کلونینگ و بیان ژن کد‏کننده آنزیم لاکاز از باکتری باسیلوس پومیلوس سویه GAZ23

نویسندگان

1 کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران

2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران

3 استاد بیوشیمی، دانشگاه تربیت مدرس، ایران

چکیده

  مقدمه: لاکازها (بنزن دیول اکسیژن اکسیدو ردوکتاز EC 1. 10. 3. 2 ) یکی از اعضا ی خانواده مالتی کوپر اکسیدازها هستند که اکسیداسیون طیف گسترده ای از ترکیبات فنولی را با استفاده از اکسیژن مولکولی کاتالیز می‌کنند.   مواد و روش ‏‏ ها : ژن کد‏کننده آنزیم لاکاز از سویه GAZ23 به‏وسیله پرایمرهای کلونینگ اختصاصی ژن تکثیرشد. محصول PCR در ناقل بیانی ( pET21a ) کلون به باکتری اشریشیا­کلی سویه BL21(DE3) انتقال یافت و تحلیل توالی انجام شد. بیان آنزیم با استفاده از سوبسترای معمول لاکاز ABTS سنجیده شد.   نتایج: توالی ژن S rDNA 16 سویه بومی GAZ23 که از خاک‏های ایران جدا شده است دارای 100 درصد شباهت به باکتری باسیلوس پومیلوس بود. ژن لاکاز در سویه GAZ23 دارای 1533 نوکلئوتید است که 510 آمینواسید را کد می‏کند.   بحث و نتیجه ‏ گیری: ژن لاکاز سویه GAZ23 دارای 67 درصد شباهت آمینواسیدی به پروتئین CotA باکتری باسیلوس سوبتیلیس است. به منظور به دست آوردن مقادیر بالای پروتئین محلول، بیان، تحت شرایط میکروآئروبیک و در دمای پایین انجام شد. 4 دمین غنی از هیستیدین متصل شونده به مس در توالی آمینواسیدی این پروتئین وجود دارد .

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Cloning and Expression of Laccase Enzyme from B. pumilus strain GAZ23

نویسندگان [English]

  • parvin zamani 1
  • mohammad ali amoozegar 2
  • khosro Khajeh 3
1 MSc of Microbiology, University of Tehran, Iran
2 Associate Professor of Microbiology, University of Tehran, Iran
3 Professor of Biochemistry, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
چکیده [English]

  Introduction : : Laccases (benzene diol oxygen oxidoreductase: EC 1.10.3.2 are one of the multicopper oxidase family members that catalyze the oxidation of various phenolic compounds by using molecular oxygen   Materials and methods Laccase gene was from strain GAZ23 amplified by cloning primers. PCR product cloned in the expression vector (pET21a) and transferred to BL21 strain of E. coli and sequence analysis were carried out. Biochemical properties were investigated using common laccase substrates, 2,2ˊ-azino-bis(3-ethylbenzothioazolin-6-sulphonicacid ) ABTS) .   Results : 16S rRNA gene of strain GAZ23 isolated from Iran soils, showed high similarity to Bacillus pumilus (100%). The gene of the GAZ23 has an open reading frame composed of 1533 bases, which encode 510 amino acid residues .   Discussion and conclusion : The laccase gene from GAZ23 shows 67% similarity with CotA from B. subtilis. The expression was performed under microaerobic condition and decreased temperature in order to obtain high amounts of soluble protein. This protein contains four histidine rich copper-binding domains.

کلیدواژه‌ها [English]

  • laccase
  • CotA protein
  • B. pumilus
  • Gene expression

مقدمه

لاکازها (بنزن‌دیول‌اکسیژن‌اکسیدو‌ردوکتاز EC1. 10. 3. 2)، آنزیم‌های چند مسی از خانواده اکسیدازهای آبی‏اند. اکسیداسیون طیف گسترده­ای از ترکیبات فنولی را با استفاده از اکسیژن مولکولی به عنوان پذیرنده نهایی الکترون کاتالیز و آب را به عنوان تنها محصول جانبی تولید می­کنند (1).

