبات در نانومتر λ=245 و طیف‏های
UV=λ (200 تا 400 نانومتر) هر پیک شناسایی شدند(20).

تهیه پماد

برای تهیه پماد 5 درصد از عصاره متانولی پروتوپارملیوپسیس، 5/0گرم عصاره خشک با چهار گرم پایه پماد و برای تهیه پماد 10 درصد، یک گرم عصاره خشک با نه گرم پایه پماد مخلوط شدند(20 و 21).

 

حیوانات

در این مطالعه، از 15 سر ‏موش‌ نژاد ویستار(همسن) استفاده شد. موش‏‌ها در دمای 20 تا 24 درجه و سیکل روشنایی و تاریکی 12:12 ساعت در حیوان خانه دانشکده پیرادامپزشکی دانشگاه ایلام نگهداری شدند(4 و 5).

باکتری

باکتری استافیلوکوکوس اورئوس ATCC1885 از بانک میکروبی دانشکده پیرادامپزشکی دانشگاه ایلام تهیه شد. پس از ذوب شدن باکتری در دمای محیط، غلظت نیم‏‌مک‏‌فارلند cfu/ml)108 ×5/1) از آن تهیه شد. از محیط کشت مانیتول سالت آگار برای کشت استفاده شد. کشت‏‌ها در دمای 37 درجه سانتی‏‌گراد به مدت 24 ساعت در انکوباتور قرارگرفتند. در نهایت، با استفاده از سوزن کشت استریل مقداری از کلونی‏ باکتری برداشت و در سرم فیزیولوژی حل شد(21).

نحوه ایجاد زخم و عفونی کردن زخم‏‌ها

‏موش‌‏‌ها با استفاده از داروی بی‏‌هوشی دی‏‌کلرواتان بی‏هوش شدند. سپس، موهای ناحیه پشتی ‏موش‌ با استفاده از تیغ جراحی تراشیده شد. پس از آن با استفاده از تیغ جراحی زخمی به طول 5 سانتی‏‌متر ایجاد شد(شایان ذکر است عمق زخم در همه گروه‏‌ها یکسان و 2 میلی‏‌متر بود). روز جراحی روز صفر در نظر گرفته شد(شکل 1). پس از ایجاد زخم، سوآپ استریل به باکتری حل شده در سرم فیزیولوژی آغشته شد. سپس سطح زخم با سوآپ به استافیلوکوکوس اورئوس آلوده شد. برای اطمینان از آلوده شدن زخم به باکتری، کشت میکروبی با استفاده از سوآپ استریل مرطوب تهیه شد. به این شکل که سوآپ بر سطح زخم کشیده شد و بر روی محیط کشت مانیتول سالت آگار به شکل خطی کشت و در دمای 37 درجه سانتی‏‌گراد به مدت 24 ساعت در انکوباتور قرار گرفت(21).

 

شکل 1- روز صفر جراحی

 

‏موش‌‏‌ها پس از ایجاد زخم به طور تصادفی به 3 گروه زیر تقسیم شدند(4)

1- گروه کنترل(A).

2- گروه تحت درمان با پماد 5 درصد تهیه شده از عصاره پروتوپارملیوپسیس مورالیس(B).

3- گروه تحت درمان با پماد 10 درصد تهیه شده از عصاره پروتوپارملیوپسیس مورالیس(C).

روزانه از سطح زخم‏‌ها، کشت میکروبی تهیه شد. برای شمارش کلونی‏‌ها از دستگاه کلونی کانت استفاده شد. قبل از تجویز هر دارو با دوربین دیجیتال از زخم‏‌ها عکس تهیه شد(4). برای محاسبه مساحت زخم برای بررسی ریخت‏سنجی از نرم‏‌افزار تحلیل‏ تصاویر فرآیند التیام زخم 20001. 2 Motic Images استفاده شد.

 

