بهینه‌سازی تولید بیواتانول از باگاس نیشکر پیش تیمار اسیدی شده با به کارگیری پیکیا استیپیتیس

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری بیوتکنولوژی، ‏دانشگاه تربیت مدرس، ‏تهران، ایران

2 دانشیار بیوتکنولوژی، ‏سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران، ‏تهران، ‏ایران

3 استاد بیوتکنولوژی، ‏دانشگاه تربیت مدرس، ‏تهران، ‏ایران

4 استاد مهندسی شیمی، ‏دانشگاه تربیت مدرس، ‏تهران، ‏ایران

5 استادیار بیوتکنولوژی، ‏دانشگاه تربیت مدرس، ‏تهران، ‏ایران

چکیده

  مقدمه: به علت محدود بودن سوخت‌های فسیلی و مصرف روز افزون آن‏ها‏، ‏تولید سوخت‌های زیستی مایع از اهمیت بالایی برخوردار است. ‏استفاده از مواد اولیه­ای که مصرف غذایی نداشته باشند، ‏مانند مواد لیگنوسلولزی برای ‏تولید سوخت‏های زیستی نسل دوم مطرح‌اند. ‏با توجه به این‏که مقدار در خور توجهی از مواد لیگنوسلولزی را قند‏های پنتوز تشکیل می‌دهد، ‏استفاده از این قندها برای تولید سوخت‌های زیستی اهمیت ویژه­ای دارد. ‏بنابراین، در این پژوهش، از مخمر پیکیا استیپیتیس برای تولید بیواتانول از این قندهای پنج کربنه و بهینه‏سازی شرایط تخمیر استفاده شده است.   مواد و روش‏‏ها: باگاس نیشکر با روش اسید رقیق پیش تیمار شد. ‏از مخمر پیکیا استیپیتیس برای تخمیر قندهای حاصل از پیش تیمار باگاس استفاده شد. ‏برای بهینه‌سازی فرآیند تخمیر و افزایش مقدار اتانول منابع نیتروژن، ‏فسفر، ‏روی، ‏گوگرد، ‏منیزیم و ویتامین مورد نیاز مخمر با استفاده از روش طراحی آزمایش‌ها بررسی شد. در ‏طراحی تاگوچی، آرایه L27 با 8 عامل‏‏ و سه سطح در نظر گرفته شد.   نتایج: تحلیل نتایج حاصل از طراحی آزمایش‌ها به روش تاگوچی نشان می‌دهد که شربت ذرت خیسانده، ‏دی‏آمونیوم‏هیدروژن فسفات، ‏منیزیم سولفات و پتاسیم دی هیدروژن فسفات به ترتیب اثر در خور توجهی بر روی تولید اتانول داشته­اند. ‏آزمایش تاییدی نشان داد که مقدار اتانول نسبت به میانگین داده‏ها 97 درصد افزایش یافت. ‏اتانول طی 48 ساعت با بازده 26/0گرم اتانول بر گرم قند مصرفی و بهره دهی 125/0 گرم بر لیتر بر ساعت تولید شد.   بحث و نتیجه‏گیری: تولید اتانول از باگاس نیشکر از آبکافته باگاس در شرایط بهینه نسبت به پژوهش­های مشابه بازده بیشتری داشته است. ‏نتایج حاصل از تولید اتانول با استفاده از منابع ارزان قیمت، ‏پس از بهینه‌سازی، ‏نشان از اهمیت محیط کشت بهینه برای تولید اقتصادی اتانول دارد .  

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Optimization of media for bioethanol production by Pichia stipitis from sugarcane bagasse pretreated by dilute acid

نویسندگان [English]

  • Mohsen Ahi 1
  • Mehrdad Azin 2
  • Seyed Abbas Shojaosadati 3
  • Ebrahim Vasheghani Farahani 4
  • Mohsen Nosrati 5
1 Ph.D student of Biotechnology, Tarbiat Modaress University, Tehran, Iran
2 Associated Professor of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science & Technology, Tehran, Iran
3 Professor of Biotechnology, Tarbiat Modaress University, Tehran, Iran
4 Professor of Chemical Engineering, Tarbiat Modaress University, Tehran, Iran
5 Assistant Professor of Biotechnology, Tarbiat Modaress University, Tehran, Iran
چکیده [English]