 این آنزیم­ها دارای 4 دمین غنی از هیستیدین هستند که به مس اتصال دارند. اتم‏های مس کوئوردینه شده در پروتئین­ها در سه نوع T1، T2و T3 دسته بندی می­شوند که از لحاظ خصوصیات اسپکتروسکوپی متفاوت­اند. مس نوع یک (T1) مرکز تک هسته­ای را تشکیل می‏دهد و در اکسیداسیون سوبسترا نقش دارد در حالی که مس T2 با یک اتم مس به همراه مس T3 با دو اتم مس، مرکز سه هسته­ای را تشکیل می­دهند و با انتقال الکترون‏ها به اکسیژن باعث تشکیل آب می­شوند (2). این آنزیم‏ها در گیاهان، قارچ‌ها و در بعضی از باکتری‌ها و حشرات یافت می‌شوند (3). در گیاهان این آنزیم­ها در بیوسنتز لیگنین شرکت می­کنند (4) و در قارچ­ها در تجزیه لیگنین، تشکیل پیگمان، سم زدایی و بیماری‏زایی گیاهان دخالت دارند (5). با توجه به این که لاکازها سوبستراهای زیادی دارند و واکنش‏های شیمیایی مختلفی مانند تخریب پلیمرها، تشکیل مونومرها، شکستن ترکیبات حلقوی و اکسیداسیون ترکیبات آروماتیک را کاتالیز می‏کنند،کاربردهای زیادی در صنایع بیوتکنولوژیکی دارند (6). به عنوان مثال در صنایع کاغذسازی و صنایع نساجی برای سم زدایی و حذف رنگ از فاضلاب‏ها به کار می‏روند (6 و 7). لاکازها همچنین در صنایع غذایی برای پایدار­سازی و بهینه­سازی کیفیت نوشیدنی‌های مختلف و اکسیژن زدایی محصولات فاسد شدنی حاوی روغن‌‌های گیاهی کاربرد دارند (8 و 9).

اولین لاکازهای پروکاریوتی گزارش شده مربوط به باکتری آزواسپریلوم لیپوفروم[1] است. این آنزیم تولید پیگمان و مصرف ترکیبات فنولی گیاه و انتقال الکترون‌ها را بر عهده دارد (10). مهم­ترین لاکاز باکتریایی که تا کنون به خوبی بررسی شده و خصوصیات فیزیکی و بیوشیمیایی آن تعیین شده پروتئین CotA باکتری باسیلوس سوبتیلیس[2] است. CotA پروتئین kDa65 به پوشش خارجی اسپور متعلق است. این پروتئین در بیوسنتز پیگمان قهوه‌ای اسپور که یک محصول شبه ملانین است، شرکت می‌کند و به نظر می‌رسد که مسئول محافظت در برابر نور UV و پراکسید هیدروژن باشد. این پروتئین شباهت‌هایی را با اکسیداز‌های چند مسی نشان می‌دهد و پایداری دمایی بالایی دارد (11). لاکازهای دیگری از سویه­های اشریشیا کلی[3](12)، باسیلوس هالودورانس[4](13) و باسیلوس لیکنیفورمیس[5](14)، جدا شده است. اکثر لاکاز‌هایی که تا کنون شناسایی شده‌ و دارای کاربردهای بیوتکنولوژیکی هستند از قارچ­ها جداشده­اند (15). با این حال بیان کارا و مؤثر لاکازهای نوترکیب قارچی، که بیشتر برای کاربردهای بیوتکنولوژیکی ضروری است، نسبت به بیان آنزیم­های باکتریایی سخت‏تر است. از مشکلات و موانع استفاده از این دسته از آنزیم­ها می‏توان به اطلاعات توالی‏هایی که دست‏یابی به آن‏ها‏ امکان پذیر نیست، وجود ساختار اگزون و اینترون در ژن­های یوکاریوتی، تغییرات پس از ترجمه، تشکیل پل­های دی­سولفیدی، زمان تخمیر طولانی و بازده کم آن­ها اشاره کرد. با وجود کاربردهای صنعتی باکتری‏ها، تا کنون توجه کمی به لاکازهای باکتریایی شده است. بررسی­های انجام شده در تجزیه و تحلیل ژنوم مشخص کرده که این آنزیم­ها در باکتری‏ها به طور گسترده‏ای توزیع شده‏اند (16). توسعه لاکازهای باکتریایی برای کاربردهای بیوتکنولوژیکی دارای مزایایی است زیرا پایداری دمایی بالایی دارند و در مدت زمان کوتاهی در محیط‌های ارزان تولید می­شوند.

هدف این پژوهش، جداسازی و بیان ژن کد کننده آنزیم لاکاز از سویه GAZ23است که شباهت زیادی به پروتئین CotA سویه باسیلوس سوبتیلیس-که یک پروتئین مقاوم به دما است- دارد.

 

مواد و روش‏ها

مواد

ایزوپروپیلβ-D-1-­ تیوگالاکتوپیرانوزید IPTG)[6])، آنزیم‏های محدود کننده XhoI و NdeI از شرکت فرمنتاز[7] (آلمان) و [8]ABTS از شرکت سیگما-آلدریچ[9] (آمریکا) و سایر مواد از شرکت مرک[10] (آلمان) خریداری شد.

