جداسازی باکتری حل‏کننده فسفات مولد آنزیم فسفاتاز از چشمه آب گرم لریا: بررسی پتانسیل حل‏کنندگی فسفات در حضور شاخص‏های مختلف

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، ‏دانشگاه شهید باهنر کرمان، ‏ایران

2 استادیار بیوشیمی، ‏‏دانشگاه شهید باهنر کرمان، ‏ایران

3 استادیار میکروبیولوژی دانشگاه شهید باهنر کرمان، ایران

چکیده

  مقدمه : کودهای زیستی میکروارگانیسم‏هایی هستند که قادرند عناصر غذایی را از شکل بلا استفاده به شکل قابل استفاده تبدیل کنند. ‏برخلاف کود‏های شیمیایی، ‏هزینه تولید کودهای زیستی‏ کم و در اکوسیستم آلودگی ب ه وجود نمی‏آورد . ‏ کودهای زیستی فسفاته می‏توانند به منظور افزایش محصول، ‏جایگزین بخشی از کودهای شیمیایی فسفاته شوند. ‏از این رو، ‏غربال‏گری به منظور یافتن باکتری‏های حل‏کننده فسفات سازگار با اقلیم هر منطقه یک ضرورت است .   مواد و روش ‏‏ ها: در این تحقیق، از چشمه آب گرم لریا، ‏واقع در شهرستان جیرفت، ‏نمونه‏برداری شد. ‏نمونه‏ها در PKV به مدت 3 شبانه روز کشت داده شدند. ‏غربال‏گری باکتری‏های حل‏کننده فسفات مولد فسفاتاز روی محیط جامد اختصاصی PKV بر اساس قطر هاله، ‏انجام شد. ‏بهترین گونه باکتریایی توسط روش مولکولی s rDNA 16 شناسایی شد‏. ‏میزان حل‏کنندگی فسفات این باکتری در حضور شاخص‏های مختلف منبع کربنی، ‏نیتروژن، ‏فسفات و اسیدیته‏ اولیه محیط بررسی شد .   نتایج: نتایج حاصل از تطبیق توالی و درخت فیلوژنتیکی نشان داد که گونه فوق 97 درصد به گونهBacillus licheniformis شباهت دارد. ‏علاوه بر این، ‏مطالعات نشان داد که حداکثر تولید آنزیم پس از 2 روز گرمخانه‏گذاری است و هم‏زمان با افزایش زمان گرمخانه‏گذاری اسیدیته‏ نیز کاهش می‏یابد. ‏بررسی منابع کربنی در میزان حل‏کنندگی فسفات نشان داد که گلوکز مناسب‏ترین منبع کربنی در تولید آنزیم و رها‏سازی فسفات است. ‏بررسی حل‏کنندگی فسفات در حضور اسیدیته‏‏های مختلف نشان داد که اسیدیته 5 ‏مناسب‏ترین است. ‏اثر منابع مختلف فسفات نشان داد که تری کلسیم فسفات اثر در خور توجهی در افزایش فعالیت آنزیمی در طی 3 روز گرمخانه‏گذاری دارد .   بحث و نتیجه ‏ گیری: ‏ قابلیت تولید آنزیم فسفاتاز و رشد در اسیدیته پایین و پتانسیل بالای حل‏کنندگی فسفات در حضور نمک‏های مختلف و منابع متفاوت فسفات، ‏اهمیت در خور توجه این باکتری را به‏عنوان کود زیستی نشان می‏دهد .  

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation of phosphatase-producing phosphate solubilizing bacteria from Loriya hot spring: Investigation of phosphate solubilizing in the presence of different parameters

نویسندگان [English]

  • Maryam parhamfar 1
  • Arastoo Badoei Dalfard 2
  • Mouj Khaleghi 3
  • Mehdi Hassanshahian 3
1 M.Sc. of Microbiology, Shahid Bahonar University of Kerman, Iran
2 Assistant Professor of Biochemistry, Shahid Bahonar University of Kerman, Iran
3 Assistant Professor of Microbiology, Shahid Bahonar University of Kerman, Iran
چکیده [English]

  Introduction: Biofertilizers are the microorganisms that can convert useless nutrient to usable compounds. Unlike fertilizer, cost of biofertilizer production is low and doesn’t produce ecosystem pollution. Phosphate fertilizers can be replaced by phosphate biofertilizer to produce improvement. So, it is necessary to screen the climate-compatible phosphate solubilizing bacteria .   Materials and methods: In this project samples were picked up from Loriya hot spring, which are located in Jiroft. Samples were incubated in PKV medium for 3 days. Screening of phosphate solubilizing bacteria was performed on the specific media, based on clear area diameter. The best bacterium was identified based on 16s rDNA gene. Phosphate solubilizing activity of this strain was considered in different carbon, nitrogen, phosphate and pH sources .   Results: Sequence alignment and phylogenetic tree results show that B. sp. LOR033 is closely related to Bacillus licheniformis , with 97% homology. In addition, results show that maximum enzyme production was performed after 2 days that incubation pH was decreased simultaneously when the time was increased. Carbon sources investigation show that glucose is the most appropriate in enzyme production and phosphate releasing. Furthermore, results show that the optimum initial pH for phytase production was pH5.0. Different phosphate sources show that tricalcium phosphate has the suitable effect on enzyme activity in three days of incubation . Discussion and conclusion : Phosphatase enzyme production capacity, growth in acidic pH and phosphate solubilizing potential in different salt and phosphate sources show that this strain has considerable importance as biofertilizers .