نتایج

با استفاده از کروماتوگرافی TLC و HPLC وجود ترکیبات آترانورین، پزورمیک، اسنیک اسید، زئورین و فومارپروتوستراریک‏اسید در ریسه اثبات شد. نتایج تحلیل‏ تصاویر نشان داد مساحت سطح زخم در گروه کنترل در روزهای سوم و پنجم روند افزایشی داشت. همچنین، روند بهبود در گروه ذکر شده در روزهای بعد به کندی انجام شد به طوری که در روز یازدهم زخم به طور کامل ترمیم نشد(جدول 1)(شکل 2). این مشاهدات با نتایج شمارش کلونی‏‌ها مطابقت داشت؛ به‏طوری‏که در گروه کنترل رشد باکتری در سطح زخم تا روز یازدهم متوقف نشده بود(جدول 2). مساحت سطح زخم در گروه تحت درمان با پماد 5 درصد در روزهای سوم و پنجم افزایش داشت. در روز‏‌های بعدی از وسعت سطح زخم کاسته شد و روند بهبود نسبت به گروه کنترل با سرعت بیشتری انجام شد؛ به طوری که در روز نهم، زخم ترمیم و در روز یازدهم به طور کامل ناپدید شد. نتایج شمارش کلونی‏‏ها در این گروه نشان داد که عصاره متانولی این گونه فعالیت ضد باکتریایی در خور توجهی داشته است؛ به طوری که در روز دهم اثری از باکتری در سطح زخم مشاهده نشد. مساحت سطح زخم در گروه تحت درمان با پماد 10 درصد نسبت به گروه کنترل اختلاف معنی‏‌داری داشت. البته نسبت به گروه تحت درمان با پماد 5 درصد اختلاف معنی‏‌داری مشاهده نشد و در هر دو گروه، زخم در روز یازدهم به طور کامل ناپدید شد (جدول1)(شکل2). نتایج شمارش کلونی کشت‏‌های میکروبی تهیه شده از سطح زخم نشان داد که افزایش غلظت عصاره سبب افزایش فعالیت ضد باکتریایی شد؛ به طوری‏که در گروه تحت درمان با پماد 10 درصد در روز هشتم هیچ اثری از باکتری‏‌ها در سطح زخم یافت نشد(جدول 2).

 

 

جدول 1- میانگین مساحت زخم در گروه کنترل، گروه تحت درمان با پماد 5 درصد (C) و گروه تحت درمان با پماد 10 درصد (D) در روزهای سوم، پنجم، هفتم، نهم و یازدهم

روز

گروه

سوم

پنجم

هفتم

نهم

یازدهم

A

03/0±*24/1

03/0±61/1

03/0±94/0

01/0±62/0

04/0±50/0

B

02/0±62/1

03/0±30/2

03/0±33/1

02/0±07/0

0

C

02/0±31/2

02/0±75/0

03/0±71/1

01/0±04/0

0

*مساحت زخم برحسب میلی‏‌متر‏‌مربع

 

جدول 2- نتایج شمارش کلونی‏‏‌ها در گروه‏‌های کنترل(A)، تحت درمان با پماد 5 درصد (B) و تحت درمان با پماد 10 درصد (C) در روز‏های دوم تا یازدهم پس از ایجاد زخم

روز‏های مورد مطالعه

گروه

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

A

غ

غ

غ

غ

275

210

165

125

105

B

غ

غ

275

210

142

76

38

15

0

0

C

غ

غ

200

110

50

10

0

0

0

0

* غیر قابل شمارش

 

 

شکل 2- وضعیت التیام زخم آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس در روزهای پنجم تا یازدهم (به ترتیب از چپ به راست) در گروه‏های کنترل(A)، تحت درمان با پماد 5 درصد عصاره پروتوپارملیوپسیس مورلیس (B) و تحت درمان با پماد 10 درصد عصاره پروتوپارملیوپسیس مورالیس

روز سوم

 

روز پنجم

 

روز هفتم

 

روز نهم

 

روز یازدهم

 

روز سوم

 

 

روز پنجم

 

 

روز هفتم

 

 

روز نهم

 

 

روز یازدهم

 

 

روز سوم

 

 

روز پنجم

 

 

روز هفتم

 

 

روز نهم

 

 

روز یازدهم

 

 

A

 

 

 

C

(C)