سویه‏ها و محیط کشت

سویه بومی GAZ23 از خاک‏های کشاورزی منطقه فیروز کوه در ایران جدا شده است. باکتری اشریشیلا‏کلی سویهXL1-Blue به عنوان میزبان کلونینگ و باکتری اشریشیلا کلی سویه
 BL21(DE3) Eبه عنوان سویه بیانی استفاده شد.

 بر اساس آزمون‏های میکروسکوپی و فیزیولوژیک، شناسایی اولیه سویه انجام شد (17). رنگ آمیزی گرم بر اساس روش هوکر[11] انجام شد، و شکل میکروسکوپی سویه توسط میکروسکوپ نوری و عدسی چشمی 100 مشاهده شد. برای بررسی فعالیت کاتالازی از کشت 24 ساعته سویه و پراکسید هیدروژن 3 درصد به عنوان معرف استفاده و تولید حباب به عنوان واکنش مثبت در نظر گرفته شد. برای مشاهده اسپور باکتری از محیط اسپورزایی آگاردار استفاده شد، به علاوه برای تأمین رشد و کاهش میزان آلودگی، کلرید سدیم به میزان 3 درصد ‏به حجم محیط اضافه شد (18). ابتدا باکتری در محیط تولید اسپور کشت داده، و پس از 4 روز، رنگ آمیزی اندوسپورها با رنگ فوشین بازی بر اساس روش شافر و فلتون[12] انجام شد (17).

شناسایی تکمیلی سویه منتخب با تکثیر و تعیین توالی ژن S rDNA16 انجام شد. برای این منظورDNA ژنومی سویه GAZ23 استخراج شد (19) و به عنوان الگو برای انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از پرایمرهای جهانی 27F: agagtttgatcmtggctca و 1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT استفاده شد (20).

تکثیر ژن S rDNA16 با استفاده از واکنش زنجیره‏ای پلیمراز، بافر با غلظت X1 در ترکیب نهایی، MgCl2 با غلظت نهایی 5/2 تا 5/0 میلی‏مول، dNTP با غلظت 4/0 میلی‏مول، آنزیم Taq DNA پلیمراز به میزان 50U/2 میکرولیتر و پرایمرهای رفت و برگشت از هر کدام به میزان 5/0 تا 4/0 میلی‏مول و DNA الگو به میزان مناسب استفاده شد. در انجام واکنش زنجیره‏ای پلیمراز از نمونه با شرایط مشابه با سایر نمونه‏ها که در آن به جای DNA الگو از آب مقطر استفاده شده بود، به عنوان شاهد منفی استفاده شد.

واکنش واسرشت سازی اولیه با دمای 95 درجه سانتی‏گراد به مدت 5 دقیقه و 30 چرخه تکرار شونده شامل: واسرشت سازی با دمای 94 درجه سانتی‏گراد به مدت یک دقیقه، اتصال پرایمرها در 57 درجه سانتی‏گراد به مدت یک دقیقه، گسترش در 72 درجه سانتی‏گراد به مدت یک دقیقه و پس از اتمام 30 چرخه برای گسترش نهایی در 72 درجه سانتی­گراد به مدت 7 دقیقه انجام شد. محصول نهایی حاصل از واکنش تعیین توالی شد (شرکت ماکروژن کره جنوبی)[13].

کلونینگ ژن مورد نظر

با توجه به این‏که مهم‌ترین آنزیم لاکازی که تا کنون شناسایی و ویژگی‏های بیوشیمیایی و خصوصیات ساختاری آن به خوبی تعیین شده است به پروتئین CotA اسپور باکتری باسیلوس سوبتیلیس مربوط است، توالی آمینواسیدی و نوکلئوتیدی CotA باکتریباسیلوس سوبتیلیسبا کد دسترسی NP_388511 به عنوان الگوی جستجو در بانک اطلاعات ژنی[14] استفاده شد تا لاکازهای باکتریایی شناسایی نشده از این طریق شناسایی شوند.

واکنش زنجیره­ای پلی­مراز برای ژن مورد نظر با استفاده از پرایمر رفت با توالی:

5ˊATACATATGAACCTA

GAAAAATTTGTTGACG 3ˊ

 

دارای جایگاه برش آنزیم NdeI در طرف ˊ5 و پرایمر برگشت با توالی:

5ˊGTGCTCGAGTTACTGG

ATGATATCCATCGGCC 3ˊ

 