کلیدواژه‌ها [English]

  • Screening
  • Hot spring
  • Phosphate
  • Solubilizing Bacteria
  • Phosphatase

مقدمه

فسفر یک ماده غذایی مهم و محدود کننده رشد گیاهان بوده و بر خلاف نیتروژن، ‏منبع اتمسفری بزرگی ندارد ‏(‏1)‏. ‏توسعه ساقه، ‏استحکام ریشه و ساقه، ‏رسیدن محصولات، ‏تثبیت نیتروژن در لوگوم، ‏کیفیت محصولات و مقاومت به بیماری‏های گیاهی، ‏مرتبط با تغذیه فسفر هستند (‏2-4). ‏یکی از راه‏های برطرف ساختن نیاز فسفر گیاهان استفاده از کودهای شیمیایی است؛ ولی به‏علت محدود بودن این منابع، ‏افزایش قیمت تمام شده آن، مخاطرات زیست محیطی ناشی از کاربرد آن‏ها‏ و تثبیت شدن قسمت اعظم کود فسفاته مصرفی به شکل غیر قابل استفاده برای گیاه، ‏توجه به کودهای زیستی فسفاته ضرورت یافته است. ‏فسفر در نهشته‏های معدنی یافت می‏شود و به عنوان منابع طبیعی غیرقابل تجدید محسوب می‏شود‏. ‏این مسئله برای تعداد زیادی از کشورهایی که بدون سنگ فسفات هستند، ‏بسیار مهم و جدی است. ‏استخراج کانی‏های فسفردار و پخش کود فسفر دار در زمین‏ها به علت محدود بودن منابع فسفر، ‏پایدار نیست و آینده تولید این کود با مشکل روبروست. ‏علاوه بر این، ‏در عمل بازدهی کودهای شیمیایی فسفاته بین10 تا 25 درصد است. ‏یعنی حدود ‏75 درصد آن در خاک در اثر واکنش با کاتیون‏های فلزی به شکل رسوب و غیرقابل استفاده گیاه تبدیل می‏شود ‏(‏5).
‏از این رو ضرورت یافتن جایگزینی مناسب برای کود‏های شیمیایی فسفاته احساس می‏شود. ‏

میکروارگانیسم‏های خاک در برخی از فرآیندهای حل‏کنندگی فسفات دخالت دارند که تغییر شکل فسفر و در نهایت زیست فراهمی آن را برای گیاه تحت تاثیر قرار می‏دهند ‏(‏6). ‏‏باکتری‏ها در مقایسه با قارچ‏ها در انحلال فسفات بسیار موثرتر بوده و جمعیت بالایی را به خود اختصاص می‏دهند ‏(‏7). ‏میکروارگانیسم‏ها نقش مرکزی را در چرخه فسفر طبیعی دارا هستند. ‏این چرخه فسفات به وسیله اکسیداسیون و احیا ترکیبات فسفر انجام می‏شود و واکنش انتقال الکترون، ‏بین مرحله اکسیداسیون از فسفین[1] (‏3-) به فسفات ‏(‏5+)‏، ‏انجام می‏شود. ‏غلظت فسفر محلول در خاک معمولا بسیار پایین است و به طور معمول حدود ppm 1 یا کمتر است ‏(‏8). ‏سلول ممکن است به چند شکل فسفر را جذب کند اما مناسب‏ترین آن‏ها‏ در شکل H2PO4- و HPO42-جذب می‏شود. ‏نمونه‏های متنوعی از میکروارگانیسم‏ها قادر به رهاسازی فسفر از منابع رسوب یافته فسفر گزارش شده اند. ‏استفاده از آن‏ها‏ به عنوان کود زیستی یا عامل کنترل برای بهبود کشاورزی به طور گسترده طی سال­ها بررسی شده است ‏(‏9). ‏در میان آن‏ها‏ سویه­هایی از جنس سودوموناس، ‏آزوسپریلیوم، ‏بورخولدریا، ‏باسیلوس، ‏انتروباکتر، ‏ریزوبیوم، ‏اروینیا، ‏سراشیا، ‏فلاوباکتریوم، ‏آلکالیژنز، ‏آرتروباکتر و اسنیتوباکتر قرار گرفته­اند ‏(‏10 و 11). ‏برای این‏که این فسفر برای گیاهان قابل دسترس شود، ‏باید به فسفات معدنی هیدرولیز شود. ‏معدنی شدن بیشتر ترکیبات فسفر آلی به وسیله آنزیم‏های فسفاتاز انجام می‏شود. ‏

اگر چه چندین باکتری حل‏کننده فسفات در خاک وجود دارد ولی معمولا تعداد آن‏ها‏ به اندازه کافی زیاد نیست تا با باکتری­های متداول دیگر موجود در ریزوسفر رقابت کنند. ‏بنابراین، مقدار فسفر آزاد شده به وسیله آن‏ها‏ برای افزایش رشد اساسی گیاه کافی نیست. ‏از این رو تلقیح گیاه به وسیله این میکروارگانیسم‏ها در غلظت بالاتر از معمول در خاک ضروری است تا خاصیت حل‏کنندگی فسفات برای افزایش محصولات گیاهی انجام شود ‏(‏12). ‏کودهای زیستی فسفاته به دست آمده از ریزسازواره‏ها می‏توانند به منظور افزایش محصول، ‏جایگزین بخشی از کودهای شیمیایی شوند. ‏این کودها از نظر هزینه ارزان‏تر بوده و بسیار سازگار با محیط هستند ‏(‏13 و 14). ‏با توجه به سازگاری میکروارگانیسم‌ها با شرایط محیط و اقلیمی زیستگاه اصلی آن‏ها‏، ‏تولید کود زیستی از باکتری‌های غیربومی که از مناطقی با ویژگی‌های اقلیمی متفاوت نسبت به شرایط داخلی کشور به دست آمده‌اند کارایی مطلوبی نخواهد اشت. ‏به عنوان نمونه تلقیح باسیلوس مگاتریوم واریته فسفوریکم[2]، ‏به طور موفق در روسیه و هند استفاده شد اما تاثیر مشابهی در خاک‏های امریکا نشان نداد ‏(‏15). ‏بنابراین، استفاده از باکتری‌های بومی که با شرایط زیستی کشور سازگار هستند در تولید کودهای زیستی مناسب‌تر خواهد بود. ‏در این تحقیق، از چشمه آب گرم لریا در استان کرمان نمونه‏برداری شد. ‏این چشمه دارای دمای 68 درجه سانتی‏گراد و اسیدیته 5/5 ‏است. ‏باکتری‏های حل‏کننده فسفات در محیط اختصاصی غربال‏گری شدند. ‏سپس، پتانسیل حل‏کنندگی بهترین گونه باکتریایی حل‏کننده فسفات در حضور ترکیبات مختلف ارزیابی شد. ‏این باکتری با روش مولکولی S rRNA16 شناسایی شد. ‏

 