بحث و نتیجه‏‌گیری

از دیر باز مشخص شده است که متابولیت‏‌های ثانویه گلسنگ‏‌ها دارای فعالیت‏‌های زیستی و دارویی متعدد (شامل: اثرات ضد ‏‌مایکوباکتریایی، ضد ‏‌ویروسی، ضد ‏‌التهاب، مسکن، ضد ‏‌تب، ضد‏‌ تومور، سیتوتوکسیک[xxxvi]، آنتی‏‌بیوتیکی و ضد‏‌ قارچی) هستند(22). اسنیک‏اسید یکی از ترکیبات دارویی مهم است که تا کنون در جنس‏‌های آلکتوریا، کاندیدا، اوسنا، رامالینا و اورنیا گزارش شده است. تحقیق حاضر، نیز وجود اسنیک‏اسید در جنس پروتوپارملیوپسیس را اثبات می‏‌کند. این اسید خاصیت ضد میکروبی علیه باکتری‏‌های گرم مثبت از جمله استافیلوکوکوس اورئوس دارد. همچنین،
(+)- اسنیک‏اسید متصل شده به پلیمرازها سبب از بین رفتن استافیلوکوکوس اورئوس و تغییر شکل بیوفیلم[xxxvii] باکتری پسودوموناس آئروجینوزا می‏‌شود(23).
متیل- β- ارسینل کربوکسیلات‏‌های عصاره گلسنگ‏‌ها نیز از دیگر ترکیبات مهم علیه گونه استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‏‌سیلین(دی‏‌متوکسیفتیل پنی‏‌سیلین که نوعی پنی‏‌سیلین نیمه سنتتیک است و در برابر اثرات خنثی کننده پنی‏‌سیلیناز بسیار مقاوم می‏باشد) می‏‌باشند. به‏طور‏‌کلی، وجود مشتقات فنلی تک حلقه(برای مثال‏ اسنیک اسید) در گلسنگ‏‌ها نشان دهنده فعالیت ضد‏‌میکروبی آن‏هاست. این مواد باعث اسیدی شدن سلول باکتری، به ترتیب تخریب غشاء سیتوپلاسم، غیر فعال شدن آنزیم‏‌ها و اختلال انتقال الکترون و فسفریلاسیون اکسیداتیو می‏‌شوند (24 و 25).

به دو دلیل زیر کنترل باکتری‏‌ها در فرآیند ترمیم زخم از اهمیت بالایی برخوردار است:

1- عفونت زخم زمانی روی می‏‌دهد که شمار باکتری‏‌ها در زخم از 105 در هر گرم بافت فراتر رود. پاسخ میزبان به تهاجم باکتری‏‌ها با آزاد‏سازی سلول‏‌های التهابی مثل نوتروفیل‏‌ها، آنزیم‏‌های سیتوتوکسیک، رادیکال‏‌های آزاد اکسیژن و واسطه‏‌های التهابی همراه است. این خود باعث آسیب بیشتر به بافت میزبان می‏‌شود. به این ترتیب عفونت با مکانیسم‏‌های مختلف، توانایی زخم برای التیام(خودبه‏خودی) را مختل می‏‌سازد. تمامی مراحل آبشار التیام زخم تحت تاثیر عفونت قرار می‏‌گیرند. عفونت سبب کاهش 2Po (مقدار گاز اکسیژن در خون) زخم و طولانی شدن مرحله التهابی می‏‌شود. عفونت شدید (بیش از 105 باکتری) موجب اختلال در کموتاکسی، مهاجرت و فاگوسیتوز گویچه‏‌های قرمز می‏‌شود. همچنین، باکتری‏‌ها سبب می‏‌شوند تا فرآیند رگ‏‌زایی و فرآیند اپی‏‌تلیازه شدن مختل شود. در نهایت کلاژناز مشتق از باکتری‏‌ها، کلاژن‏‌های موجود در زخم را می‏شکند و مقاومت و توان انقباضی زخم را کاهش می‏‌دهد(26).

2- استافیلوکوکوس اورئوس یک باکتری پاتوژن گرم مثبت است که در عملکرد سلول‏‌های میزبان اختلال ایجاد می‏‌کند(18). این باکتری پروتئین‏‌هایی را با خاصیت چسبندگی بیان و ترشح می‏‌کند. از این پروتئین‏‌ها می‏‌توان به پروتئین چسبنده خارج سلولی[xxxviii] اشاره کرد. اتصال Eap به مولکول چسبنده خارج سلولی میزبان، از اتصال لکوسیت‏‌ها به سلول‏های اندوتلیال جلوگیری می‏‌کند و در نتیجه تجزیه لکوسیت‏‌های وابسته به اینتگرین رخ می‏‌دهد. همچنین Eap از عملکرد سلول‏های ایمنی بدن جلوگیری کرده و با داشتن خاصیت ضد‏‌التهابی و آنژیوژنز‏‌ی مسئول طولانی‏‌تر شدن فرایند ترمیم زخم آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس است(27).

بنابراین، عصاره پروتوپارملیوپسیس مورالیس مورد مطالعه با هر دو خصوصیت ترمیمی و آنتی بیوتیکی می‏تواند گزینه بسیار مناسبی در خصوص التیام زخم باشد.