دارای جایگاه برش آنزیم XhoI در طرف ˊ5 انجام شد. DNA ژنومی استخراج شده از سویه GAZ23 به عنوان الگو استفاده شد. ژن مورد نظر با استفاده از پرایمرهای طراحی شده با واکنش زنجیره‏ای پلی‏مراز تکثیر شد. تکثیر ژن مورد نظر با واکنش زنجیره‏ای پلیمراز بافر با غلظت x1 در ترکیب نهایی، MgCl2 با غلظت نهایی 5/2 میلی‏مول، dNTP با غلظت 4/0 میلی‏مول از هر کدام، آنزیم Taq DNA پلیمراز 50U/2 میکرولیتر و پرایمرهای رفت و برگشت از هر کدام 8/0 تا 1 میلی‏مول و DNA الگو به میزان مناسب استفاده شد. در انجام واکنش زنجیره‏ای پلیمراز از نمونه با شرایط مشابه با سایر نمونه­ها که در آن به جای DNA الگو از آب مقطر تزریقی استفاده شده بود، به عنوان شاهد منفی استفاده شد. برای انجام واکنش زنجیره‏ای پلیمراز از واسرشت سازی اولیه با دمای 95 درجه سانتی‏گراد به مدت 5 دقیقه و 30 چرخه تکرار شونده شامل: واسرشت سازی با دمای 94 درجه سانتی‏گراد، اتصال با دمای بین 55 تا60 درجه سانتی‏گراد هر کدام به مدت 60 ثانیه و سنتز با دمای 72 درجه سانتی‏گراد به مدت 60 ثانیه و پس از اتمام 30 چرخه برای سنتز نهایی دمای 72 درجه سانتی‏گراد برای مدت 15 دقیقه در نظر گرفته شد. محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با کیت خالص سازی محصول PCR (Bioneer) خالص شد.

محصول PCR خالص شده و پلاسمید بیانی pET21a(+) توسط آنزیم‏های محدود کننده NdeI و XhoI به شکل جداگانه هضم آنزیمی شدند. محصولات هضم شده توسط کیت خالص سازی محصول PCR (Bioneer) خالص شد و سپس قطعات ژنی و پلاسمید هضم شده با غلظت‏های مناسب توسط آنزیم لیگاز به هم اتصال یافتند. باکتری اشریشیاکلی سویهXL1-Blue به عنوان میزبان کلونینگ استفاده شد. پلاسمید حاصل از اتصال قطعات وکتور بیانی و ژن در سویه XL1-Blue ترانسفورم شد و سپس، بر روی محیط LB جامد دارای آمپی‌سیلین کشت داده شدند. کلونی‏های مثبت دارای پلاسمید نوترکیب انتخاب و صحت حضور پلاسمید مورد نظر در این سویه با روش هضم دوگانه با آنزیم‏های محدود کننده و روش کلونی PCR تایید شد. پلاسمید نوترکیب pET21a از این سویه با استفاده از کیت استخراج پلاسمید، استخراج و برای اطمینان از صحت توالی مورد نظر با استفاده از پرایمرهای T7 promoter وT7 terminator تعیین توالی شد.

بیان ژن

پس از اطمینان از صحت توالی مورد نظر، پلاسمید نوترکیب pET21a در باکتری اشریشیاکلی سویه BL21(DE3) ترانسفورم و سپس بر روی محیط LB دارای آمپی‌سیلین کشت داده شد. یکی از کلونی‏های BL21 مثبت دارای پلاسمید نوترکیب pET21a که بر روی محیط LB جامد دارای آمپی‌سیلین رشد کرده بود به محیط LB حاوی آمپی‌سیلین به عنوان پیش کشت تلقیح شد و در شیکر انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‏گراد با دور 220 rpm به مدت 12 ساعت گرما‏گذاری شد. پس از این زمان، از محیط پیش کشت به محیط TB حاوی آمپی‏سیلین تلقیح و در دمای 30 درجه سانتی‏گراد با شیک 180 دور در دقیقه قرار داده شد تا به
OD 6/0-5/0 برسد. پس از این زمان IPTG با غلظت نهایی 1/0 میلی‏مولار و CuSO4 با غلظت نهایی 2 میلی‏مولار به عنوان القا کننده به محیط افزوده شد. به طور هم‏زمان به عنوان نمونه شاهد، محیط کشتی با شرایط مشابه با شرایط قبل از همان کلونی مثبت تهیه شد. اما پس از رسیدن به OD القا نشد. و یک کلونی از سلول‏های BL21 فاقد پلاسمید نوترکیب با شرایط یکسان با کلونی مثبت حاوی پلاسمید نوترکیب، نیز به عنوان نمونه شاهد منفی به طور هم‏زمان کشت داده شد. سپس، محیط‏های کشت القا شده و القا نشده (حاوی کلونی‏هایی با پلاسمیدهای نوترکیب و غیر نوترکیب) به مدت 4 ساعت در دمای 18 درجه سانتی‏گراد با 140 دور در دقیقه قرار داده شد. پس از آن به مدت 20 ساعت بدون دور در دمای 180 درجه سانتی‏گراد گرما گذاری شد. همچنین، نمونه‏های تهیه شده پس از القا شدن به مدت 24 ساعت در دمای 18 درجه سانتی‏گراد با 140 دور در دقیقه (شرایط هوازی) قرار گرفتند.

