سنتز خارج سلولی نانوذرات نقره توسط باکتری Ralstonia sp. SM8 جدا شده از معدن مس سرچشمه

نویسنده

استادیار میکروبیولوژی، ‏دانشگاه کردستان، ایران

چکیده

  مقدمه: روش‏های مبتنی بر فناوری زیستی به علت تمیزی و سازگاری بسیار بالا با محیط زیست از جایگاه ویژه ای برخوردار اند. ‏با وجود سمیت بالای نقره، ‏تعداد محدودی از میکروارگانیسم‏ها نه تنها در برابر نقره مقاومت دارند بلکه قادر به احیای آن به شکل نانوذرات نقره نیز هستند‏‏. ‏هدف از این تحقیق، ‏جداسازی و معرفی سویه‏های باکتری بومی به‏عنوان زیست واکنشگرهای میکروبی با توانایی سنتز برون سلولی نانوذرات نقره بود .   مواد و روش‏‏ها: 8 سویه باکتری دارای تحمل پذیری بالا نسبت به یون سمی نقره، ‏با استفاده از مشاهدات ریخت‏شناسی و آزمایش‏های اولیه تشخیصی بیوشیمیایی از خاک‏های معادن مس و طلا جداسازی شدند. ‏سویه‏های باکتری با محلول نیترات نقره ‏(‏با غلظت1 گرم در لیتر) با اسیدیته‏ برابر 7، ‏در دمای 28 درجه سانتی‏گراد بر روی همزن مدور ‏(‏120 دور در دقیقه) ‏، ‏به مدت 48 ساعت گرما‏گذاری شد. ‏بررسی تولید نانوذرات از طریق تغییر رنگ محلول واکنش و روش‏های اسپکتروسکوپی، ‏میکروسکوپی و طیف سنجی انجام شد.   نتایج: از میان 8 سویه جداسازی شده با تحمل پذیری بالا نسبت به یون نقره، ‏تنها سویه باکتری SM8 ، ‏جدا شده از معدن مس سرچشمه کرمان، ‏قادر به سنتز خارج سلولی نانوذرات نقره بود. ‏سویه منتخب از نظر صفات فیزیولوژیک، ‏بیوشیمیایی و همچنین، فیلوژنی و مولکولی، شناسایی و در جنس Ralstonia (‏ با شماره دسترسی KF264453 در بانک اطلاعات ژنی NCBI )‏ قرار داده شد. ‏نتایج به دست آمده از مشاهدات چشمی، ‏اسپکتروفتومتری UV-vis و تصاویر به دست آمده از میکروسکوپ الکترونی SEM و پراش اشعه ایکس ‏(‏ XRD ) نشان داد که سوپرناتانت باکتری Ralstonia sp. SM8 ‏، ‏قادر به احیای یون نقره به نانوذرات نقره به شکل خارج سلولی است. ‏نانوذرات نقره تولیدی به شکل کروی و اندازه آن‏ها در ابعاد 20 تا50 نانومتر را بود.   بحث و نتیجه‏گیری: براساس نتایج حاصل از این پژوهش، ‏با استفاده از سوپرناتانت باکتری Ralstonia sp. SM8 ‏، ‏تولید سریع و خارج سلولی نانوذرات نقره، ‏بدون نیاز به مراحل پیچیده استخراج، ‏می‏تواند انجام شود. ‏ مطالعه حاضر، نخستین گزارش از تولید زیستی نانوذرات نقره ‏در ‏جنس Ralstonia است .  

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Extracellular Synthesis of Silver Nanoparticles by Ralstonia sp. SM8 Isolated from the Sarcheshmeh Copper Mine

نویسنده [English]

  • Morahem Ashengroph
Assistant Professor of Microbiology, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran
چکیده [English]

  Introduction: The biological synthesis of nanoparticles has gained enormous importance due to the development of clean and environmentally-friendly processes. Silver is highly toxic to microbial cells, Nevertheless, it has been reported that several microorganisms are silver resistance and corroborate the microbial reduction of water soluble Ag+ to Ag0 nanoparticles. In this study, native strains of bacteria screen for use as biocatalysts for extracellular synthesis of silver nanoparticles.   Materials and methods: Eight different strains of bacteria exhibiting high silver tolerance were isolated from collecting s oil samples from copper and gold mines and characterized using morphological observations and preliminary biochemical tests. The bacterial strains in the presence of 1 g/l Ag+ solution at pH 7 were incubated at 28º C for 48 h in an orbital shaker. The silver nanoparticles formation was investigated by visual observations (changing the color of the reaction solution), spectroscopic techniques and microscopic observations .   Results: Among the 8 strains giving high Ag+ tolerance, the strain SM8, isolated from the Sarcheshmeh Copper Mine, Kerman, showed the capability of promoting the formation extracellular Ag nanoparticles. The strain was selected and identified as Ralstonia sp. SM8 ( GenBank accession number KF264453) based on morphological and biochemical characteristics and its molecular phylogenetic analysis. Results obtained by visual observations, spectral data achieved from UV–vis, XRD spectrum and SEM micrographs revealed the extracellular formation of spherical silver nanoparticles in the size range of 20-50 nm with the culture supernatants of Ralstonia sp. SM8 .   Discussion and conclusion : Based on the results obtained, fast and extracellular synthesis of silver nanoparticles, without the need for complicated extraction steps, can be taken by using the culture supernatants of Ralstonia sp. SM8. The current study is the first report on the biological synthesis of Ag nanoparticles using genus of Ralstonia .