مواد و روش‏ها

نمونه‏برداری

از چشمه آب گرم لریا در شهرستان جیرفت استان کرمان نمونه‏برداری شد. ‏دمای این چشمه 68 درجه سانتی‏گراد و اسیدیته‏ آن 5/5 است. ‏این چشمه از دیر باز مورد استفاده مردم منطقه بوده است. آن‏ها معتقد هستند که دردهای مفاصل و غیره ‏را تسکین می‏دهد. ‏این چشمه جزو چشمه‏های آب گرم معدنی و اسیدی است که برای یافتن باکتری‏هایی زیستی سازگار با خاک‏های اسیدی مطالعه شده است. ‏

غربال‏گری باکتری حل‏کننده فسفات

نمونه‏های خاک و آب چشمه یاد شده ابتدا در محیط‏های مایع PKV کشت داده شدند. ‏ترکیبات این محیط شامل: گلوکز (10گرم در لیتر)، تری کلسیم فسفات (5 گرم در لیتر)، سولفات آمونیوم (5/0 گرم در لیتر)، کلرید سدیم (2/0 گرم در لیتر)، سولفات منیزیوم
(1/0 گرم در لیتر)، کلرید پتاسیم (2/0 گرم در لیتر)، عصاره مخمر (5/0 گرم در لیتر)، سولفات منگنز
(002/0 گرم در لیتر)، سولفات آهن (002/0 گرم در لیتر) با اسیدیته 7 بودند. ‏پس از 48 ساعت محیط‏های کشت با محیط تازه تعویض شد‏. ‏پس از رشد در این محیط‏های مایع، ‏از هر محیط مقدار 100 میکرولیتر برداشت‏ و در محیط جامد PKV کشت داده شد. ‏پس از 48 ساعت میزان تولید آنزیم و قدرت حل‏کنندگی فسفات با بررسی قطر هاله‏ها ‏و اندازه‏گیری فعالیت آنزیمی بررسی شد‏. ‏

سنجش فعالیت آنزیمی و اندازه‏گیری میزان فسفات آزاد شده

سنجش آنزیم به وسیله گرمخانه‏گذاری 25 میکرولیتر آنزیم در 37 درجه سانتی‏گراد، ‏برای مدت30 دقیقه با 950 میکرولیتر محلول 40 میلی‏مولار سوبسترا در بافر 100 میلی‏مولار استات سدیم اسیدیته ‏(5/5) انجام شد‏. ‏پس از گرمخانه‏گذاری، ‏واکنش با افزودن1میلی‏لیتر‏ محلول 5 درصد ‏TCA متوقف شده و فسفات معدنی آزاد می‏شود. ‏سپس‏ 2 میلی­لیتر معرف رنگی(5/1 درصد مولیبدات آمونیوم در ‏5/5 درصد سولفوریک اسید و 7/2 درصد از محلول سولفات آهن) ‏افزوده شد و مقدار فسفات رها شده در700 نانومتر بررسی شد‏. ‏در این مثال، ‏یک واحد فعالیت آنزیمی، ‏مقدار آنزیمی است که ‏(‏1 میکرومول) فسفات معدنی در هر دقیقه، ‏تحت شرایط سنجش آزاد کند ‏(‏16). ‏

شناسایی باکتری حل‏کننده فسفات با روش مولکولی
s rDNA16

ابتدا باکتری روی محیط نوترینت آگار کشت چمنی داده شد و به مدت 24 ساعت در دمای‏40 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شد. ‏باکتری‏های رشد یافته به کمک لوپ از سطح محیط کشت جمع آوری و سوسپانسیونی از آن در آب مقطر استریل تهیه شد. ‏با سانتریفیوژ سوسپانسیون حاصل در دمای ‏4 درجه سانتی‏گراد به مدت 10 دقیقه و در دور g5000 رسوب باکتری به دست آمد. ‏جداسازی DNA ژنومی با استفاده از کیت سیناکلون انجام شد‏. ‏به منظور تخمین کیفیت و کمیت ‏DNA ژنومی استخراج شده، ‏جذب محلول رقیق شده DNA ‏(‏با رقت 100) در طول موج‏های 260 و 280 نانومتر اندازه‏گیری شد. ‏با استفاده از رابطه DNA (‏میکروگرم/میلی لیتر) ‏=50. ‏d. ‏A260Conc. ‏و نسبت A260/A280 به ترتیب غلظت DNA و میزان خلوص آن تخمین زده شد ‏(‏17). ‏پرایمرها مطابق با پرایمرهای عمومی برای تکثیر ژن S rRNA16 به شکل زیر طراحی شدند ‏(‏16)‏: ‏پرایمر Forward: 5' -AGTTTGATCCTGGCTCAG3'. ‏با Tm = 53/7 ºC‏و Reverseprimer: 5' -GGC/T TAC CTT GTT ACG ACT T-3'‏با ‏Tm = 53/4 ºC. ‏واکنش PCR مطابق با برنامه ذیل انجام شد: 1. ‏دمای اولیه ‏94 درجه سانتی‏گراد، ‏برای مدت 5 دقیقه 2. ‏30 سیکل که هر کدام شامل: 94 درجه سانتی‏گراد، ‏45 ثانیه و 54 درجه سانتی‏گراد، ‏45 ثانیه و72 درجه سانتی‏گراد، ‏90 ثانیه 3. ‏برای تکثیر نهایی 72 درجه سانتی‏گراد، ‏برای مدت 8 دقیقه. ‏محصول PCR پس از الکتروفورز ژل آگاروز 1 درصد با استفاده از کیت استخراج DNA خالص‏سازی شد. ‏سپس توالی DNA با استفاده از توالی‏یاب DNA توسط بیونیر[3]‏(‏کره) تعیین شد‏. ‏

بررسی میزان تولید آنزیم فسفاتاز در طی زمان

باکتری مولد فسفاتاز که دارای بیش‏ترین هاله در محیط جامد حاوی تری‏کلسیم فسفات بود، ‏برای تعیین بهترین زمان تولید آنزیم استفاده شد. ‏برای این منظور، ‏این باکتری در محیط PKV در دمای ‏40 درجه سانتی‏گراد و 180 دور در دقیقه ‏کشت داده شدند و به مدت 5 روز با روش مولیبدینیوم- بلو[4]، ‏تولید آنزیم اندازه‏گیری شد ‏(‏18). ‏بازه زمانی که در آن بیش‏ترین غلظت فسفات آزاد در محیط حاصل شود، ‏به عنوان زمان بهینه حل‏کنندگی فسفات در نظر گرفته شد. ‏هم‏زمان با تعیین زمان بهینه حل‏کنندگی فسفات، ‏اسیدیته‏ اولیه محیط کشت PKV نیز اندازه‏گیری شد. ‏علاوه بر این منحنی رشد باکتری نیز در شرایط ذکر شده نیز بررسی شد. ‏