از آن‏جایی که پروتئین‏های بیان شده در داخل سلول مجتمع می‏شوند، سلول‏ها پس از 20 ساعت گرما‏گذاری، با سانتریفیوژ در g4000 به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد جمع‏آوری شدند. رسوب به دست آمده در بافر فسفات 50 میلی‏مولار با اسیدیته6/7 حاوی مهار کننده پروتئاز PMSF[15] یک میلی‏مولار حل و سپس، بر روی یخ سونیکیت شد. بقایای سلول‏های شکسته شده با سانتریفیوژ با دور 13000 به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد رسوب داده شدند. محلول رویی در 70 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه گرما گذاری و سپس، برای حذف پروتئین­های دناتوره شده در
 13000 به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد سانتریفیوژ شد. عصاره سلولی به دست آمده برای هر دو نمونه کنترل و آزمون، (به منظور سنجش بیان آنزیم و ارزیابی میزان فعالیت آنزیم بیان شده) سنجش آنزیمی شد.

سنجش بیان آنزیمی

فعالیت آنزیمی در دمای اتاق در حضور سوبسترای معمول این آنزیم ABTS سنجیده شد. اکسیداسیون (ABTS) 2 میلی‏مولار در بافر فسفات 100 میلی‏مولار با اسیدیته 4 توسط افزایش جذب در طول موج 420 نانومتر به مدت 5 دقیقه اندازه گیری شد.

نتایج

جستجوی پروتئینی برای لاکازهای باکتریایی شناسایی نشده با استفاده از توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی پروتئین Cot A باکتری باسیلوس سوبتیلیس به عنوان الگو انجام شد. همولوگ‏های متعددی از این پروتئین در توالی کامل ژنوم باکتری باسیلوس پومیلوس شناسایی شد. در نتیجه ژن cotA باکتری باسیلوس پومیلوس برای کلونینگ و بیان ژن cotA در باکتری اشریشیاکلی انتخاب شد.

 شناسایی سویه

نتایج بررسی صفات اولیه در سویه GAZ23 نشان داد که این سویه، سویه­ای گرم مثبت، دارای اندوسپور و
 کاتالاز مثبت است. نتایج حاصل از تعیین توالی ژن
 S rDNA16 با استفاده از نرم افزار Chromas Pro ویرایش شد و با استفاده از ابزار BLAST در دو بانک اطلاعاتی NCBI و پایگاه اطلاعاتی EzTaxon-e server[16] بررسی شد. سویه GAZ23 از نظر میزان شباهت در توالی ژن S rDNA16 بررسی شد و درخت فیلوژنتیک این سویه­ با الگوریتم Neighbor joining  (21) و ضریب Boot Strap 1000 (22) و با نرم افزار مگا 5 (ویرایش پنجم)[17] (23) رسم شد. بررسی توالی ژن S rDNA16 سویه GAZ23 نشان داد که این سویه دارای 100 درصد شباهت به باکتری باسیلوس پومیلوس سویه  ATCC 7061Tاست (شکل 1).

 

 

 

 Bacillus licheniformis ATCC 14580(T) (AE017333)

 

 Bacillus aerius 24K(T) (AJ831843)

 

 Bacillus sonorensis NRRL B-23154(T) (AF302118)

 

 Bacillus atrophaeus JCM 9070(T) (AB021181)

 

 Bacillus mojavensis RO-H-1(T) (JH600280)

 

 Bacillus siamensis KCTC 13613(T) (AJVF01000043)

 

 Bacillus altitudinis 41KF2b(T) (AJ831842)

 

 Bacillus aerophilus 28K(T) (AJ831844)

 

 Bacillus safensis FO-036b(T) (AF234854)

 

 Bacillus pumilus ATCC 7061(T) (ABRX01000007)

 

Strain GAZ23

 

 Bacillus aquimaris TF-12(T) (AF483625)

 

 Bacillus panaciterrae Gsoil 1517(T) (AB245380)

 

 Bacillus funiculus NAF001(T) (AB049195)

 

 Bacillus acidiceler CBD 119(T) (DQ374637)

 

 Bacillus galliciensis BFLP-1(T) (FM162181)

 

 Bacillus herbersteinensis D-1-5a(T) (AJ781029)

 

 Bacillus alkalitelluris BA288(T) (AY829448)

 

 Bacillus ginsengihumi Gsoil 114(T) (AB245378)

 

 Bacillus acidicola 105-2(T) (AF547209)

 

 Bacillus shackletonii LMG 18435(T) (AJ250318)

 

 Virgibacillus dokdonensis DSW-10(T) (AY822043)