در زمینه خواص ترمیم زخم گونه‏‌های گلسنگ بومی ایران تا کنون مطالعه‏‌ای انجام نشده است. به‏علاوه مطالعات دیگر توسط پژوهشگران خارجی نیز بسیار محدود است. به طوری‏که دراین راستا فقط می‏توان به یک مورد، مطالعه رادیکا[xxxix] در سال 2013، اشاره کرد. او با بررسی فعالیت ضد‏‌باکتری و ترمیم زخم گونه Xanthoparmelia caperataنشان داد که عصاره استونی پس از گذشت 21 روز سبب ترمیم زخم آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس می‏‌شود(24). در حالی که نتایج حاصل از کلونی‏ کانت مطالعه حاضر نشان می‏‌دهد که عصاره پروتوپارملیوپسیس مورالیس فعالیت ضدباکتریایی در خور توجهی داشته و در مدت زمان کمتری(11 روز) سبب التیام زخم می‏‌شود. با توجه به عدم وجودتحلیل‏ شیمیایی در مطالعه رادیکا، امکان مقایسه ترکیبات ضد‏‌باکتری گونه X. caperata با تحقیق حاضر نیست.

به طور کلی، چون عفونت یکی از عوامل اصلی در به تأخیر افتادن مراحل التیام زخم است و همچنین، نتایج کروماتوگرافی این تحقیق که نشان می‏‌دهد که ترکیب اصلی در ریسه اسنیک‏‌اسید است، اثر عصاره پروتوپارملیوپسیس مورالیس در کاهش اندازه زخم و سرعت بخشیدن به مراحل التیام زخم را می‏‌توان به فعالیت ضد باکتریایی این ترکیب نسبت داد.

تشکر و قدردانی

از زحمات پروفسور هری سیپمن [xl] (مسئول هرباریوم گلسنگ برلین، آلمان) که زمینه یازده ماه مطالعه در هرباریوم گلسنگ برلین را برای مولف اول فراهم کرد تشکر و قدردانی می‏‌کنیم.

 



[1]- Staphylococcus aureus

[2]- Kosanić et al

[3]- Bacillus mycoides

[4]- Bacillus subtilis

[5]- Enterobacter cloacae

[6]- Klebsiella pneumoniae

[7]- Aspergillus flavus

[8]- Aspergillus fumigatus

[9]- Candida albicans

[10]- Fusarium oxysporum

[11]- Penicillium verrucosum

[12]- Trichoderma harzianum

[13]- Pseudomonas aeruginosa

[14]- Salmonella typhi

[15]- Escherichia coli

[16]- alectosarmetin

[17]- 1- chloro panarin

[18]- Leishmania sp.

[19]- emodin

[20]- Bacillus brevis

[21]- evernic acid

[22]- Bacillus megaterium

[23]- leprapinic acid

[24]- Microsporum canis

[25]- Verticillium achliae

[26]- β methyl- orselinat

[27]- protolichesterinic acid

[28]- Helicobacter pylori

[29]- Protoparmeliopsis muralis

[30]- Soxhle

[31]- Thin Layer Chromatography

[32]- Orange

[33]- High Performance Liquid Chromatography

[34]- Cansaran

[35]- Hewlett Packard HP  (مدل 1050)

[xxxvi] cytotoxic

[xxxvii]- biofilm

[xxxviii]- Eap

[xxxix]- Radika

[xl]- Harrie Sipman

References

(1)               Chah KF, Eze CA, Emuelosi CE, Esimone CO. Antibacterial and wound healing properties of methanolic extracts of some Nigerian medicinal plants. J. Etnnopharmacol 2006; 104(1): 164- 7.

(2)               Ruggeri ZM. Platelets in atherothrombosis. Nat. Med. J 2002; 8(11): 1227- 34.

(3)               John D, Stroneek Nicole Bell W, Monty R. Instructional powerpoint presentation for cutaneus wound healing and tissue response to sutures. J. Biomed. Mater. Res 2009; 4: 1230- 38.

(4)               Chitra V, Dharani PP, Pavan Kumar K, Narayana R A. Wound healing activity of alcoholic extract of Buchanania lanzan in albino rats. Int. J. Chem. Tech. Res 2009; 1(4): 1026- 31.

(5)               Sewall GK, Roberston KM, Conner NP, Heisey DM, Hartig GK. Effect of topical mitomicin on skin wound contraction. Arch. Facia. l Plast. Surg 2003; 5(1): 59- 62 .

(6)               Nowrouzian I, Azarabad H, Nasirian A, Ghamsari S. M. Wound healing in large Animals histopathology and surgical management. Tehran: Tehran University press; 2009; 74- 87.