کلیدواژه‌ها [English]

  • Silver Nanoparticles
  • Biological synthesis
  • Ralstonia sp. SM8

مقدمه

کاربرد فناوری در مقیاس اتم و مولکول یکی از فناوری‏های[1] نوظهور در قرن حاضر است که آینده اقتصاد جهان را به شدت متاثر خواهد کرد. ‏میکروارگانیسم‏ها ی مختلف شامل: باکتری‏ها، ‏مخمرها، ‏قارچ‏ها و اکتینومیست‏‏ها برای سوخت و ساز و انجام فرآیندهای حیاتی خود از منابع آلی و معدنی موجود در محیط تغذیه می‏کنند. ‏این ارگانیسم‏ها طی فرآیندهای متفاوت، ‏هنگامی که در معرض یون‏های فلزی قرارمی‏گیرند، ‏آن‏ها را در درون یا بر روی دیواره سلولی خود انباشته کرده و این انباشتگی بیشتر به تولید ذراتی منجر است که در اندازه‏های نانوذرات بسته بندی می‏شوند ‏(‏1). ‏دستیابی به نانو مواد گام نخست در توسعه فناوری نانو است. ‏توسعه روش‏های تهیه نانو مواد برای تولید موادی با ترکیب، ‏اندازه معین و توزیع مناسب اندازه ذره[2] و همچنین، پایداری، ‏از محورهای مورد بحث در پژوهش‏های اخیر محسوب می‏شود. ‏در این میان روش‏های مبتنی بر فناوری زیستی به علت تمیزی و سازگاری بسیار بالا با محیط زیست از جایگاه ویژه ای برخوردار است ‏(‏2 و 3)‏. ‏در حال حاضر از نانوذرات نقره به‏عنوان یک پوشش انتخابی در ساخت صفحات خورشیدی، ‏باتری‏های الکتریکی و گیرنده‏های نوری استفاده می‏شود. ‏همچنین، از آن‏ها به‏عنوان زیست واکنشگر[3] در واکنش‏های شیمیایی و تشخیص سریع انواع سرطان‏ها استفاده می‏شود ‏(‏1 و 2). ‏با توجه به خواص ضد میکروبی نانوذرات نقره از آن‏ها در صنایع غذایی، ‏صنایع نساجی، ‏صنایع کاغذسازی، ‏صنایع ساخت لوازم خانگی و همچنین، صنایع ساخت مواد شوینده و بهداشتی استفاده می‏شود ‏(‏4). ‏تولید فیزیکی و شیمیایی نانو ذرات نقره علاوه بر تحمیل هزینه‏های بالا، ‏سختی مسیر سنتز فرآیند و راندمان تولید کم، ‏آلودگی‏های زیست محیطی بالایی را به همراه دارد. ‏از سوی دیگر، ‏با توجه به کاربرد رو به رشد نانو ذرات نقره، ‏تمایل به گسترش روش‏های سازگار با محیط زیست از طریق توسعه روش‏های زیستی با استفاده بیوکاتالیزورهای میکروبی بسیار مورد توجه قرار گرفته است ‏(‏5). ‏با وجود سمیت نقره برای بسیاری از میکروارگانیسم‏ها، ‏تعداد محدودی از میکروارگانیسم‏‏ها نه تنها در برابر نقره مقاومت دارند بلکه قادر به احیای آن به شکل نانوذرات نقره نیز هستند‏‏. ‏از میان نانوذرات فلزی تولید شده با استفاده از میکروارگانیسم‏های مختلف، ‏نانوذره نقره از مهم‏ترین نانو فلزاتی است که بیشترین تحقیقات را در این زمینه به خود اختصاص داده است. ‏بررسی‏های انجام شده تاکنون، نشان داده اند که میکروارگانیسم‏هایی مانند باکتری‏ها، ‏کپک‏‏های رشته‏ای، ‏مخمرها و اکتینومیست‏ها برای تولید نانوذرات نقره استفاده شده است. ‏اگرچه طیف وسیعی از میکروارگانیسم از قبیل Pseudomonas stutzeri AG259 ‏(‏6)‏، . SH09‏Corynebacterium sp ‏ ‏(‏7)، ‏Lactobacillus sp. (‏8)، ‏Aeromonas sp. SH10 ‏ ‏(‏9)، ‏Acetobacter xylinum(‏10)‏، ‏Bacillus sp. (‏11)، ‏Morganella sp. (‏12) و Plectonema boryanum ‏(‏13) در تولید زیستی نانوذرات نقره بیشتر به‏شکل داخل سلولی بکار گرفته شده اند. ‏با این حال، مطالعات انجام شد‏ه در زمینه تولید خارج سلولی نانوذرات نقره با استفاده از سوپرناتانت کشت میکروبی محدود به چندین جنس قارچی از جمله کپک‏های رشته ای
 Aspergillus fumigatus، ‏Trichoderma asperellum، ‏Phaenerochate chrysosporium و سویه مخمری MKY3 بوده ‏(‏3) و در سویه‏های باکتری تنها در باکتری بیماری‏زا Klebsiella pneumoniae (‏14) و سویه اکتینومیست Streptomyces sp. ERI-3 ‏ ‏(‏15) گزارش شده است. بنابراین، لزوم نیاز به تحقیقات گسترده‏تر حس می‏شود. سویه بومی
 Ralstonia sp. SM8 ‏ غربال‏گری شده در پژوهش حاضر، با توجه به مزایای ‏استفاده از سویه‏های باکتریایی برای تولید صنعتی نانوذرات نقره از جمله سهولت کار با آن‏ها و دستکاری ژنتیکی آسان به علت فقدان هسته، ‏می‏تواند به‏عنوان زیست واکنشگر میکروبی ایمن و کارآمد برای تولید خارج سلولی نانوذرات نقره معرفی شود. ‏در این پژوهش، برای نخستین بار سنتز نانو ذرات نقره توسط یک سویه باکتری از جنس Ralstonia گزارش شده است. ‏‏

 

مواد و روش‏ها

مواد شیمیایی و محیط‏های کشت

نیترات نقره از شرکت سیگما- آلدریچ[4] و ‏پپتون و عصاره مخمر مورد نیاز برای تهیه محیط‏های کشت استفاده شده از شرکت مرک[5] خریداری شد‏. ‏محلول‏های استوک در آب مقطر حل شده و پس از فیلتراسیون به‏وسیله‏ فیلترهای سرنگی 22/0 میکرونی در دمای 4 درجه سانتی‏گراد برای مدت 7 روز نگهداری شدند. ‏در تمام مراحل آزمایش از آب مقطر دو بار تقطیر استفاده شد. ‏