اثر منابع کربنی بر میزان حل‏کنندگی فسفات

برای تعیین بهینه‏سازی منبع کربن، ‏باکتری مورد نظر در محیط PKV، ‏دمای 40 درجه ‏و 180 دور در دقیقه ‏کشت داده و به مدت 3 روز با روش مولیبدینیوم- بلو، ‏میزان حل‏کنندگی فسفات آن‏ها‏ ‏اندازه‏گیری شد. ‏در این محیط از 3 نوع منبع کربن گلوکز، ‏گالاکتوز و گلوکز + گالاکتوز به عنوان منبع انرژی استفاده شدند. ‏به جز تفاوت در منبع کربن، ‏سایر شرایط کشت و سنجش در همه محیط‏ها یکسان در نظر گرفته شد. ‏

اثر منابع نیتروژنی بر میزان حل‏کنندگی فسفات

در بهینه‏سازی منبع نیتروژن برای افزایش میزان حل‏کنندگی فسفات، ‏3 نوع ترکیب متفاوت شامل: آمونیوم سولفات، ‏گلیسین و عصاره مخمر با غلظت ‏(‏5/0 درصد) استفاده شد. ‏باکتری‏های مورد بررسی در محیط PKV، ‏دمای 40 درجه ‏و 180 دور در دقیقه ‏کشت داده و در مدت 3 روز با روش مولیبدینیوم بلو، ‏میزان حل‏کنندگی فسفات آن‏ها‏ اندازه‏گیری شد. ‏

اثر اسیدیته محیط بر میزان حل‏کنندگی فسفات

برای بررسی تاثیر اسیدیته‏ ‏محیط، ‏باکتری مورد نظر در محیط PKV با سه نوع اسیدیته‏ متفاوت ‏(‏5، ‏6 و 7) و به مدت 3 روز کشت داده شد. ‏سپس با استفاده از روش مولیبدات بلو، ‏میزان حل‏کنندگی فسفات آن‏ها‏ اندازه‏گیری شد. ‏

اثر منابع فسفات بر میزان حل‏کنندگی فسفات

در بهینه‏سازی منبع فسفات، ‏باکتری‏های مورد نظر در محیط PKV یک بار با سدیم فیتات به عنوان منبع فسفات ‏(‏محیط پایه PKV) و یک بار با تری کلسیم فسفات و بار دیگر فیتات ‏(‏25/0 درصد)+ تری کلسیم فسفات ‏(‏25/0 درصد) بررسی شدند. ‏همچنین، محیط نوترینت براث ‏(‏NB) هم به‏عنوان شاهد ‏(‏بدون افزودن فسفات) کار رفت. ‏باکتری‏ها در دمای 40 درجه و ‏180 دور در دقیقه کشت داده شدند و میزان حل‏کنندگی فسفات آن‏ها‏ به مدت 3 روز اندازه‏گیری شد. ‏

اثر غلظت‏های مختلف نمک بر میزان حل‏کنندگی فسفات

برای این منظور از غلظت‏های متفاوت نمک‏های موجود در محیط PKV یعنی NaCl، ‏KCl، ‏MgSO4 و FeSO4 استفاده شد. ‏غلظت‏های 1/0، ‏2/0، ‏3/0 و 4/0 از هر یک از نمک‏های ذکر شده در محیط PKV تهیه شد و باکتری مورد نظر در این محیط‏ها کشت داده شد. ‏پس از 48 ساعت میزان فسفات آزاد شده اندازه‏گیری شد. ‏

 

 

 

 

 

نتایج

غربال‏گری باکتری حل‏کننده فسفات

نمونه‏ برداری از چشمه آب گرم لریا با دمای 68 درجه سانتی‏گراد انجام شد. ‏نمونه‏ها ابتدا به محیط مایع PKV با منبع تری‏کلسیم فسفات ‏(‏به میزان 5/0درصد)، ‏تلقیح و در انکوباتور با دمای 40 درجه سانتی‏گراد به مدت 2 روز گرمخانه‏گذاری شدند‏. ‏پس از 48 ساعت این محیط‏ها تعویض و به مدت 3 روز در دمای 40 درجه سانتی‏گراد در انکوباتور گرمخانه‏گذاری شدند. ‏سپس، 100 میکرولیتر از این محیط‏ها روی محیط‏های جامد PKV با منبع تری‏کلسیم فسفات کشت داده و در گرمخانه با دمای 40 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. ‏پس از 48 ساعت میزان هاله اطراف کلونی‏ها بررسی شد ‏(‏شکل1). ‏باکتریی که بیش‏ترین هاله را نشان داد به‏عنوان سوش بهینه برای مطالعات بعدی استفاده شد. ‏با توجه به این‏که در اثر حل‏کنندگی فسفات اسیدیته‏ محیط کاهش می‏یابد، ‏ضروری است که باکتری حل‏کننده فسفات بتواند اسیدیته پایین را تحمل کند. ‏باکتری‏های این چشمه با توجه به اسیدیته‏ محیط زیست خود، ‏توانایی زندگی در اسیدیته پایین را دارا هستند. ‏

 

 