  Introduction: Reduction of fossil fuels due to its increasing consumption caused the biofuels production as an important topic, today. Using resources that have not food application was regarded as the second generation biofuels and consisted of lignocelluloses. Since considerable amount of lignocellulosic material are pentoses, utilizing them is important for the production of biofuels.   Materials and methods: Sugarcane bagasse was pretreated with dilute acid method. Pichia stipitis was used for the fermentation of released sugars. A L27 Taguchi orthogonal array was considered to optimize the fermentation process and increase the amount of ethanol. The eight factors with three levels considering nitrogen, phosphorus, zinc, sulfur, magnesium, and vitamins sources were considered in this study.   Results: The analysis of the results shows that corn steep liquor, ammonium hydrogen phosphate, potassium di-hydrogen phosphate and magnesium sulfate have a significant effect on the production of ethanol, respectively. Confirmation of the optimal conditions shows that ethanol production was increased 97% relative to the mean of the observed results. The yield and productivity during 48 h of the fermentation were reached to 0.26 (g ethanol/g consumed sugar) and 0.125g (L.h), respectively.   Discussion and conclusion: At the optimum condition the production of ethanol from sugarcane bagasse hydrolysate had higher efficiency relative to previous studies. Results of medium optimization considering cheap resources showed showed an excellent potential toward an economical bioethanol production process .  

کلیدواژه‌ها [English]

  • Dilute acid
  • Optimization
  • Pichia stipitis
  • Pretreatment
  • Sugarcane bagasse

مقدمه

با توجه به محدودیت سوخت‌های فسیلی و به علت مصرف روزافزون آن‏ها‏، ‏تولید سوخت‌های زیستی مایع از مواد لیگنوسلولوزی اهمیت ویژه­ای یافته است. ‏بیواتانول به عنوان یکی از سوخت‌های جایگزین مطرح است که می‌توان آن را به شکل ترکیبی با بنزین برای استفاده در وسایل نقلیه و بدون تغییر موتور استفاده کرد (‏1). ‏روش متداول تولید اتانول استفاده از روش‌های تخمیری است که با استفاده از سوبسترای قندی انجام می‌گیرد. ‏سوبسترای قندی مانند ملاس یا به شکل قند‏های قابل تخمیر است که مستقیما می‌توان از آن اتانول تولید کرد و یا این‏که مانند ذرت سوبسترای نشاسته ایست که باید آن را به قند‏های قابل تخمیر تبدیل و سپس برای تولید اتانول استفاده کرد. ‏به سوخت‌های حاصل از سوبسترا‏های مانند نشاسته که می‌توان آن‏ها‏ را برای مصرف غذایی نیز در نظر گرفت، ‏سوخت‌های نسل اول می‌گویند. ‏امروزه انتقاد‏های زیادی برای استفاده از سوخت‌های نسل اول مطرح است از این رو که مواد اولیه آن‏ها‏ سطح بالایی از زمین‏های کشاورزی را به خود اختصاص می­دهند و نیز مصرف غذایی دارند. ‏استفاده از منابع اولیه ای که مصرف غذایی نداشته باشند برای تولید سوخت‌های زیستی نسل دوم مطرح‌اند و مواد لیگنوسلولزی را در بر می­گیرند. ‏با توجه به این‏که مقدار زیادی از مواد لیگنوسلولزی را قند‏های پنتوز تشکیل می‌دهند، ‏استفاده از این قندها برای تولید سوخت‌های زیستی اهمیت ویژه ای دارد. ‏میزان تولید باگاس نیشکر در ایران سالیانه حدود 4 میلیون تن است (‏2)‏. ‏این میزان بقایای کشاورزی باعث اشغال فضای زیاد و اعمال هزینه‏های در خور توجه برای از بین بردن، ‏سوزاندن، ‏دفن کردن و از طرف دیگر اثرات زیست محیطی نامطلوب شده است. ‏باگاس نیشکر را می­توان به طیف وسیعی از محصولات از جمله خوراک دام، ‏کاغذ، ‏نئوپان، ‏و غیره ‏تبدیل کرد. ‏در این میان بیواتانول که جزو یکی از محصولات زیستی مهم است را می‌توان از باگاس تولید کرد. ‏از آن‏جایی که قند‏های پنتوز سهم بیشتری از مواد لیگنوسلولزی را تشکیل می­دهند، ‏بنابراین، ایجاد فرآیندی اقتصادی برای تخمیر قندهای پنتوز مورد توجه واقع شده است. ‏مخمر ساکارومایسس سرویزیه[1] که از متداول‌‏ترین میکروارگانیسم‏های صنعتی تولید اتانول است قابلیت مصرف پنتوزها را ندارد، ‏بنابراین، باید از میکروارگانیسمی استفاده کرد که توانایی مصرف قند‏های پنتوز و تبدیل آن‏ها‏ به اتانول را داراست. ‏یکی از میکروارگانیسم‏های شناخته شده ای که قابلیت تبدیل قند‏های پنج کربن را به اتانول دارد مخمر پیکیا استیپیتیس[2] است که بهترین تخمیر کننده قندهای پنتوز به شمار می‏رود (‏3)‏. ‏یکی از ویژگی‏های تخمیر قندهای پنتوز این است که برای تخمیر آن‏ها‏ به هوادهی محدود نیاز است. ‏طی پژوهشی برای بهینه‏سازی مخمر پیکیا استیپیتیس با استفاده از محیط کشت کاملا معین، ‏اوره و اسید‏های آمینه و یون‏های منیزیم و روی و آهن و منگنز، ‏دارای اثر در خور توجهی بر روی تولید اتانول بوده است (‏4). ‏شربت ذرت خیسانده به عنوان یک منبع غنی از ویتامین و اسیدهای آمینه می­تواند جایگزین مناسبی برای عصاره مخمر و پپتون در تولید اتانول با مخمر پیکیا استیپیتیس باشد (‏5)‏. ‏اگرچه تا کنون برای تولید اتانول از قند زایلوز به شکل خالص پژوهش‏های متعددی انجام شده است با این حال برای بهینه‌سازی محیط کشت تولید بیواتانول با استفاده از مخمر پیکیا استیپیتیس و محیط آبکافته باگاس پژوهشی انجام نشده است. ‏در این پژوهش، با استفاده از محیط پیش تیمار شده باگاس نیشکر، ‏که مقدار بیشتری قندهای پنتوز دارد، ‏تولید بیواتانول با مخمر پیکیا استیپیتیس و استفاده از روش تاگوچی بهینه‌سازی شده است.