جداسازی سویه‏های باکتری با قابلیت تحمل پذیری نسبت به یون نقره

برای جداسازی سویه‏های باکتری تحمل پذیر به یون نقره، ‏نمونه‏های خاک از معادن مس و طلا واقع در استان‏های کرمان و کردستان جمع آوری شدند. ‏از نمونه‏های خاک جمع آوری شده سری رقت تهیه شد‏. ‏100 میکرولیتر از سری رقت‏های تهیه شده در محیط‏های کشت غنی کننده لوریا- برتانی[6] آگار فاقد نمک سدیم کلراید ‏(‏پپتون 10 گرم در لیتر، ‏عصاره مخمر 5 گرم درلیتر، ‏آگار 20 گرم در لیتر و اسیدیته‏ برابر 7) که حاوی 100 میلی‏گرم در لیتر یون نقره بود، ‏کشت شد. ‏پس از 7 روز گرما گذاری در دمای 28 درجه سانتی‏گراد، ‏سویه‏های باکتری براساس ویژگی‏های ریخت‏شناسی و بیوشیمیایی جداسازی شدند. ‏تحمل پذیری سویه‏های باکتری جدا شده با روش رقت در آگار[7] تعیین شد ‏(‏16). ‏برای این منظور به ارلن‏های 125 میلی‏لیتری حاوی 20 میلی‏لیتر از لوریا- برتانی آگار ‏(‏فاقد نمک سدیم کلراید) ذوب شده، ‏غلظت‏های خاصی از یون نقره ‏(‏1/0، ‏2/0، ‏‏3/0، ‏4/0، ‏5/0، ‏6/0، ‏7/0، ‏8/0، ‏9/0 ‏و 1 گرم در لیتر) اضافه شده و سپس داخل ظرف‏های محیط کشت[8] شیشه‏ای به قطر 8 ‏سانتی‏متر ریخته شد. ‏ظرف‏های محیط کشت آگاردار در دمای 40 درجه سانتی‏گراد به مدت 2 ساعت قرار گرفتند تا سطح مرطوب آن‏ها خشک شود. سپس به‏وسیله‏ نمونه بردار[9]، ‏10 میکرولیتر از محیط مایع که میکروب مورد نظر درآن رشد کرده ‏(‏رشد لگاریتمی) بود و تراکم آن 5/. ‏مک فارلند بود بر روی محیط آگاردار قرار گرفت ‏(‏میکروب تلقیح شده ‏cfu/ml108× 5/1)‏. ‏پلیت‏‏ها پس از 7 روز گرما گذاری در 28 درجه سانتی‏گراد مطالعه شدند. ‏

سنتز خارج سلولی نانو ذرات نقره

سویه‏های باکتری در ارلن‏های 250 میلی‏لیتری حاوی 50 میلی‏لیتر محیط لوریا برتانی فاقد نمک در دمای 28 درجه سانتی‏گراد بر روی همزن مدور[10] ‏(‏120 دور در دقیقه) ‏، ‏به مدت 24 ساعت گرما گذاری شد. ‏محلول نیترات نقره در غلظت نهایی 1 گرم در لیتر یون نقره، ‏به سوسپانسیون کشت اضافه شد. ‏پس از 24 ساعت گرما‏گذاری اضافی در شرایط رشدی مشابه، ‏در صورت مشاهده تغییر رنگ، ‏توده زیستی با استفاده از سانتریفیوژ با سرعت 5000 دور در دقیقه، ‏در مدت 5 دقیقه جدا‏سازی شد. ‏سپس سوپرناتانت سویه منتخب از نظر تولید خارج سلولی نانو ذرات نقره بررسی شد. ‏برای این منظور سلول‏‏ها ابتدا در محیط آبگوشتی ‏لوریا برتانی فاقد نمک سدیم کلراید در دمای 28 درجه سانتی‏گراد و دور همزن rpm120 به مدت 24 ساعت رشد داده شد. ‏پس از برداشت سلول‏‏ها با سانتریفیوژ یخچالی ‏(‏12000 ‏دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه) از سوپرناتانت کشت باکتریایی، ‏به‏عنوان کاتالیزور زیستی برای سنتز خارج سلولی نانوذرات نقره استفاده شد. ‏سوپرناتانت جدا شده کشت باکتری در محیط بافری فسفات و در حضور 1 گرم در لیتر یون نقره در دستگاه همزن با دمای 28 درجه سانتی‏گراد و با دور rpm 120 به مدت 48 ساعت گرمخانه‏گذاری شد. ‏ویژگی نانو ذرات تشیکل شده در محلول واکنش زیست تبدیلی، تحلیل‏های UV، ‏XRD و SEM شد. ‏

شناسایی فنوتیپی و مولکولی سویه باکتری SM8

شناسایی اولیه سویه SM8 براساس مشاهدات ریخت‏شناسی و انجام آزمایش‏های بیوشیمیایی ‏(‏رنگ آمیزی گرم، ‏تولید اسید از گلوکز، ‏آزمایش اکسیداز، ‏آزمایش کاتالاز، ‏آزمایش اکسیداتیو- تخمیر (‏O/F)‏، ‏آزمایش حرکت، ‏تولید پیگمان و رشد در شرایط بی‏هوازی) انجام شد ‏(‏17). ‏سپس برای تایید جنس سویه یاد شده از تعیین ترادف ژن S rDNA16 استفاده شد. ‏استخراج DNA ژنومی با استفاده از روش جوشاندن انجام شد ‏(‏18). ‏در این روش سوسپانسیونی از کلونی خالص باکتری در یک میلی‏لیتر آب دوبار تقطیر استریل تهیه و به مدت 10 دقیقه در بن ماری در حال جوش قرار داده شد. ‏سپس به مدت 5 دقیقه برروی یخ قرار داده و پس از آن در دور g × 3000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. ‏به دنبال سانتریفیوژ کردن، ‏2 میکرولیتر از مایع رویی حاوی DNA به عنوان DNA الگو برای واکنشPCR ‏استفاده شد. ‏تکثیر ژن S rDNA16به‏وسیله‏ پرایمرهای همگانی:

 8F ‏(‏5ʹ-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3ʹ) و 1541R ‏(‏5ʹ-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3ʹ) براساس اطلاعات جداول 1و 2 انجام شد. ‏پس از انجام شدن PCR، ‏محصول برروی ژل آگاروز 1 درصد در شرایط بافری TAE تحت تاثیر ولتاژ 80 به مدت 1 ساعت الکتروفورز شد. ‏محصول حاصل از PCR ‏(‏تقریبا کل ترادف ژنی S rDNA16) با استفاده از کیت تخلیص محصول PCR شرکت فرمنتاز، ‏تخلیص و برای تعیین توالی به شرکت فزاپژوه ارسال شد. ‏توالی به دست آمده با استفاده از نرم افزار NCBI BLAST[11]، ‏از نظر میزان تشابه ژنتیکی با سایر گونه‏های باکتری موجود در بانک ژنومی مقایسه شد. ‏

‏‏‏جدول 1- مواد و مقادیر مورد نیاز برای انجام واکنش PCR در سویهSM8 ‏

مواد

حجم لازم برای واکنش با حجم نهایی 50 )میکرولیتر(

غلظت نهایی

بافر X10 PCR

5

X1

مخلوط dNTP
‏(40 میلی مولار) ‏

1

800 میکرو مولار

MgCl2
‏)‏50 میلی مولار (

2

 2 میلی‏مولار

پرایمر ‏Forward

1

5/0 میکرو مولار

پرایمر Reverse

1

5/0 میکرو مولار

Taq polymerase ‏( ‏5 واحد آنزیم در میکرولیتر) ‏

1

1/0 واحد آنزیم

DNA الگو

2

20 میکروگرم بر میلی‏لیتر

آب تزریقی

اضافه نمودن تا حجم نهایی 50 میکرولیتر

-

جدول 2- چرخه حراتی واکنش PCR انجام شده برای تعیین جنس

ردیف

دما
 ‏(‏درجه سانتی‏گراد)‏

زمان ‏(‏دقیقه) ‏

تعداد چرخه

سیکل اول

95

2

1

سیکل دوم

94

1

30

55

1

72

2

سیکل سوم

72

10

1

 

تعیین ویژگی نانو ذرات نقره

تشکیل نانوذرات نقره در مخلوط واکنش زیست تبدیلی میکروبی با استفاده از مشاهدات چشمی، ‏آزمایش‏های اسپکتروفتومتری UV-vis[12]، ‏تحلیل پراش اشعه ایکس[13] و همچنین، تصویر برداری با میکروسکوپ الکترونی [14]SEM انجام شد. ‏در مرحله اول، ‏تشیکل نانو ذرات با مشاهده تغییر رنگ محلول واکنش حاوی سوپرناتانت کشت باکتری و محلول نیترات نقره ‏(‏AgNO3) مشخص شد. ‏به منظور تعیین طیف جذبی محلول رویی حاصل از سانتریفیوژ، ‏نمونه‏‏ها با سرعت ×g 5000 به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد سانتریفیوژ شدند. ‏سپس تحلیل‏های XRD و SEM با هدف بررسی وضعیت نانو کریستال‏های تشیکل شده و همچنین، بررسی شکل و اندازه آن‏ها انجام شد. ‏برای این منظور ابتدا سوپرناتانت عاری از توده زیستی[15] باکتری، از فیلترهای سرنگی 22/0 میکرونی عبور داده شد و سپس با هدف رسوب نانو ذرات نقره نمونه‏‏ها با سرعت g × 15000 به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد، ‏سانتریفیوژ شد. ‏پس از شستشوی رسوب حاصل با آب مقطر دو بار تقطیر استریل، ‏نمونه‏‏ها در آون 50 درجه سانتی‏گراد به مدت 24 ساعت خشک شدند. ‏

 

نتایج

جداسازی سویه‏های باکتری دارای تحمل پذیری بالا به یون نقره

با توجه به سمیت یون نقره بر روی سلول‏های باکتریایی، ‏شناسایی باکتری‏های تحمل پذیر به غلظت‏های بالای یون نقره، ‏قدم اول در جهت انتخاب سویه برتر جهت مطالعات زیست تبدیلی یون نقره به نانوذره نقره است. ‏در این راستا، ‏18 سویه باکتری از خاک‏های معادن مس و طلا براساس تکنیک غنی‏سازی جدا شدند. ‏تحمل پذیری ذاتی این سویه‏‏ها نسبت به یون سمی نقره به‏وسیله‏ روش رقت در آگار تعیین شد ‏(‏شکل 1). ‏

 

 

شکل 1- الگوی تحمل پذیری به یون نقره در سویه‏های باکتری جدا شده از خاک‏های معادن مس و طلا

 

از بین 18سویه باکتری که براساس ویژگی‏های ریخت‏شناسی و انجام آزمایش‏های بیوشیمیایی از خاک معادن مس و طلا جداسازی شدند، ‏8 سویه باکتری ‏(‏SM2، ‏SM5، ‏SM8، ‏SM10، ‏SM12، ‏KM14، ‏KM15 و KM17)‏ که بالاترین تحمل پذیری را نسبت به یون سمی نقره از خود نشان دادند انتخاب شده ‏(‏شکل 1) و برای بررسی قابلیت احیای یون‏های نقره به نانو ذرات نقره ‏(‏به‏شکل خارج سلولی) در محیط لوریا برتانی فاقد نمک بررسی شدند. ‏