‏شکل 1- باکتری حل‏کننده فسفات در محیط PKV

تعیین گونه میکروارگانیسم با استفاده s rDNA16

با استفاده از اطلاعات حاصل از توالی ژن
 S rDNA16 تعیین گونه باکتریایی انجام شد ‏(‏19). ‏DNA ژنومی با استفاده از کیت استخراج DNA سیناکلون استخراج شد‏ وDNA تکثیر یافته، ‏به طول1400 نوکلئوتید، ‏توسط کیت تخلیص DNA شرکت سیناژن از روی ژل تخلیص و سپس برای تعیین توالی به شرکت بیونیر ‏(‏کره) ارسال شد‏. ‏پس از تعیین توالی، ‏برای ژن مورد نظر در مقایسه با سایر ژن‏های
 S rDNA16 درخت فیلوژنتیکی رسم شد. ‏رسم درخت فیلوژنتیک با استفاده از نرم افزار MEGA4 و مقایسه توالی S rDNA16 باکتری ‏LOR033 با 19 گونه‏های باسیلوس موجود در مرکز ملی بیوتکنولوژی NCBI انجام شد‏ه است ‏(‏20 و 21). ‏نتایج حاصل از تطبیق توالی و درخت فیلوژنتیکی نشان دادند که گونه فوق به licheniformisB. شباهت دارد که میزان شباهت نوکلئوتیدی آن‏ها‏ 97 درصد است ‏(‏شکل 2). ‏

 

 

 

شکل 2- درخت فیلوژنی باکتری

 


بررسی تولید آنزیم ‏در طی زمان‏های گرمخانه‏گذاری

نتایج حاصل از شکل 3 نشان می‏دهد که میزان تولید آنزیم تا 48 ساعت پس از گرمخانه‏گذاری افزایش در خور توجهی نشان می‏دهد ولی پس از آن به تدریج کاهش می‏یابد. ‏به طوری که پس از 5 روز گرمخانه‏گذاری میزان تولید آنزیم نصف مقدار بیشینه گزارش می‏شود. ‏هم‏زمان با تعیین بهینه زمان تولید آنزیم، ‏اسیدیته‏ محیط کشت نیز اندازه‏گیری شد. ‏اسیدیته‏ اولیه محیط کشت 80/6 بود که پس از 24 ساعت این میزان کاهش یافت و محیط اسیدی‏تر شد.

شکل 3- منحنی تولید آنزیم در طی زمان

 

بررسی اثر عوامل مختلف بر قدرت حل‏کنندگی فسفات

اثر منابع کربنی بر میزان حل‏کنندگی فسفات

منبع کربن به عنوان عامل‏‏ مهم و موثر در رشد و متابولیسم میکروبی است. ‏حتی سرعت رشد ویژه ‏به‏وسیله شرایط مختلف محیطی، ‏به ویژه، پیچیدگی محیط کشت و ماهیت منبع کربن و انرژی اصلی تحت تاثیر قرار می‏گیرد. ‏بنابراین، یکی از راه‏های افزایش تولید متابولیت در باکتری‏ها، ‏تعیین بهترین منبع کربن است که بالاترین اثر را در رشد یا بیش‏ترین تولید دارد. ‏برای تعیین بهینه‏سازی منبع کربن، ‏باکتری مورد نظر در محیط PKV در دمای 40 درجه کشت داده شد. ‏در این محیط از 3 نوع منبع کربن گلوکز، ‏گالاکتوز و گلوکز+گالاکتوز به عنوان منبع انرژی استفاده شدند و میزان حل‏کنندگی فسفات آن‏ها‏ بررسی شد. ‏

نتایج حاصل در شکل4 نشان می‏دهد که میزان فسفات آزاد شده در محیط واجد گلوکز به میزان در خور توجهی از سایر محیط‏ها بیشتر است. ‏البته بیش‏ترین میزان تولید در تمام محیط‏ها در زمان 48 ساعت پس از گرمخانه‏گذاری گزارش می‏شود و پس از آن کاهش می‏یابد. ‏نتایج خاطر نشان می‏سازد که میزان رها‏سازی فسفات در محیط واجد گلوکز در زمان‏های 24 و 72 ساعت پس از گرمخانه‏گذاری به ترتیب 70 و 85 درصد میزان بهینه ‏(‏48 ساعت) است. ‏از این رو محیط واجد گلوکز، ‏محیط مناسب‏تری برای تولید آنزیم و افزایش قدرت حل‏کنندگی فسفات در شرایط آزمایشگاه گزارش می‏شود. ‏

 

 

شکل 4- اثر منابع کربنی بر میزان حل‏کنندگی فسفات

 


 اثر منابع نیتروژنی بر میزان حل‏کنندگی فسفات

منبع نیتروژن از عوامل مهم در رشد و تولید محصولات میکروبی است. ‏همچنین، باید توجه داشت که باکتری در مصرف منبع نیتروژن، ‏به انرژی نیاز دارد. ‏به عنوان نمونه مصرف موادی مانند نیترات نسبت به آمونیاک به انرژی بیشتری در باکتری نیاز دارد. ‏بنابراین، بر روی سرعت رشد و در نهایت محصولات میکروبی موثر است. ‏برای بهینه‏سازی منبع نیتروژن برای رها‏سازی فسفات، ‏با توجه به مقاله‏های مشابه، ‏3 نوع ترکیب متفاوت شامل: ‏آمونیوم سولفات، ‏گلیسین و نیترات سدیم با غلظت ‏(‏5/0 درصد) استفاده و میزان فسفات رها شده در طی زمان اندازه‏گیری شد (‏22 و 23). ‏

نتایج بهینه‏سازی منبع نیتروژن برای باکتری مورد نظر نشان داد که در محیط واجد آمونیوم سولفات، ‏در هر 3 روز، ‏بیش‏ترین میزان تولید آنزیم به دست آمد ‏(‏شکل 5). ‏نتایج نشان می‏دهد که افزایش زمان گرمخانه‏گذاری تاثیر قابل ملاحظه‏ایی در تولید آنزیم در محیط واجد گلیسین ندارد. ‏بالا‏ترین و کم‏ترین تولید آنزیم به ترتیب در محیط‏های واجد آمونیوم سولفات و سدیم نیترات گزارش می‏شود. ‏زمان 48 ساعت بهترین زمان تولید آنزیم برای محیط واجد آمونیوم سولفات گزارش می‏شود. ‏در این زمان میزان تولید آنزیم در محیط‏های واجد گلیسین و سدیم نیترات به ترتیب 70 و 30 درصد محیط واجد آمونیوم سولفات است. ‏

 

 

‏‏شکل 5- اثر منابع نیتروژنی بر میزان حل‏کنندگی فسفات

 