(7)               Isler H, Bauen A, Hubler M, Oberholzer M. Morphometric assessment of wound healing in rat treated with a pritein-free hemodylisis. J. Burns 1991; 1(2): 7: 99- 103.

(8)               Kosanić M, Ranković B, Sukdolak S. Antimicrobial activity of the lichen Lecanora frustulosa and Parmeliopsis hyperopta and their divaricatic acid and zeorin constituents. Afr. J. Microbiol. Res 2010; 4(9): 885- 90.

(9)               Elix JA. Biochemistry and secondary metabolites. In:Nash TH, editor. Lichen Biology. Cambridge: Cambridge University Press; 1996. p154- 1809.

 

 

(10)           Gordien AY, Gray AI, Ingleby K, Franzblau SG, Seidel V. Activity of Scottish Plant, Lichen and Fungal Endophyte Extracts against Mycobacterium aurum and Mycobacterium tuberculosis. Phytother. Res2010; 24(5): 692-8.

(11)           Shahi SK, Shukla AC, Dikshit A, Uperti DK. Broad spectrum antifungal properties of the lichen Heterodermia leucomela. Lichenologist 2001; 33(2): 177-9.

(12)           Luo H; Yamamoto Y, Jeon H; Liu Y, Jung JS; Koh Y, et al. Production of Anti-Helicobacter pylori metabolite by the lichen-Forming fungus Nephromopsis pallescens. J. Microbiol 2011; 49(1): 66- 70.

(13)           Thadhani VM, Choudhary MI, Khan S, Karunaratne V. Antimicrobial and toxicological activities of some depsides and depsidones. J. Natn. Sci. Foundation. Sri. Lanka 2012; 40(1): 43- 8.

(14)           Purvis OW, Coppins BJ, Hawksworth DL, James PW, Moore DM. The Lichen Flora of Great Britain and Ireland. 3rd ed. London: Natural History Museum; 1992.

(15)           Valadbeigi T. Collection and Identification of lichens of Zirab area in Mazandaran province [Dissertation]. Tehran: Shahid Beheshti Univ. ; 2004.

(16)           Kosanic M, Rankovic B. Screening of antimicrobial activity of some lichen species in vitro. Kragujevac. J. Sci 2010; 32: 65- 72.

(17)           Orange A, James PW, White FJ. Microchemical methode for the identification of lichens. 2nded. London: British lichen society; 2001.

(18)            Culberson CF, Johnson A. Substitution of methyl, tert- butyl ether for diethyl ethyl ether in the standardized thin- layer chromatographic method for lichen products. J. Chromatogr 1982; 238(2): 483- 7.

(19)           Culberson CF. Improved conditions and new data for the identification of lichen products by a standardized thin- layer chromatographic method. J. Chromatogr 1972; 72(1): 113- 25.

(20)           Cansaran D, Atakol O, Halici MG, Aksoy A. HPLC analysis of usnic acid in some Ramalina species from Anatolia and investigation of their antimicrobial activities. Pharma. Biol 2007; 45(1): 77- 81.

(21)           Radika S. development of treated bandage using; lichen extract for wound healing. Int. J. Latest. Res. Sci. Technol 2013; 2(2): 163- 6.

(22)           Müller K. Pharmaceutically relevant metabolites from lichens. Applied. Microbiol. Biotech 2001; 56(1-2): 9- 16.

(23)           Francolini I, Norris P, Piozzi A, Donelli G, Stoodley P. Usnic acid, a natural antimicrobial agent able to inhibit bacterial biofilm formation on polymer surfaces. Antimicrob. Agents. Chemother 2004; 48(11): 4360- 5.

(24)           Randhir R, Lin YT and. Shetty K. Stimulation of phenolic, antioxidant and antimicrobial activities in dark germinated mung bean sprouts in response to peptide and phytochemical elicitors. Process. Biochem 2004; 39(5): 637- 46.

(25)           Vattem DA, Lin YT, Lable RG and. Shetty K. Phenolic antioxidant mobilization in cranberry pomace by solid-state bioprocessing using food fungus Lentinus edodes and effect on antimicrobial activity select food borne pathogens. Innovat. Food. Sci. Emerg. Tech 2004; 5(1): 81- 91.

(26)           Lee CK, Hansen SL. Management of acute wounds. Surg. Clin. North. Am 2009; 89(3): 659- 76.

(27)           Athanasopoulos AN, Economopoulou M, Orlova VV, Sobke A, Schneider D, Weber H, et al. The extracellular adherence protein(Eap) of Staphylococcus aureus inhibit wound healing by interfrring with host defence and repair mechanicms. Blood 2006; 107(7): 2720-7.