غربال‏گری سویه‏های باکتری با قابلیت سنتز خارج سلولی نانو ذرات نقره

از میان 8 سویه باکتری با قابلیت تحمل پذیری بالا نسبت به یون سمی نقره، ‏تنها سوپرناتانت کشت سویه SM8، ‏جدا شده از معدن مس سرچشمه کرمان، ‏قادر به احیای خارج سلولی یون‏های نقره به نانوذرات نقره، ‏در غلظت 1 گرم در لیتر از یون سمی نقره، ‏بود که با ایجاد تغییر رنگ محلول واکنش زیست تبدیلی از سفید به قهوه ای شناسایی شد ‏(‏شکل 2- قسمت B). ‏در محلول کنترل ‏(‏نیترات نقره عاری از سوپرناتانت کشت سویه SM8) هیچ تغییر رنگی در محلول واکنش مشاهده نشد ‏(‏شکل 2- قسمت A). ‏باکتری‏هایی که قادر به احیای یون نقره هستند، ‏رنگ محلول نیترات نقره را به شکل ارغوانی، ‏قهوه ایی، ‏زرد و خاکستری تغییر می‏دهند که دلیل ایجاد رنگ‏های متفاوت، ‏مکانیسم‏های متفاوت در احیای زیستی یون‏های نقره به نانو ذرات نقره است که به تولید نانوذرات با ابعاد و اشکال متفاوت منجر شده و در نهایت رنگ‏های مختلفی از نانوذرات ظاهر می‏شود ‏(‏19). ‏

 

 

شکل 2- محلول‏های نیترات نقره ‏(‏غلظت یون نقره 1 گرم در لیتر، ‏اسیدیته‏ برابر 7) ‏، ‏عاری از سوپرناتانت ‏(‏قسمت A) و به دنبال اضافه کردن سوپرناتانت کشت سویه SM8 ‏(‏قسمت B) ‏، ‏پس از 48 ساعت گرما گذاری در 28 درجه سانتی‏گراد روی همزن مدور ‏(‏120 دور در دقیقه). ‏

 

تحلیل نمونه‏ها با اسپکتروفتومتری UV-vis، ‏یک پیک جذبی مشخص را در طول موج 430 نانومتر ‏(‏پیک اختصاصی برای نانوذرات نقره) را نشان داد که بیانگر وجود نانوذرات نقره در محلول واکنش زیست تبدیلی است ‏(‏شکل 3- B). ‏براساس منابع معتبر، بیشینه پیک جذبی نانوذرات نقره در طول موج‏های 400 تا 450 نانومتر است ‏(‏20). ‏در محلول کنترل ‏(‏عاری از سوپرناتانت کشت باکتری)‏، ‏در طول موج‏های بین 300 تا 700 نانومتر هیچ پیک جذبی مشاهده نشد ‏(‏شکل 3- A). ‏

در ادامه این پژوهش، ‏تحلیل XRD به منظور اثبات نانوکریستال‏های فلزی نقره انجام شد. ‏براساس نتایج به دست آمده که در شکل ‏(‏4) نشان داده شده است، ‏نانوذرات کریستالی نقره در سطوح 111، ‏200، ‏220 و 311 به ترتیب پیک‏های با مقادیرº2/38، ‏º4/46، ‏º6/64 و º6/77 را نشان داد که با نمونه استاندارد نانوکریستال‏های نقره کاملا همخوانی دارد ‏(‏21).

 

 

 

شکل 3- طیف‏های اسپکتروفتومتری محلول‏های نیترات نقره ‏(‏غلظت یون نقره 1 گرم در لیتر، ‏اسیدیته‏ برابر 7) ‏، ‏عاری از سوپرناتانت ‏(‏ A) و به دنبال اضافه کردن سوپرناتانت کشت سویه SM8 ‏(‏ B) ‏، ‏پس از 48 ساعت گرما گذاری در 28 درجه سانتی‏گراد روی همزن مدور ‏(‏120 دور در دقیقه). ‏

 

شکل 4- تحلیل پراش اشعه ایکس ‏(‏XRD) نانو ذرات سنتز شده توسط سویه SM8

 

 

شکل 5- میکروگراف‏های SEM حاصل از نانوذرات نقره سنتز شده توسط سویه باکتری SM8

 

تصاویر به دست آمده از میکروسکوپ الکترونی SEM نیز سنتز نانوذرات نقره با ابعاد 20 تا 50 نانومتر و اشکال کروی را نشان داد ‏(‏شکل 5). ‏پس از قطعی شدن توانایی تولید نانوذرات نقره توسط سویه SM8، ‏شناسایی سویه منتخب با استفاده از روش‏های فنوتیپی و مولکولی انجام شد.

شناسایی مولکولی سویه باکتریSM8

به دنبال شناسایی اولیه براساس مشاهدات ریخت‏شناسی و آزمایش‏های بیوشیمیایی اولیه، ‏برای شناسایی دقیق سویه SM8، به استخراج DNA ژنومی و تکثیر ژن S rDNA16 با استفاده از پرایمرهای همگانی 8F و 1541R اقدام کردیم. ‏همان‏گونه که در شکل ‏(‏6-A) مشاهده می‏شود، ‏محصول PCR در ناحیه 5/1کیلو بازی نمایان شده است که حکایت از خلوص DNA استفاده شده برای تعیین توالی دارد. ‏پس از مشخص شدن توالی ژن S rDNA16سویه یاد شده ‏(‏شکل 6- B) و بلاست نمودن آن در سایت اینترنتی NCBI، ‏باکتری مورد نطر شناسایی شده و در جنس Ralstonia sp. ‏قرار گرفته است. ‏براساس نتایج حاصل از بلاست ‏(‏جدول 3) این سویه دارای مشابهت 99 درصدی با سویه‏های جنس Ralstonia sp. ‏است‏‏. ‏

 

 

A

 

 

B

 

AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCATGATCTAGCTTGCTAGATTGATGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCCTGTAGTGGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGTGGGGGACGGCAAGGCCTCATGCTATAGGAGCGGCCGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCACACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCGCACTTACAAATATTAGGTGTGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGGACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTCCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTGTGCAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAATTGCATTGGTGACTGCACGGCTAGAGTGTGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGATAACACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGCATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCACTAACGAAGCAGAGATGCATTAGGTGCTCGAAAGAGAAAGTGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCTAGTTGCTACGAAAGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTGCATACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCAGAAAATGCATCGTAGTCCGGATCGTAGTCTGCAACTCGACTACGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTGCCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGGGGGCGATTACCACGGCAGGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCT

A

شکل6- ‏(‏A) الکتروفورز محصول PCR ژنوم باکتریDNA :A. ‏SM8 نشانگر، ‏B: سویه باکتری SM8 تولید کننده نانوذره نقره، ‏C: کنترل منفی. ‏B)‏: توالی نوکلئوتیدی ژن S rDNA16 سویه باکتری SM8. ‏

 

جدول 3- نتایج حاصل از بلاست کردن سویه باکتری SM8 در سایت اینترنتی NCBI.