اثر اسیدیته محیط بر میزان حل‏کنندگی فسفات

برای بررسی تاثیراسیدیته‏ ‏محیط، ‏باکتری مورد نظر در محیط PKV با سه نوع اسیدیته‏ متفاوت ‏(‏5، ‏6 و 7) کشت داده شد و به مدت 3 روز تولید آنزیم و میزان فسفات آزاد شده بررسی شد. ‏بیش‏ترین میزان تولید آنزیم در اسیدیته 5 ‏پس از 48 ساعت گرمخانه‏گذاری مشاهده شد. ‏به نظر می‏رسد که اسیدیته 6 ‏تأثیر قابل ملاحظه‏ایی در تولید آنزیم و حل‏کنندگی فسفات نشان نمی‏دهد. ‏قدرت حل‏کنندگی فسفات در اسیدیته 7 در زمان‏های 24 و 48 ساعت پس از گرمخانه‏گذاری تاثیر قابل ملاحظه ایی را نشان نمی‏دهد؛ ولی پس از 48 ساعت گرمخانه‏گذاری کاهش می‏یابد. ‏میزان تولید آنزیم در اسیدیته‏‏های 6 و 7 به ترتیب 90 و 85 درصد میزان بهینه ‏(‏اسیدیته 5) است ‏(‏شکل 6). ‏‏این نتایج قابلیت استفاده از این باکتری را در خاک‏های اسیدی نشان می‏دهد. ‏

 

 

شکل 6-‏ اثر اسیدیته‏ بر میزان حل‏کنندگی فسفات

 

 

 

اثر منابع فسفات بر میزان حل‏کنندگی فسفات

برای بهینه‏سازی منبع فسفات، ‏باکتری مورد نظر در محیط PKV ‏یک بار با فیتات به عنوان منبع فسفات ‏(‏محیط پایه PKV) و یک بار با تری کلسیم فسفات ‏(‏فسفر رایج خاک) و بار دیگر فیتات ‏(‏25/0 درصد) ‏+ تری کلسیم فسفات ‏(‏25/0 درصد) بررسی شدند. ‏همچنین، محیط نوترینت براث ‏(‏فاقد فسفات افزودنی) هم به کار رفت. ‏باکتری‏ها در دمای 40 درجه و180 دور در دقیقه‏ کشت داده شدند و در نهایت تولید آنزیم آن‏ها‏ به مدت 3 روز اندازه‏گیری شد. ‏

 

 

 

‏شکل 7-‏ اثر منابع فسفات بر میزان حل‏کنندگی فسفات

 

 

نتایج نشان دادند که در هر 3 روز بیش‏ترین تولید آنزیم در محیط واجد تری‏کلسیم فسفات حاصل شد که بیشینه آن پس از 48 ساعت گرمخانه‏گذاری بدست آمد. ‏پس از آن محیط دارای سدیم فیتات+ تری کلسیم فسفات بالاترین فعالیت را پس از 48 ساعت داشت که میزان آن90 درصد مقدار بیشینه تولید آنزیم بود. ‏تولید آنزیم محیط واجد سدیم فیتات پس از 48 ساعت در جایگاه سوم قرار داشت. ‏همه محیط‏ها پس از 72 ساعت تا حدود قابل ملاحظه‏ایی تولید آنزیم خود را از دست داده اند. ‏علاوه بر این نسبت تفاوت میزان تولید آنزیم محیط‏ها در هر روز، ‏در طی هر سه روز تقریبا ثابت باقی ماند ‏(‏شکل 7). ‏

اثر غلظت‏های مختلف نمک بر میزان حل‏کنندگی فسفات

برای این منظور از نمک‏های NaCl، ‏KCl، ‏MgSO4 و FeSO4 با غلظت‏های 1/0، ‏2/0، ‏3/0 و 4/0 در محیط PKV تهیه شد و باکتری مورد نظر در این محیط‏ها کشت داده شد. ‏پس از 48 ساعت میزان فسفات آزاد شده اندازه‏گیری شد. ‏نتایج نشان داد که تولید آنزیم در حضور غلظت 4/0 درصد NaCl به میزان 10 درصد افزایش داشت. ‏بیش‏ترین میزان تولید آنزیم در حضور 3/0 درصدKCl ‏به میزان 40 درصد افزایش بود. ‏در حضور غلظت‏های مختلف MgSO4 تولید آنزیم به میزان یکسان حدود 15 درصد افزایش داشت. ‏در حضور FeSO4 تا 2/0 درصد تولید آنزیم به میزان 20 درصد افزایش پیدا کرد ولی پس از آن با افزایش غلظت، کاهش پیدا کرد و در غلظت 4/0 درصد به حدود 80 درصد مقدار اولیه کاهش پیدا نمود ‏(‏شکل 8). ‏این نتایج خاطر نشان می‏سازد که این باکتری قابلیت تولید آنزیم و قدرت حل‏کنندگی فسفات در حضور غلظت‏های مختلف نمک‏ها را داراست که قابلیت استفاده آن را در خاک‏های شور نشان می‏دهد. ‏

 

 

 

‏شکل 8- اثر غلظت‏های مختلف نمک بر میزان حل‏کنندگی فسفات

 


بحث و نتیجه­گیری

مطالعات تولید آنزیمی نشان داد که حداکثر تولید آنزیم پس از 2 روز گرمخانه‏گذاری است و هم‏زمان با افزایش زمان گرمخانه‏گذاری اسیدیته‏ نیز کاهش می‏یابد. ‏در مطالعاتی که توسط حسین خانی و همکارانش[v] در خصوص زمان بهینه تولید فسفاتاز توسط یکی از گونه‏های باکتری سودوموناس ‏(‏جداسازی شده از فضولات ماکیان) انجام شد‏، ‏مشخص شد که این باکتری پس از 72 ساعت بهترین تولید آنزیم را داشته است ‏(‏22). ‏این در حالی است که ساسیرخا و همکارانش[vi] گزارش کردند که باکتری سودوموناس آئروژینوزا P6(‏جداسازی شده از خاک) پس از 24 ساعت، ‏بیش‏ترین تولید آنزیم را داشت ‏(‏23). ‏شایان ذکر است که در برخی مطالعات، ‏زمان بهینه فعالیت با تغییر نوع محیط کشت باکتری تغییر یافت. ‏کاهش اسیدیته‏ مشاهده شده در اثر تولید آنزیم و رها شدن فسفات معدنی به محیط به تدریج روی تولید آنزیم نیز اثر منفی می‏گذارد. ‏