 

 Virgibacillus soli CC-YMP-6(T) (EU213011)

 

100

 

73

 

86

 

68

 

63

 

90

 

72

 

60

 

33

 

36

 

77

 

99

 

84

 

39

 

82

 

100

 

72

 

99

 

54

 

61

 

0. 005

شکل 1- درخت فیلوژنتیک سویهGAZ23 با روش Neighbor-joining و با استفاده از معیار Boot strap 1000


تکثیر اختصاصی ژن لاکاز

ژن لاکاز در سویه GAZ23 با استفاده از پرایمرهای طراحی شده اختصاصی ژن تکثیر شد. شکل 2 تصویر ژل محصول PCR ژن مورد نظر را نشان می‏دهد.

M 1

شکل 2- تصویر ژل محصول PCR. 1 باند ژن مورد نظر سویه‌ GAZ23 با پرایمرهای دارای جایگاه برش. M) شاخص وزنی (فرمنتاز SM0331)

 

پس از تایید کلون شدن ژن مورد نظر در وکتور pET21a(+)، پلاسمیدهای نوترکیب تخلیص شد و با استفاده از پرایمرهای T7 promoter و T7 terminator تعیین توالی شد. نتیجه تعیین توالی ژن بررسی شد. توالی نوکلئوتیدی در پروتال منابع بیوانفورماتیک[18] به توالی آمینواسیدی تبدیل شد و مشخص شد توالی بدون جهش بود.

بیان آنزیم لاکاز

فعالیت آنزیمی لاکاز در دمای اتاق در حضور سوبسترای معمول این آنزیم ABTS انجام شد. سنجش فعالیت آنزیمی شامل: اکسیداسیون (ABTS) 2 میلی‏مولار در بافر فسفات 100 میلی‏مولار با اسیدیته 4 با افزایش جذب در 420 نانومتر انجام شد (ε=36000M-1cm-1).
از بین کلونی­های بررسی شده تنها عصاره سلولی کلونی دارای پلاسمید نوترکیب pET21a که تحت شرایط القا با IPTG و CuSO4 قرار گرفته بود فعالیت آنزیمی نشان داد. همچنین، در اثر اکسیداسیون ABTS با آنزیم لاکاز در مخلوط واکنش رنگ سبز ایجاد شد، که نشانگر حضور آنزیم لاکاز در مخلوط واکنش بود. اما برای عصاره­های سلولی کلونی دارای پلاسمید نوترکیب بدون القا با IPTG و کلونی فاقد پلاسمید نوترکیب افزایش جذب و تغییر رنگ مشاهده نشد (شکل 3).

الف

 

ج

 

ب

 

شکل 3- الف) افزایش جذب در اثر اکسیداسیون ABTS در طول موج 420 نانومتر، پس از زمان 5 دقیقه میزان جذب به 9/0 رسید. نمونه شاهد 1/0 افزایش جذب به علت شکستن خودبه خودی ABTS نشان می­دهد.

ب) ایجاد رنگ سبز در اثر اکسیداسیون ABTS با آنزیم لاکاز برای نمونه مثبت.

ج) نمونه کنترل که عدم تغییر رنگ را نشان می‏دهد.

 

بحث و نتیجهگیری

بیان ژن لاکاز تحت شرایط معمول یعنی کشت سلول تحت شرایط هوازی جواب مطلوبی در بر نداشت. همان‏طور که قبلاً گزارش شده است تحت شرایط هوازی تنها بخش کمی از آنزیم بیان شده به شکل فعال باقی می‌ماند و بیشتر محصول بیان به شکل جسم توده‏ای[19] است که این اتفاق ممکن است به علت جایگزینی ناقص یون مس در ساختار آنزیم باشد (24). همان‌طور که دورائو[20] و همکاران به این نکته اشاره کردند که محتوای مس CotA وابسته به غنی سازی محیط کشت با یون مس و وجود اکسیژن در محیط کشت است (25). تغییر شرایط آئروبیک به میکروآئروبیک محتوای داخل سلولی مس را افزایش می‌دهد. افزایش یون مس داخل سلولی و همچنین، وجود شرایط میکروآئروبیک به ایجاد وضعیتی مناسب برای تاخوردگی و تشکیل هولوآنزیم منجر می‌شود.