شماره دسترسی

Max identity

(درصد)

E value

Query cover

(درصد)

Total score

Max

score

میکروارگانیسم

AB740040

99

0/0

100

2736

2736

Ralstonia sp. NT80 ‏

EF554889

99

0/0

97

2666

2666

Ralstonia sp. H13. ‏

EF554880

99

0/0

97

2664

2664

Ralstonia sp. EF1. ‏

EF554881

99

0/0

97

2663

2663

Ralstonia sp. EF28

CP001644

98

0/0

100

5300

2650

Ralstonia picketti 12D

AF280433

98

0/0

99

2648

2648

Ralstonia detusculanense

 

 


بحث و نتیجه­گیری

جذابیت استفاده از میکروارگانیسم‏ها درتولید نانوذرات فلزی به علت تمیزی و‏سازگاری بسیار بالا با محیط زیست، ‏توزیع مناسب و یکنواخت ذرات تولید شده، ‏پایداری بالا، ‏انعطاف پذیری بیشتر، ‏انتشار نور بهتر و آسانی تولید است‏‏. ‏در دو دهه اخیر غربال‏گری‏های میکروبی زیادی برای تولید زیستی نانوذرات به علت خواص ویژه نوری، ‏شیمیایی، ‏الکتریکی و فوتوالکتریکی آن‏ها انجام شد‏ه است که موید استفاده‏های گوناگون این مواد در زمینه‏هایی چون کاتالیست‏ها، ‏اپتیک، ‏دانش داروهای زیستی، ‏مکانیک، ‏مغناطیس و انرژی است ‏(‏3). ‏سنتز زیستی نانوذرات نقره یک دستاورد علمی از علم فناوری نانو است که در عرصه‏های مختلف علوم پزشکی و صنایع مختلف از جمله غذایی، ‏آرایشی و بهداشتی، ‏دامپروری و کشاورزی کاربردهای فراوان دارد ‏(‏4). ‏اساسا برای این‏که فرآیندهای میکروبی قابلیت صنعتی شدن پیدا کنند باید کم هزینه، ‏دارای عملیات پیوسته و سرعت تولید بالا باشند که در این راستا غربال‏گری سویه‏های میکروبی جدید برای نیل به این هدف بسیار حائز اهمیت است. ‏مطالعه اخیر در راستای جداسازی و شناسایی سویه‏های باکتری بومی با پتانسیل سنتز خارج سلولی نانو ذرات نقره انجام شد. ‏در این پژوهش، ‏18 سویه باکتری تحمل پذیر نسبت به یون سمی نقره، ‏از نمونه‏های مختلف خاک جمع آوری از معادن مس و طلا در مناطق مختلف ایران جداسازی شدند. ‏سویه‏های جدا شده از نظر تحمل پذیری بالا ارزیابی شدند. ‏براساس یافته‏های به دست آمده 8 سویه دارای بیشترین تحمل پذیری ‏(‏بالاتر از 1 گرم در لیتر) نسبت به یون سمی نقره بودند ‏(‏شکل 1). ‏در ادامه این تحقیق، ‏تولید زیستی
نانو ذرات نقره به‏شکل خارج سلولی در 8 سویه با تحمل پذیری بالا نسبت به یون نقره ارزیابی شد. ‏براساس یافته‏های به دست آمده، ‏تنها سوپرناتانت سویه SM8 جدا شده از معدن مس سرچشمه کرمان، ‏قادر به تولید زیستی نانو ذرات نقره بود. ‏سویه یاد شده براساس ویژگی‏های فنوتیپی، ‏بیوشیمیایی و فیلوژنیکی تحت عنوان Ralstonia sp. SM8 ‏ شناسایی شد. ‏سویه SM8 میله ای شکل، ‏گرم منفی، ‏شدیدا هوازی، ‏اکسیداز و کاتالاز مثبت و متحرک بوده و دارای مشابهت بیش از 99 درصدی با سویه‏های ثبت شده در جنس
Ralstonia sp. ‏‏بود. ‏توالی نوکلئوتیدی ژن
 S rDNA16سویه SM8 با شماره دسترسی[xvi] ‏KF264453 در بانک جهانی اطلاعات ژنی[xvii] قابل دسترسی است. ‏اگرچه سنتز زیستی نانو ذرات نقره در انواع مختلفی از میکروارگانیسم‏ها ‏از قبیل کپک‏های رشته ای، ‏مخمرها و باکتری‏هاگزارش شده است. ‏با این حال به جز چند استثنا، ‏درسایر مطالعات انجام شد‏ه تولید نانو ذرات یاد شده به شکل داخل سلولی گزارش شده است. ‏از میان نانوذرات فلزی تولید شده با استفاده از میکروارگانیسم‏های مختلف، ‏نانو ذره فلزی نقره از مهم‏ترین نانو فلزاتی است که بیشترین تحقیقات را در این زمینه به خود اختصاص داده است. ‏در یکی از تحقیقات انجام شده درباره سنتز نانو ذرات نقره، ‏از کشت باکتری Bacillus sp.‏، ‏برای احیای یون‏های یک ظرفیتی نقره از یک محلول نیتراتی به منظور دستیابی به نانو ذرات 5 تا 15 نانومتری، ‏در دما و فشار محیط استفاده شده است (‏11). ‏Shewanella algae، ‏باکتری احیاء کننده آهن ‏(‏III) Fe ‏، ‏نیز در محیط بی هوازی و در حضور گاز هیدروژن قادر به احیای یون‏های نقره و طلا و ایجاد نانو ذرات 10 تا 20 نانومتری است‏‏ ‏(‏22). ‏Pseudomonas stutzeri AG259، ‏قادر است که نانوذرات نقره با اندازه 35 تا 46 نانومتری را در دیواره خود از محیط سولفیدی بازیابی کند ‏(‏23). ‏باکتری‏های لاکتیک اسید موجود در آب پنیر و شیر که تحمل غلظت بالای یون‏های فلزی را ندارند نیز قادر به احیای یون‏های طلا و نقره و ایجاد نانوذرات مربوطه به‏شکل داخل سلولی هستند ‏(‏8). ‏اگرچه چندین سال است که از مخمر‏ها برای تولید نانو ذرات به‏شکل داخل سلولی استفاده می‏شود، ‏ولی در پژوهش‏های اخیر نانوذرات نقره به‏شکل خارج سلولی و با استفاده از سویه مخمر MKY3 با ابعاد دو تا پنج نانومتر در مرحله رشد لگاریتمی، ‏هنگام تقابل با نیترات نقره تولید شده است ‏(‏24). ‏در سال‏های اخیر کپک‏های رشته ای نیز به فهرست میکروارگانیسم‏های استفاده شده در تولید نانوذرات فلزی اضافه شده است. ‏جذابیت استفاده از قارچ‏ها در تولید نانوذرات به علت وجود مقادیر قابل ملاحظه ای از آنزیم‏ها و پروتئین‏های ویژه در این میکروارگانیسم‏ها، ‏سهولت کار با آن‏ها در آزمایشگاه، ‏سهولت دسترسی به مقادیر زیادی توده زیستی سلولی و شاید از همه مهمتر فرآیند پایین دستی ساده‏تر است‏‏. ‏با این حال دستکاری ژنتیکی این ارگانیسم‏های یوکاریوتی در مقایسه با پروکاریوت‏ها بسیار دشوارتر است‏‏. ‏از میان قارچ‏ها‏ی تولید کننده نانوذرات فلزی نقره سه جنس Verticillium، ‏AspergillusوFusarium بسیار مطالعه شده‏اند ‏(‏3 و 25- 27). ‏در یکی از جدید‏ترین تحقیقات انجام شده در ارتباط با تولید خارج سلولی نانو ذرات نقره با استفاده از سویه‏های باکتری، ‏نتایج تحقیقات فخری و همکارانش[xviii] ‏(‏15) نشان داد که سوپرناتانت کشت باکتری Streptomyces sp. ERI-3، ‏پس از مواجهه با محلول نیتراتی نقره، ‏قادر به سنتز نانوذرات نقره در ابعاد 10 تا 100 نانومتر پس از 48 ساعت گرما‏گذاری در دمای 28 درجه سانتی‏گراد بوده است. ‏با این وجود استفاده از سویه‏های استرپتومیستی، ‏با توجه به رشد کمابیش پایین، ‏نیازمندی‏های غذایی کمابیش پیچیده و از همه مهمتر با توجه به رشته ایی بودن که باعث بروز مشکلات جدی در فرآیندهای پایین دستی و افزایش نرخ این فرآیند‏ها می‏شود، ‏تا حدود بسیار زیادی در فرآیندهای صنعتی محدود شده است. ‏با وجود اهمیت تولید زیستی نانوذرات نقره و با وجود مطالعات وسیع در این ارتیاط، ‏مطالعات بسیار کمی در سطح کشور انجام شد‏ه و مطالعه حاضر می‏تواند سهمی در معرفی سویه‏های بومی جدید با پتانسیل تولید خارج سلولی نانوذرات نقره در مجامع ملی و بین المللی داشته باشد. ‏مزیت سنتز خارج سلولی ‏نانو ذره نقره توسط باکتری Ralstonia sp. SM8 ‏ جدا شده در تحقیق حاضر در این است که تولید داخل سلولی نانو ذره یاد شده پر هزینه بوده و نیاز به مراحل اضافی برای استخراج نانو ذرات از درون سلول دارد ‏(‏28). ‏بنابراین، به‏وسیله‏ باکتریRalstonia sp. SM8 ‏می‏توان به تولید خارج سلولی نانو ذرات نقره، ‏بدون نیاز به مراحل پیچیده استخراج، ‏دست یافت. ‏امید است با بهینه‏سازی شرایط واکنش زیست تبدیلی Ralstonia sp. SM8 و محلول AgNO3، ‏از نظر دما، ‏اسیدیته‏، ‏مدت زمان گرماگذاری، ‏غلظت اولیه یون سمی نقره، ‏غلظت اولیه سوپرناتانت عاری از کشت باکتری و سایر شاخص‏های مربوطه، ‏در آینده از سویه بومی جدا شده در این پژوهش، ‏به‏عنوان یک زیست واکنشگر موثر و کارآمد در احیای میکروبی محلول نیترات نقره به نانوذرات فلزی نقره به‏شکل خارج سلولی در مقیاس صنعتی بهره برداری کرد. ‏