بررسی منابع کربنی در میزان حل‏کنندگی فسفات نشان داد که گلوکز مناسب‏ترین منبع کربنی در تولید آنزیم و رها‏سازی فسفات است. ‏در تحقیقات حسین‏خانی و همکارانش باکتری سودوموناس بیش‏ترین تولید آنزیم را در محیط دارای گلوکز+ساکارز به عنوان منبع کربن داشت (‏22). ‏همچنین، در آزمایش‏های ساسیرخا و همکارانش، ‏باکتری سودموناس آئروژینوزا P6، ‏در محیط واجد گلوکز به میزان زیادی آنزیم سنتز کرد ‏(‏در مقایسه با محیط‏های دیگر دارای منبع کربن مختلف) ‏(‏23). ‏

در تحقیقاتی که چاندرا شخارنایوتیال و همکارانش[vii] بر روی بهینه­سازی منبع کربن برای 4 باکتری حل‏کننده فسفات جدا شده از خاک­های قلیایی انجام دادند، ‏مشاهده شد که برای دو سویه، ‏گزیلوز و یکی از باکتری­ها، ‏لاکتوز و دیگری گلوکز از بهترین منابع کربن هستند و در واقع سویه­ها از نظر منبع کربن مناسب با هم اختلاف داشتند ‏(‏14). ‏همچنین، در مطالعه دیگری توسط ترافدار[viii] روی باکتری­های حل‏کننده فسفات جهش یافته، ‏گلوکز به عنوان بهترین منبع کربن مشاهده شد ‏(‏10). ‏به طور کلی با استنباط از این آزمایش و مطالعات دیگران می­توان نتیجه گرفت که تاثیر تغییر منبع کربن با سویه حل‏کننده و سایر شرایط مرتبط است. ‏نتایج بهینه‏سازی منبع نیتروژن و اندازه‏گیری میزان رشد نشان داد که آمونیوم سولفات مناسب‏ترین منبع نیتروژنی برای رشد باکتری و تولید آنزیم مورد نظر است که زمان بهینه در حل‏کنندگی فسفات نیز 48 ساعت پس از گرمخانه‏گذاری گزارش می‏شود. ‏ساسیرخا و همکارانش در بررسی منبع نیتروژن بهینه برای باکتری سودوموناس آئروژینوز اP6‏نتیجه گرفتند که این باکتری در محیط حاوی عصاره مخمر، ‏بیش‏ترین تولید آنزیم را دارد ‏(‏23). ‏در حالی که حسین خانی و همکارانش نتیجه گرفتند که باکتری سودوموناس جداسازی شده از خاک، ‏در محیط واجد عصاره جو، ‏بیش‏ترین تولید را دارد ‏(‏22). ‏بنابراین، می‏توان نتیجه گرفت که منبع نیتروژن بهینه برای باکتری‏های مختلف، ‏متفاوت است. ‏

چاندرا شخارنایوتیال و همکارانش گزارش کردند که در 4 سویه مورد مطالعه، ‏2 مورد حل‏کنندگی بیش‏تری در نیترات پتاسیم و یکی از آن‏ها‏ در نیترات سدیم و دیگری در نیترات کلسیم داشتند. ‏همچنین، آن‏ها‏ اعلام کردند که به نظر می­رسد باکتری­های حل‏کننده فسفات دارای مکانیسم­های متفاوت و تطبیق‏پذیری برای حل‏کنندگی فسفات باشند و به همین دلیل این باکتری­ها در منابع متفاوت از هم، ‏بالا‏ترین حل‏کنندگی را نشان می‏دهند که این موضوع بر خلاف قارچ­های حل‏کننده فسفات است که فقط از طریق دو مکانیسم ‏(‏تولید اسید) عمل می‏کنند ‏(‏14). ‏همچنین، سانگتا متا و شخار نایوتیال نشان دادند در سویه­های موتانت مورد بررسی، ‏آمونیوم سولفات بیش‏ترین تاثیر را دارد ‏(‏10). ‏

بررسی حل‏کنندگی فسفات در حضور اسیدیته‏‏های مختلف نشان داد که اسیدیته 5 ‏مناسب‏ترین است. ‏البته باید توجه داشت که رشد باکتری و متابولیت‏های میکروبی در مدت 3 روز نیز باعث تغییر اسیدیته‏ اولیه محیط کشت می‏شود. ‏بنابراین، بر خلاف دیگر عامل‏‏های موثر برای بهینه‏سازی تولید آنزیم ‏(‏مانند منبع کربن، ‏فسفات و نیتروژن) ‏، ‏میزان اسیدیته محیط متغیر است. ‏

ساسیرخا و همکارانش گزارش کردند که ماکزیمم تولید فیتاز توسط باکتری سودوموناس آئروژینوزا P6در اسیدیته 6 به دست آمد و در حدود 80 اسیدیته فعالیت در محدوده اسیدیته 4 تا 5/7 مشاهده شد. ‏همچنین، با افزایش اسیدیته‏، ‏تولید آنزیم کاهش یافت، ‏به طوری که فقط 30 اسیدیته فعالیت در 10 اسیدیته به دست آمد ‏(‏23). ‏باکتری در محیط دارای اسیدیته 5، ‏مشابه محیط دارای اسیدیته 6 ‏و حتی بیشتر از این محیط عمل می­کند. ‏بنابراین، با تغییر شرایط محیط که به علت رشد و فعالیت باکتری است، ‏فعالیت حل‏کنندگی در محیط­ها در زمان‏های مختلف، ‏با هم تفاوت پیدا می‏کند. ‏اما در این باکتری هم به نظر می­رسد که محدوده اسیدیته‏ ‏بهینه 5 تا 6 است. ‏‏در باکتری حل‏کننده فسفات Pantoeastewartiisubsp. ‏Stewartiig6بیش‏ترین تولید در اسیدیته 5 مشاهده شد ‏(‏24). ‏البته شخارنایوتیال و همکارانش مشخص کردند که در سویه‏های PSB جدا شده از خاک­های قلیایی در اسیدیته 8 و بالاتر ‏(‏یکی از سویه‏ها در اسیدیته 12) بالا‏ترین حل‏کنندگی را نشان می­دهند. ‏این موضوع به علت تطابق سویه­های جدا شده از محیط بومی­ قابل توجیه بود ‏(‏14). ‏