مواد و روش‏ها

 

پیش تیمار

باگاس نیشکر از شرکت کشت و صنعت کارون، ‏اهواز تهیه، ‏ابتدا آسیاب و با استفاده از غربال‌های با مش 35 تا 80 غربال شد. ‏رطوبت باگاس نیشکر 6 درصد اندازه‌گیری شد. ‏برای پیش تیمار هر بار 30 گرم از باگاس نیشکر در 270 میلی‏لیتر محلول سولفوریک اسید 7/0 درصد ‏(‏درصد حجمی) به مدت نیم ساعت خیسانده شد و سپس با استفاده از رآکتور 1 لیتری که از جنس استیل 316 ساخته شده بود پیش تیمار شد. ‏برای تامین دمای مورد نظر در پیش تیمار از دستگاه اجاق[3] استفاده شد. ‏رآکتور پس از آماده‌سازی درون اجاق با دمای ثابت 180 درجه سانتی‏گراد به مدت 2 ساعت قرار گرفت. ‏پس از طی مدت زمان لازم رآکتور در یک ظرف بزرگ حاوی آب قرار گرفت تا خنک شود. ‏پس از پیش تیمار باگاس، ‏آبکافته[4] با استفاده از کاغذ صافی از جامد جدا شد. ‏تفاله جامد یکبار شستشو و سپس برای استفاده‌های بعدی نمونه‌ها در فریزر منجمد شد. ‏

تخمیر

دو سوش پیکیا استیپیتیس از مرکز کلکسیون قارچ‌ها و باکتری‌های ایران با مشخصه PTCC 5309 و PTCC 5310 به شکل اسلنت روی محیطPDA ‏تهیه شد. ‏آبکافته باگاس نیشکر که مطابق روش فوق به دست آمد، ‏دارای مقدار زیادی قند پنتوز است و به عنوان منبع کربن برای تولید اتانول استفاده شد. ‏منابع نیتروژن و فسفر و یون‏های فلزی هر کدام به شکل محلول‏های جداگانه تهیه و استریل شدند. ‏محلول ویتامین ب کمپلکس حاوی ب 1، ‏ب 2، ‏ب 3، ‏ب 5، ‏ب 6 با درجه خلوص دارویی با غلظت به ترتیب 1، ‏4/0، ‏4، ‏6/0 و 4/0 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر تهیه شد. ‏محلول‌هایی حاوی 200 گرم در لیتر پودر خیسانده شربت ذرت و 160 گرم در لیتر از اوره، ‏دی آمونیوم هیدروژن فسفات، آمونیوم سولفات، 40 گرم در لیتر پتاسیم دی هیدروژن فسفات، ‏منیزیم سولفات، ‏سولفات روی هر کدام به شکل جداگانه و به ترتیب در اتوکلاو و اوره با صافی 45/0 میکرون استریل شدند. ‏برای هر آزمایش مقدار معینی از این محلول­ها به هر ارلن اضافه شد و تخمیر در ارلن‏های 100 میلی‏لیتری در دمای 30 درجه سانتی‏گراد و دور  rpm 100 کشت داده شدند. ‏