تشکر و قدردانی

این تحقیق در قالب طرح پژوهشی به شناسه 1391/42377/4 با حمایت مالی معاونت پژوهشی دانشگاه کردستان انجام شده است. ‏بدین وسیله از معاونت پژوهشی دانشگاه کردستان تشکر و قدردانی می‏شود.

 

 

 



[1]. Technology

[2]. Monodispersity

[3]. Biocatalyst

[4]. Sigma-Aldrich, St. ‏ Louis, MO

[5]. E. ‏ Merck, Darmstadt, Germany

[6]. Luria Bertani

[7]. Agar dilution method

[8]. Plates

[9]. Sampler

[10]. Shaker

[11]. http://www. ‏ncbi. ‏nlm. ‏nih. ‏gov/blast

[12]. Analytik Jena's spectrophotometer SPECORD 210,Carel Zeiss Technology, Germany

[13]. X-ray Diffractometer, D8ADVANCE, Bruker, Germany

[14]. KYKY-EM3200, KYKY Technology Development Ltd. ‏, China

[15]. Biomass

[xvi]. Accession number

[xvii]. NCBI

[xviii]. Faghri et al

References

(1)  Thakkar KN, Mhatre SS, Parikh RY. Biological synthesis of metallic nanoparticles. Nanomedicine: NBM2009; 6(2): 257-62.