توالی آمینواسیدی CotA، سویه GAZ23 که دارای 510 آمینواسید است با توالی آمینواسیدی پروتئین CotA باکتری باسیلوس سوبتیلیس که دارای 513 آمینواسید است در NCBI Blast بررسی شد. توالی آمینواسیدی CotA، سویه GAZ23، 79 درصد شباهت[21]و 68 درصد همسانی[22] ا به توالی آمینو اسیدی باکتری باسیلوس سوبتیلیسدارد. لیگاندهای متصل شونده به مس T1 در باکتری باسیلوس سوبتیلیس یعنی M502، H419، H497، C492 و در مس T2 یعنی: H105، H422 و در مس T3 یعنی: H107، H153، H155، H424، H491، H493 در توالی آمینواسیدی CotA، سویه GAZ23 کاملاً حفاظت شده است. ریشه اسید آمینه سیستئین C229 و C322 که فرض شده، در تشکیل باندهای دی سولفیدی در پروتئین CotA باکتری باسیلوس سوبتیلیس نقش دارند. همچنین، در توالی CotA، سویه GAZ23 حفظ شده است.

ژن مورد نظر در سویه GAZ23 همانند سایر لاکازهای قارچی و باکتریایی که تاکنون شناسایی شده، دارای 4 ناحیه متصل شونده به مس غنی از هیستیدین است و شباهت زیادی به پروتئین‌های متصل شونده به مس دارد (15).

 

 

جدول 1- هم تراز سازی 4 دمین متصل شونده به مس در توالی آمینواسیدی لاکاز برخی سویه­های باسیلوسی و سویه­های قارچی و مقایسه آن‏ها‏ با توالی آمینواسیدی لاکاز سویهGAZ23. ریشه­های آمینواسیدی حفاظت شده و متصل شونده یون‌های مس نوع 1، 2 و 3 با سایه نشان داده شده است.

313 1

1 2 3

3 3

2 3

نام و شماره دسترسی

470 NFLHCHIDW HL

418 HPFHLHGHTFSVV

126 TFWYHSH

83 TIHWHG

Pr: Q01679

489 NFLHCHIDF HL

415 HPFHLHGHAFAVV

125 TFWYHSH

82 SIHWHG

AAL00887 :Tvi

466 NFFHCHIEF HL

414 HPFHLHGHAFSVV

123 TFWYHSH

80 SIHWHG

Cc: AAD30964

480 NFLHCHIDWHL

427 HPFHLHGHTFDVI

139 TFWYHSH

96 SIHWHG

Po: Q12793

477 NFL HCHIDF HL

425 HPFHLHGHTFSVV

128 TFWYHSH

85 TIHWHG

Tvi: AAB47735

486 YVWHCHILE HE

419 HPIHLHLVSFRVI

14 9 ILWYHDH

103 VV HLHG

Bs CotA: NP_388511

462 NMFHCHEF HA

413 HPMHLHGDFFHVI

143 TYWYHSH

103 ALHLHG

Bh 2082: NP_ 242948

487 YVWHCHILE HED

417 HPIHLHLVQFM

146 ALWYHDH

100 VVHLHG

B lich: YP_077905

488 YVWHCHILE HED

421 HPIHLHIVQFR

146 TLWYHDH

103 VVHLHG

GAZ23

 

Pr: Phlebia radiate, Tv: Trametes versicolor, Cc: Coprinus cinereus, Po: Pleurotus ostreatus, Tvi: Trametes villosa

Bs: B. Subtilis, Bh: B. Halodurans, GAZ23, Blich: B. Licheniformis

 

از مهم‌ترین ویژگی­های CotA پایداری دمایی این پروتئین است، لاکازهای قارچی بیشتر در دماهای پایین فعال ‏هستند (23). در نتیجه پایداری دمایی CotA مزیتی برای کاربردهای بیوتکنولوژیکی است. اگرچه بیان آنزیم با افزودن مس به محیط کشت، کاهش دما و ایجاد شرایط میکروآئروبیک، نسبت به شرایط هوازی افزایش می­یافت، اما تنها بخش کمی از آنزیم بیان شده به شکل فعال بود.

بهینه سازی شرایط بیان برای تولید آنزیمی با فعالیت بیشتر، بررسی فعالیت و پایداری آنزیم در شرایط مختلف دما و اسیدیته، تعیین ویژگی­های بیوشیمیایی مانند تعیین وزن مولکولی دقیق پروتئین و تعیین ساختار آنزیمی برای ادامه کار پیشنهاد می­شود.

 



[1]. Azospirillum lipoferum

[2]. Bacillus subtilis

[3]. E. coli

[4]. B. halodurans

[5]. B. licheniformis

[6]. Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

[7]. Fermentase

[8]. 2,2ˊ-azino-bis(3-ethylbenzothioazolin-6-sulphonic acid

[9]. Sigma-Aldrich

[10]. Merck

[11]    Hucker                             

[12] Schaeffer-fulton

[13] Macrogen korea

[14]. http://blast. ncbi. nlm. nihi. gov

[15]. Phenyl methanesul fonyl fluoride or phenyl methyl sulfonyl fluoride

[16]. http://eztaxon-e. ezbiocloud. net/

[17] MEGA5

[18] www.expasy.ch

[19]. Inclosion body

[20] Durao

[21]. similarity

[22]. Identity

 References

(1) Thurston CF. The structure and function of fungal laccases. Microbiol1994; 140 (1): 19–26.