 

انتخاب بین دو زیر گونه پیکیا استیپیتیس PTCC 5309 و PTCC 5310

 

برای انتخاب یکی از دو مخمر پیکیا استیپیتیس که در کلکسیون میکروبی وجود داشت چند آزمایش مقدماتی انجام شد. ‏بدین شکل که تولید اتانول بر روی محیط حاوی زایلوز 3 و 6 درصد و محیط آبکافته باگاس انجام شد. ‏محیط کشت دارای شربت ذرت خیسانده 10، ‏آمونیوم سولفات 2/1 و آمونیوم فسفات 6/0 گرم بر لیتر بود. ‏

روش‌های سنجش

 

اندازه‏گیری مقدار قند‏های آزاد شده با روش DNS ‏(‏3 و 5 دی نیتروسالیسیلیک اسید) انجام شد (‏6)‏. ‏مقدار اتانول با روش دی کرومات پتاسیم اندازه‏گیری شد بدین ترتیب که محلول دی کرومات پتاسیم 1/0 مولار در سولفوریک اسید 5 مولار تهیه شد. ‏3/0 میلی‏لیتر نمونه تقطیر شده حاوی اتانول را به 3 میلی‏لیتر معرف اضافه، به مدت 30 دقیقه در دمای 30 درجه گرم خانه‏گذاری و جذب آن در طول موج 590 نانومتر با اسپکتروفتومتر خوانده شد (‏7) ‏. ‏

 

روش طراحی آزمایش‌ها

 برای بهینه‌سازی مقدار اتانول تولیدی، ‏انتخاب عامل‏‏های اثر گذار با استفاده از مرور مقالات و آزمایش‏های مقدماتی بر روی آبکافته انجام شد. ‏از روش تاگوچی و نرم افزار Minitab 16 استفاده شد. ‏در این طراحی آزمایش‏ها هشت عامل‏‏ در 3 سطح با استفاده از آرایه L27 با دو تکرار بررسی شد. ‏هر یک از عامل‏‏ها و سطوح و واحد آن‏ها‏ در جدول 1 آمده است. ‏برای ارزیابی طراحی تاگوچی می‏توان از میانگین تکرار آزمایش‏ها یا از نسبت سیگنال به نویز[5] ‏(‏S/N) استفاده نمود. ‏در آزمایش‏هایی که تکرار شده اند استفاده از تحلیل سیگنال به نویز ‏(‏S/N) نسبت به میانگین داده­ها اولویت دارد (‏8)‏. ‏در طراحی تاگوچی ‏مقدار S/N طبق رابطه زیر برای به‏دست آوردن مقدار بیشینه اتانول استفاده شد:

‏(‏1) ‏        

 

در رابطه بالا S/N نسبت سیگنال به نویز ،Y پاسخ هر آزمایش و n تعداد آزمایش‏ها است. ‏در طراحی تاگوچی نسبت S/N ‏هر چه بیشتر باشد نشان دهنده شرایطی است که در آن عامل‏‏‏های کنترل کننده اثر عامل‏‏های اغتشاشی ‏(‏نویز) را در پاسخ به کم‏ترین مقدار می­رساند (‏8)‏. ‏با توجه به این‏که در طراحی تاگوچی L27 با هشت عامل‏‏ فقط می­توان اثرات متقابل دو عامل‏‏ را در نظر گرفت در این آزمایش‏ها اثرات متقابل CSL با اوره و ویتامین در نظر گرفته شد. ‏

 

جدول 1- فاکتورها و سطوح انتخاب شده برای فاکتور‏ها‏ی مطالعه شده

فاکتورها

اختصار

واحد

سطح 1

سطح 2

سطح 3

دی آمونیوم هیدروژن فسفات

DAHP

گرم در لیتر

0

1

2

آمونیوم سولفات

AS

گرم در لیتر

0

1

2

اوره

Urea

گرم در لیتر

0

1

2

پودر خیسانده شربت ذرت

CSL

گرم در لیتر

0

10

20

سولفات روی

Zn

گرم در لیتر

0

25/0

5/0

سولفات منیزیم

Mg

گرم در لیتر

0

25/0

5/0

پتاسیم دی هیدروژن فسفات

K

گرم در لیتر

0

25/0

5/0

محلول ویتامین

Vitamin

میکرو لیتر در لیتر

0

2

4

 