(2)  Salata OV. Applications of nanoparticles in biology and medicine. J Nanobiotech 2004; 2(3): 1-6.

(3)  Narayanan KB, Sakthivel N. Biological synthesis of metal nanoparticles by microbes. Adv Colloid Interface Sci 2010; 156(1-2): 1-13.

(4)  Souza GIH, Marcato PD, Durán N, Esposito E. Utilization of Fusarium oxysporumin the biosynthesis of silver nanoparticles and its antibacterial activities. In IX National Meeting of Environmental Microbiology; Curtiba, PR (Brazil); 2004; Abstract pag. 25.

(5)  Mandal D, Bolander ME, Mukhopadhyay D, Sarkar G, Mukherjee P. The use of microorganisms for the formation of metal nanoparticles and their application. Appl Microbiol Biotechnol 2006; 69(5): 485–92.

(6)  Klaus T, Joerger R, Olsson E, Granqvist CG. Silver-based crystalline nanoparticles, microbially fabricated. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96(24): 136114.

(7)  Zhang H, Li Q, Lu Y, Sun D, Lin X, Deng X, et al. Biosorption and bioreduction of diamine silver complex by Corynebacterium. J Chem Technol Biotechnol 2005; 80(3): 285–90.

(8)  Nair B, Pradeep T. Coalescence of nanoclusters and formation of submicron crystallites assisted by Lactobacillus strains. Cryst Growth Des 2002; 2(4): 293-8.

(9)  Mouxing FU, Qingbiao LI, Daohua SUN, Yinghua LU, Ning HE, Xu DENG, et al. Rapid preparation process of silver nanoparticles by bioreduction and their characterizations.Chinese J Chem Eng 2006; 14(1): 114-7.

(10)             Barud HS, Barrios C, Regiani T, Marques RFC, Verelst M, Dexpert-Ghys J, et al. Self-supported silver nanoparticles containing bacterial cellulose membranes. Mat Sci Eng C 2008; 28(4): 515-8.

(11)             Pugazhenthiran N, Anandann S, Kathiravan G, Kanna- ian N, Prakash U, Crawford S, et al. Microbial synthesis of silver nanoparticles by Bacillus sp. J Nanopart Res 2009; 11(7): 1811-5.


(12)             Parikh RP, Singh S, Prasad BLV, Patole MS, Sastry M, Shouche YS. Extracellular synthesis of crystalline silver nanoparticles and molecular evidence of silver resistance from Morganella sp.: towards understanding biochemical synthesis mechanism. Chem biochem 2008; 9(9): 1415-22.

(13)             (13) Lengke MF,  Fleet ME,  Southam G. Biosynthesis of silver nanoparticles by filamentous cyanobacteria from silver (I) nitrate complex. Langmuir 2007; 23(5): 2694–9.

(14)             Shahverdi AR, Fakhimi A, Shahverdi HR, Minaian S. Synthesis and effect of silver nanoparticles on the antibacterial activity of different antibiotics against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Nanomedicine 2007; 3(2): 168-71.

(15)             Faghri ZN, Salouti M. Extracelluar biosynthesis of silver nanoparticles using cell filtrate of Streptomyces sp. ERI-3. Scientia Iranica 2011; 18(6): 1631-5.

(16)             Washington JA, Sutter VL. Dilution susceptibility test: agar and macro-broth dilution procedures. In: Lennette EH, Balows A, Hausler JR, WJTruant, J.(Eds.) , Manual of Clinical Microbiology, 3 rd ed., Washington DC; American Society for Microbiology; 1980.

(17)             Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST. Bergey ' s manual of determinative bacteriology. 9th ed. Baltimore, Maryland; Williams and Wilkins; 1994.

(18)             Malorny B, Hoorfar J, Bunge C, Helmuth R. Multicenter validation of the analytical accuracy of Salmonella PCR: towards an international standard. Appl Environ Microbiol 2003; 69(1): 290-6.

(19)             Sondi I, Salopek-Sondi B. Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for Gram-negative bacteria. J Colloid Interface Sci 2004; 275(1): 177-82.

(20)             Kalimuthu K, Suresh Babu R, Venkataraman D, Bilal M, Gurunathan S. Biosynthesis of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis. Colloids Surf B Biointerfaces 2008; 65(1): 150-3.

(21)             Magudapathy P, Gangopadhyay P, Panigrahi BK, Nair KGM, Dhara S. Electrical transport studies of Ag nanocrystallites embedded in glass matrix. Physics B 2001; 299(1-2): 142-6.

(22)             Konishi Y, Nomura T, Tsukiyama T, Saitoh N. Microbial preparation of gold nanoparticles by anaerobic bacterium. Trans Mater Res Soc Jpn 2004; 29(5): 2341–3.

(23)             Slawson RM, Vandyke MI, Lee H, Trevor JT. Germanium and silver resistance, accumulation and toxicity in microorganisms. Plasmid 1992; 27(1): 72–9.

(24)             Kowshik M, Ashtaputre S, Kharrazi S, Vogel W, Urban J, Kulkarni S, et al. Extracellular synthesis of silver nanoparticles by a silver - tolerant yeast strain MKY3. Nanotechnology 2003; 14(1): 95-100.

(25)             Ahmad A, Mukherjee P, Senapati S, Mandal D, Khan MI, Kumar R, et al. Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles using the fungus Fusarium oxysporum. Coll Surf B 2003; 28(4): 313–8.

(26)             Bhainsa KC, D'Souza SF. Extracellular biosynthesis of silver nanoparticle using the fungus Aspergillus fumigates. Colloids Surf B Biointerfaces 2006; 47(2): 160-4.

(27) Khosravi A, Shojaosadati SA. Evaluation of silver nanoparticles produced by fungus Fusarium oxysporum. Int J Nanothechnol 2009; 6(10-11): 973-83.

(28) Ahmad A, Senapati S, Islam Khan M, Kumar R, Ramani R, Srinivas V, et al. Intracelluar synthesis of gold nanoparticles by a novel alkalotolerant actinomycete, Rhodococcus sp. Nanotechnology 2003; 14(7): 824-8.