اثر منابع مختلف فسفات نشان داد که تری‏کلسیم‏فسفات اثر در خور توجهی در افزایش تولید آنزیم در طی 3 روز گرمخانه‏گذاری دارد. ‏شایان ذکر است که علاوه بر نوع منبع فسفات، ‏غلظت بالای فسفات نیز به عنوان مهار کننده سنتز فسفاتازها شناخته شده است، ‏در حالی که میزان محدود فسفات باعث بیان بالای این آنزیم‏ها می‏شود. ‏باکتری سودوموناس آئروژینوزا P6 در محیط دارای غلظت فیتات سدیم ‏(‏5/1 درصد)، ‏بالا‏ترین تولید آنزیم را نشان می‏دهد. ‏در حالی که در غلظت بالاتر، ‏میزان تولید آنزیم کاهش می‏یابد ‏(‏23). ‏در مطالعات حسین خانی و همکارانش، ‏باکتری سودوموناس در 3 محیط نوترینت براث، ‏محیط PKV واجد‏تری کلسیم فسفات و محیط PKV دارای فیتین به عنوان منبع فسفات کشت داده که بهترین تولید آنزیم را در فیتین داشت. ‏در این مورد ممکن است فیتات سدیم، ‏تولید فیتاز را القا کند ‏(‏22). ‏اثر غلظت‏های مخلف نمک بر قدرت حل‏کنندگی نشان داد که در غلظت 1/0 درصد، تمامی نمک‏ها افزایش در خور توجهی در تولید آنزیم دارند. ‏بیش‏ترین افزایش در میزان حل‏کنندگی فسفات به میزان 40 درصد در حضور 3/0 درصد KCl مشاهده شد‏. ‏

 

تشکر و قدردانی

این پژوهش با حمایت مالی معاونت پژوهشی دانشگاه شهید باهنر کرمان و صندوق حمایت از پژوهشگران و فن آوران کشور (INSF) انجام شده است که بدین‏وسیله از ایشان قدردانی و سپاسگزاری می‏شود.

 

 

 

 

 

 

 

 

 



[1]. phosphine

[2]. Bacillusmegaterium var. ‏ phosphoricum

[3]. Bioneer

[4]. Molybdenum blue

[v]. Hosseinkhani et al

[vi]. Sasirekha et al.

[vii]. Shekhar Nautiyal et al

[viii]. Tarafdar

References

(1) Katznelson H, Peterson EA, Rovatt JW. Phosphate dissolving microoganisms on seed and in the root zoneof plants. Can J Bot 1962; 40 (9):1181–86.

(2) Abd-Alla MH. Solubilization of rock phosphates by Rhizobium and Bradyrhizobium. Folia Microbiol 1994; 39 (1): 53-6.

(3) Ohtake H, Wu H, Imazu K, Ambe Y, Kato J, Kuroda A. Bacterial phosphonate degradation, phosphite oxidation and polyphosphate accumulation. A Res Conserv and Recycling 1996; 18 (4):125–34.

(4) Roychoudhury P, Kaushik BD. Solubilization of mussorie rock phosphate by cyanobacteria. Curr Sci 1989; 58 (1): 569–70.

(5) Stevenson FJ. Cycles of Soil: carbon, nitrogen, phosphorus, sulfur, micronutrients. New York: John Wiley and Sons; 2005.

(6) Fageria NK. The use of nutrients in crop plants. NewYork:CRC Press, Taylor & Francis Group, LLC: 2009.

(7) Alam S, Khalil S, Ayub N, Rashid M. In vitro solubilization of inorganic phosphate by phosphate solubilizing microorganisms (PSM) from maize Rhizosphere. Intl J Agric Biol 2002; 4 (1): 454-8.

(8) Banik S, Dey BK. Available phosphate content of an alluvial soil as influenced by inoculation of some isolated phosphate solubilizing microorganisms. Plant Soil 1982; 69 (1): 353-64.

(9) Illmer P, Schinner F. Solubilization of inorganic phosphates by microorganisms isolated from forest soil. Soil Biol Biochem 1992; 24 (4): 389–95.

(10) Tarafdar JC, Junk A. Phosphatase activity in the rhizosphere and its relation to the depletion of soil organicphosphorus. Biol Fertil Soil 1987; 3 (4): 199–204.

(11) Rodríguez H, Fraga R. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion. Biotechnology Advances 1999; 17 (5): 319–39.

(12) Kudashev IS. The effect of phosphobacter in on the yield and protein content in grains of autumm wheat, maize and soybean. Doki Akad Skh Nauk 1956; 8 (1): 20-23.

(13) Krasilinikov NA. On the role of soil micro-organism in plant nutrition. Microbiologiya. 1957; 26 (1): 659-72.

(14) Shekhar Nautiyal C, Bhadauria S, Kumar P, Lal H, Mondal R, Verma D. Stress induced phosphate solubilization in bacteria isolated from alkaline soils. FEMS Microbiology Letters 2000; 182 (2):291-6.

(15) Yu X, Liu X, Zhu TH, Liu GH, Mao C. Isolation and characterization of phosphate-solubilizing bacteria from walnut and their effect on growth and phosphorus mobilization. Biol Fertil Soils 2011; 47 (4): 437–46.

(16) Raghu K, MacRae IC. Occurrence of phosphate-dissolving microorganisms in the rhizosphere of riceplants and in submerged soils. J Appl Bacteriol 1966;29 (3): 582–86.

(17) Badoei Dalfard A, Khajeh Kh, Soudi M R, Naderi-Manesh H, Ranjbar B, Sajedi HR. Isolation and biochemical characterization of laccase and tyrosinase activities in a novel melanogenic soil bacterium, Enzyme Microb Technol 2006; 39 (7): 1409-16.

(18) Mehta S, Shekhar Nautiyal C. An Efficient Method for Qualitative Screening of Phosphate-Solubilizing Bacteria. Curr Microbiol 2001; 43 (1): 51–6.

(19) Sambrook, J, Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. NewYork: Cold Spring Harbor; 2001.

(20) Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S, MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4. 0. Molecular Biology and Evolution 2007; 24 (8): 1596-99.