نتایج

انتخاب سوش برتر

تولید اتانول با استفاده از دو مخمر پیکیا نشان داد که مخمر PTCC 5309 نسبت به مخمر PTCC 5310 در تولید اتانول برتری دارد(‏شکل 1). ‏علاوه براین بازدهی تولید اتانول در مخمر PTCC 5309 نسبت به مخمر PTCC 5310 بالاتر بوده است. ‏

بهینه‏سازی محیط کشت برای مخمر پیکیا PTCC 5309

غلظت نهایی اتانول در هر آزمایش ‏(‏با دو تکرار) به عنوان پاسخ در نظر گرفته شد و در جدول 2 آمده است. ‏نتایج بهینه‏سازی عامل‏‏‏های محیط کشت برای تولید اتانول نشان داد که دی آمونیوم هیدروژن فسفات اثر در خور توجهی بر روی تولید اتانول دارد. ‏دی آمونیوم هیدروژن فسفات به عنوان منبع نیتروژن و نیز منبع فسفر محسوب می‏شود و اثر این عامل‏‏ بر روی تولید اتانول را می‏توان به هر کدام از این دو منبع ارتباط داد. ‏آمونیوم سولفات که به عنوان منبع گوگرد و منبع نیتروژن مطرح است اثر در خور توجهی بر روی تولید اتانول نداشته و در مقادیر صفر، ‏1 و 2 گرم بر لیتر تغییری در تولید اتانول حاصل ایجاد نمی‌کند. ‏

 

 

شکل 1- مقایسه دو سویه از مخمر پیکیا استیپیتیس. (‏چپ: غلظت تولید اتانول، ‏راست: بازدهی تولید اتانول)

 

جدول 2- طراحی آزمایش‏ها و پاسخ مربوطه ‏(‏غلظت نهایی اتانول) ‏

شماره

DAHP

AS

Urea

CSL

Zn

Mg

K

Vitamin

اتانول1 (‏g/L) ‏

1

0

0

0

0

0

0

0

0

38/0±77/0

2

1

1

0

0

025/0

25/0

1

80

12/0±83/1

3

2

2

0

0

05/0

5/0

2

160

14/0±25/2

4

1

1

2

10

0

5/0

0

80

19/0±63/3

5

2

2

2

10

025/0

0

1

160

26/0±21/3

6

0

0

2

10

05/0

25/0

2

0

00/0±6/3

7

2

2

4

20

0

25/0

0

160

1/0±53/3

8

0

0

4

20

025/0

5/0

1

0

02/0±54/3

9

1

1

4

20

05/0

0

2

80

43/0±06/3

10

1

2

2

20

0

0

2

0

14/0±83/3

11

2

0

2

20

025/0

25/0

0

80

26/0±65/3

12

0

1

2

20

05/0

5/0

1

160

24/0±09/3

13

2

0

4

0

0

5/0

2

80

21/0±11/3

14

0

1

4

0

025/0

0

0

160

00/0±34/1

15

1

2

4

0

05/0

25/0

1

0

24/0±45/2

16

0

1

0

10

0

25/0

2

160

19/0±29/3

17

1

2

0

10

025/0

5/0

0

0

02/0±75/3

18

2

0

0

10

05/0

0

1

80

1/0±76/3

19

2

1

4

10

0

0

1

0

00/0±49/3

20

0

2

4

10

025/0

25/0

2

80

00/0±12/3

21

1

0

4

10

05/0

5/0

0

160

07/0±51/3

22

0

2

0

20

0

5/0

1

80

05/0±33/3

23

1

0

0

20

025/0

0

2

160

17/0±41/3

24

2

1

0

20

05/0

25/0

0

0

00/0±5/4

25

1

0

2

0

0

25/0

1

160

43/0±89/2

26

2

1

2

0

025/0

5/0

2

0

00/0±92/2

27

0

2

2

0

05/0

0

0

80

12/0±06/1

 

1) غلظت اتانول بر اساس میانگین دو تکرار ± انحراف معیار نشان داده شده است

 

 

آزمایش‏هایی که با عامل‏‏ اوره در مقادیر صفر، ‏2 و 4 گرم بر لیتر انجام شد، نشان داد که وجود اوره در حد 2 گرم بر لیتر نسبت به نبودن آن تولید اتانول را بهبود می‏بخشد ولی استفاده از 4 گرم بر لیتر اوره تغییر چندانی بر تولید اتانول ندارد. نتایج ‏نشان داد که در شرایط عدم حضور پودر ‏شربت ذرت خیسانده، ‏نسبت S/N 26/5 برای تولید اتانول حاصل شده است. ‏در حالی که در مقدار 10 گرم بر لیتر از این عامل‏‏، ‏نسبت S/N افزایش چشم‏گیری نشان داده و به مقدار 82/10 رسیده و افزایش بیشتر CSL از 10 به 20 گرم بر لیتر تغییر در خور توجهی در نسبت S/N ایجاد نمی‏کند. ‏ نتایج  نشان می‏دهد که از شرایط بدون حضور یون منیزیم تا 25/0 گرم بر لیتر، نسبت S/N از 05/7 تا 84/9 تغییر می‏کند و در مقدار 5/0 گرم در لیتر نسبت S/N به 1/10 می‏رسد. ‏پتاسیم دی هیدروژن فسفات در اینجا به عنوان یک منبع فسفر دیگر بررسی شده است تا بتوان اثر منبع فسفر را به طور جداگانه بررسی کرد. ‏طبق شکل 2، نسبت S/N در غلظت‏های 0، ‏25/0 و 5/0 گرم بر لیتر پتاسیم دی هیدروژن فسفات به ترتیب به54/7، ‏52/9، ‏93/9 گرم بر لیتر می­رسد. ‏افزودن محلول ویتامین که دارای چند نوع ویتامین­های گروه ب بوده، ‏تاثیر در خور توجهی بر نسبت S/N نداشته است. ‏شکل 2 اثر هر یک از عامل‏‏‏ها را بر نسبت S/N نشان می­دهد. ‏جدول 3 تحلیل واریانس را برای این طراحی آزمایش نشان می‏دهد. ‏طبق این جدول دی آمونیوم هیدروژن فسفات، ‏پودر شربت ذرت خیسانده، ‏منیزیم فسفات و ‏پتاسیم‏دی‏هیدروژن فسفات جزو عامل‏‏‏های مهم تاثیر‏گذار  (05/0 p <) هستند. ‏

 

جدول 3- تحلیل واریانس برای عامل‏‏های انتخابی

P

F

درجه آزادی

عامل‏‏

020/0

49/48

2

DAHP

812/0

23/0

2

AS

232/0

31/3

2

Urea

007/0

06/142

2

CSL

962/0

04/0

2

Zn

025/0

71/38

2

Mg

043/0

03/22

2

K

705/0

42/0

2

Vitamin

100/0

29/9

4

Urea×CSL

228/0

61/3

4

CSL×Vitamin

 

 

2

Residual Error

 

 

26

Total

 

 

 

شکل 2- اثرات اصلی هر عامل‏‏ با استفاده از بررسی سیگنال به نویز ‏(‏S/N) ‏

 

جدول 4-تایید شرایط بهینه برای تولید اتانول با مخمر PTCC 5309

 مقدار واقعی الکل ‏(‏g/L) ‏

مقدار پیش بینی شده الکل ‏(‏g/L) ‏

Vitamin

K

Mg

Zn

CSL

Urea

AS

DAHP

04/6

3/5

0

5/0

5/0

0

10

2

0

2


تایید شرایط بهینه

بررسی شرایط بهینه تولید اتانول نشان می­دهد که تولید اتانول پس از 48 ساعت به 6 گرم بر لیتر رسید. ‏مقدار اتانول تولیدی ‏با مقدار پیش بینی شده در جدول 4 آمده است. ‏

تولید اتانول در شرایط بهینه

تولید اتانول طی 48 ساعت بر حسب زمان در شکل 3 آمده است. ‏همان‏طور که شکل  نشان می­دهد، ‏تعداد سلول‏ها در فلاسک‏های صد میلی‏لیتری با حجم محیط 40 میلی‏لیتر پس از طی 48 ساعت از ‏107×8/5 در هر میلی‏لیتر، به 108×6/5 در هر میلی‏لیتر رسیده است. میزان ‏قند اولیه نیز که 8/26 گرم بر لیتر بوده پس از 48 ساعت به 5/3 گرم بر لیتر رسیده است و ‏در این‏حال، میزان اتانل پس از 48 ساعت به بیش از 04/6 گرم بر لیتر بالغ شده است.

 

 

 

شکل 3- تولید اتانول در شرایط بهینه

 

 

 

بحث و نتیجه­گیری

نتایج نشان داد بین دو سوش آزمایش شده پیکیا‏استیپیتیس، ‏سوش PTCC 5309 تولید اتانول بیشتری داشته است. ‏مطالعات گذشته نیز برای تولید اتانول در محیط زایلوز 2 درصد با این دو مخمر نتیجه مشابهی داشته است و مخمر ‏(‏CBS 5773(PTCC 5309 نسبت به مخمر ‏(‏CBS 5776(PTCC 5310 تولید اتانول بیشتری داشته است (‏9). ‏

بهینه‏سازی محیط کشت

محیط کشت بر روی حالت فیزیولوژی و زیستی مولکولی مخمر تاثیر می­گذارد و می­تواند در نهایت باعث تاثیر بر روی عملکرد و بازدهی میکروارگانیسم‏ها شود. ‏مخمرها به ترکیبات نیتروژن دار با وزن مولکولی پایین مثل یون غیر آلی آمونیم، ‏اوره، ‏آمینواسیدها و پپتیدها نیاز دارند (‏10). ‏معمولا نیتروژن به شکل یون آمونیم و با اضافه کردن اوره، ‏نمک فسفات و سولفات برای مخمر فراهم می‏شود. ‏اوره توسط مخمر شکسته شده تا دو مولکول آمونیاک و یک مولکول دی اکسید کربن تولید کند. ‏در تحقیقات انجام شده در مقیاس آزمایشگاهی معمولا از عصاره مخمر و پپتون استفاده شده است. ‏با این حال این مواد برای استفاده در تخمیر‏های صنعتی صرفه اقتصادی ندارد. ‏بنابراین نیاز است از ترکیبات ارزان استفاده کرد که نیاز‏های تغذیه‏ای مخمر را مرتفع کند. ‏پژوهش‏های دیگر نشان داده است که با استفاده از CSL در مقایسه با محیط کشت‏هایی که دارای عصاره مخمر و پپتون بوده اند اتانول بیشتری تولید شده است (‏5). ‏نتایج بهینه‏سازی محیط کشت از روش تاگوچی نشان می­دهد که CSL در تولید اتانول دارای اثر در خور توجهی بوده است. ‏CSL که محصول جانبی کارخانه‏های تولید نشاسته از ذرت است منبع ارزانی است که دارای پروتئین، ‏اسید‏های آمینه مختلف و ترکیبات معدنی و ویتامین و عناصر فلزی کم مقدار است که می­توان آن را جایگزین عصاره مخمر و پپتون نمود (‏10). ‏اثر یون‏های فلزی بر روی رشد و تخمیر مخمر اثبات شده است. ‏طبق مطالعات انجام شده منیزیم، ‏روی ‏و کلسیم بر سرعت مصرف قند تاثیرگذار بوده و به علاوه این فلزات به عنوان کوفاکتور‏های مورد نیاز در چرخه‏های متابولیکی مطرح هستند (‏11)‏. ‏اثر یون منیزیم و کلسیم برای افزایش تحمل مخمر برای اتانول گزارش شده است. ‏ساز و کار اثر یون منیزیم در حفاظت مخمر با کاهش تراوایی پذیری غشای سلول تحت تاثیر اتانول انجام می­گیرد (‏12). ‏طبق شکل 3 تولید اتانول با تغییر مقدار روی یا مقدار ویتامین تغییر چندانی نداشته است. ‏دلیل این عدم تاثیر را می­توان این گونه توجیه کرد که چون شربت ذرت خیسانده ‏(‏CSL) خود دارای مقدار کافی یون روی و همچنین، مقدار کافی از انواع مختلف ویتامین‏ها است این عامل‏‏ در تولید اتانول تاثیر ندارد. ‏

در شرایطی که هر یک از عامل‏‏‏های مورد بررسی در مقدار مناسب خود قرار داشتند تولید اتانول طی 48 ساعت بررسی شد و نتیجه نشان می­دهد که تولید اتانول نسبت به بیش‏ترین مقدار مشاهده شده ‏(‏4/5 گرم در لیتر) در طراحی آزمایش‏ها ‏بالاتر بوده است. ‏مطالعات دیگر نشان می­دهد که تولید اتانول با استفاده از باگاس نیشکر و بدون سم زدایی پس از 120 ساعت به9/4 گرم بر لیتر رسیده است بازده تخمیر در این حالت 2/0 بوده است. ‏با سم زدایی با زغال فعال اتانول تولیدی 1/6 و با سم‏زدایی با رزین تبادل یونی 5/7 گرم بر لیتر بوده و بازده تولید 3/0 و مدت زمان تخمیر 48 ساعت بوده است (‏13)‏. ‏همچنین، تحقیق دیگری برای تولید اتانول از باگاس نیشکر نشان داده است که تخمیر آبکافته باگاس نیشکر که با استفاده از زغال فعال تیمار شده است با مقدار قند اولیه 68 گرم در لیتر موجب تولید 24 گرم در لیتر اتانول و بازده 35/0 شده است (‏14)‏. ‏اگر چه در این تحقیقات سم زدایی آبکافته باعث بهبود تولید اتانول شده است اما باید توجه داشت سم زدایی مشکلات فرآیندی متعددی دارد و هزینه‏های بسیار زیادی بر فرآیند تولید اتانول تحمیل می­کند و از همه مهم‏تر سم زدایی باعث افت مقدار قند‏ها می‏شود (‏15). ‏بنابراین، استفاده از محیط بهینه شده ای که در آن تولید اتانول بیشتر و بدون سم زدایی به دست آید بسیار مطلوب‏تر است. ‏

استفاده از محیط شربت ذرت خیسانده برای تولید اتانول نه تنها به عنوان یک منبع ارزان قیمت می‏تواند استفاده شود بلکه از آنجایی که محیطی بسیار غنی است می‏تواند با عصاره مخمر و پپتون در فرآیند تولید اتانول رقابت کند. ‏نتایج حاصل نشان می‌دهد که با بهینه‏سازی محیط کشت مقدار اتانول بدون سم زدایی نسبت به مطالعات مشابه از مقدار بالا‏تری برخوردار بوده و حتی با نتایج مطالعات دیگر که از تخمیر محیط سم زدایی شده به‏دست آمده قابل رقابت است



[1] Saccharomyces cerevisiae

[2] Pichia stipitis

[3] Oven

[4] Hydrolysate

[5] Signal-to-noise

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Reference

(1) Pandey A. Handbook of plant-based biofuels. Boca Raton: CRC Press; 2009.

(2) Najafi G, Ghobadian B, Tavakoli T, Yusaf T. Potential of bioethanol production from agricultural wastes in Iran. Renew Sust Energ Rev. 2009; 13(6-7):1418-27.

(3) Unrean P, Nguyen NA. Optimized Fed-Batch Fermentation of Scheffersomyces stipitis for Efficient Production of Ethanol from Hexoses and Pentoses. Appl Biochem Biotechnol. 2013; 169(6): 1895-909.

(4) Slininger PJ, Dien BS, Gorsich SW, Liu ZL. Nitrogen source and mineral optimization enhance D -xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Appl Microbiol Biotechnol. 2006;72(6):1285-96.

(5) Amartey S, Jeffries TW. Comparison of corn steep liquor with other nutrients in the fermentation of D-xylose by Pichia stipitis CBS 6054. Biotechnol Lett. 1994; 16(2): 211-4.

(6) Miller GL. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal Chem. 1959; 31(3): 426-8.

(7) Manivannan A, Jayarani PH, Narendhirakannan R. Enhanced acid hydrolysis for bioethanol production from water hyacinth (Eichhornia crassipes) using fermentating yeast Candida intermedia NRRL Y-981. J Sci Ind Res. 2012; 71: 51-6.

(8) Roy R. A primer on the Taguchi method. New York: Van Nostrand Reinhold; 1990.

(9) Toivola A, Yarrow D, Van Den Bosch E, Van Dijken JP, Scheffers WA. Alcoholic fermentation of D-xylose by yeasts. Appl Environ Microbiol. 1984;47(6):1221-3.

(10)            Jacques KA, Lyons TP, Kelsall DR. The alcohol textbook : a reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries. 3rd ed. Nottingham: Nottingham University Press; 1999.

(11)            Pereira FB, Guimarães PM, Teixeira JA, Domingues L. Optimization of low-cost medium for very high gravity ethanol fermentations by Saccharomyces cerevisiae using statistical experimental designs. Bioresour Technol. 2010; 101(20): 7856-63.

(12)            Hu C-K, Bai F-W, An L-J. Enhancing ethanol tolerance of a self-flocculating fusant of Schizosaccharomyces pombe and Saccharomyces cerevisiae by Mg2+ via reduction in plasma membrane permeability. Biotechnol Lett. 2003; 25(14): 1191-4.

(13)            Canilha L, Carvalho W, de Almeida Felipe MG, de Almeida e Silva JB, Giulietti M. Ethanol production from sugarcane bagasse hydrolysate using Pichia stipitis. Appl Biochem Biotechnol. 2010; 161(1): 84-92.

(14)            Roberto IC, Lacis LS, Barbosa MFS, de Mancilha IM. Utilization of sugar cane bagasse hemicellulosic hydrolysate by Pichia stipitis for the production of ethanol. Process Biochem. 1991; 26(1): 15-21.

(15)            Avci A, Saha BC, Kennedy GJ, Cotta MA. Dilute sulfuric acid pretreatment of corn stover for enzymatic hydrolysis and efficient ethanol production by recombinant Escherichia coli FBR5 without detoxification. Bioresour Technol. 2013; 142: 312-9.