(2) Messerschmidt A, Huber R. The blue oxidases, ascorbate oxidase, laccase and ceruloplasmin-modeling and structural relationships. Eur J Biochem 1990; 187(2): 341–52.

(3) Claus H. laccases and their occurrence in prokaryotes. Arch. Microbiol 2003; 179(3): 145-50.

(4) Omalley DM, Whetten R, Bao WL, Chen CL, Sederoff RR. The role of laccase in lignification. Plant 1993; 4(5): 751–57.

(5) Geiger JP, Nicole M, Nandris D, Rio B. Root-rot diseases of Hevea brasiliensis,1. Physiological and biochemical aspects of host aggression. Eur J Forest Pathol 1986; 16(1): 22–37

(6) Mayer AM, Staples RC. Laccase: new functions for an old enzyme. Phytochemistry 2002; 60: 551–65

(7) Yaropolov A. I, Skorobogat'ko O. V, Vartanov S. S, Varfolomeyev M. W. Laccase properties, catalytic mechanism, and applicability. Biotechnol 1994; 49(3): 257-80.

(8) Minussi RC, Pastore GM, Durán N. Potential applications of laccase in the food industry. Trends Food Sci Technol 2002; 13(6-7): 205–16.

(9) Selinheimo E, Kruus K, Buchert J, Hopia A, Autio K. Effects of laccase, xylanase and their combination on the rheological properties of wheat doughs. JCereal Sci  2006; 43(2): 152–59.

(10)            Givaudan A, Effosse A, Faure D, Potier P, Bouillant ML, Bally R. Polyphenoloxidase in Azospirillum lipoferum isolated from rice rhizosphere : evidence for laccase activity in nonmotile strains of Azospirillum lipoferum. FEMS Microbiol Lett 1993; 108(2): 205-10

(11)                 Driks A. The Bacillus subtilis spore coat. Phytopathology 2004; 94(11): 1249–51.

(12)                 Brown NL, Barrett SR, Camakaris J, Lee BT, Rouch DA. Molecular gene and transport analysis of the copper resistabcse determinant (pco) from Escherichia coli plasmid pRJ 1004. Mol Microbiol 1995, 17(6):1153-66.

(13)                 H. J. Ruijssenaars. S. Hartmans. A cloned Bacillus halodurans multicopper oxidase exhibiting alkaline laccase activity. Appl Microbiol Biotechnol 2004; 65(2): 177–82.

(14)            Renate Reiss, Julian Ihssen, Linda Thöny-Meyer. Bacillus pumilus laccase: a heat stable enzyme with a wide substrate spectrum. BMC Biotechnology 2011; 11(1): 9.

(15)            Feng Xu, Damhus T, Danielsen S, Ostergaard LH. Modern biooxidation: Enzyme, Reaction and Apllication. Edited by Rolf D. Schmid, Valada B. urlacher. Weinheim: Wiley; 2007.

 


(16)             Sharma P, Goel R, Capalash N. Bacterial laccases. World J Microbiol Biotechnol 2007. 23: 823–32.

(17)             Gerhardt P, Murray R. G. E. Methods for general and molecular bacteriology. 3rd Edition. Washington. D. C: American Society for Microbiology; 1994.

(18)             Atlas R. M, Bartha R. Microbial Ecology: Fundamentals and Applications. 4th Edition. Addison: Wesley; 1998.

(19)                 Wilson K. Preparation of genomic DNA from bacteria. In Current Protocols in Molecular Biology, B. R. Ausubel FM, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, editor. New York: John Wiley & Sons; 1987.

(20)                 Spencer J. Environmental microbiology: methods and protocols. US: Humana Press Inc; 2004.

(21)                 Saitou N, Nei, M. The neighbor-joiningmethod: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology Evolution 1987; 4: 406-25.

(22)             Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 1985, 39(4): 783-91.

(23)             Kumar S, Stecher G, Peterson D, and Tamura K. MEGA-CC: Computing Core of Molecular Evolutionary Genetics Analysis Program for Automated and Iterative Data Analysis. Bioinformatics 2012; 28:2685-86.

(24)                 Koschorreck K, Richter SM, Ene AB, Roduner E, Schmid RD, Urlacher VB. Cloning and characterization of a new laccase from Bacillus licheniformis catalyzing dimerization of phenolic acids. Appl Microbiol Biotechnol 2008; 79(2):217-24.

Durao P, Chen Z, Fernandes AT, Hildebrandt P, Murgida DH, Todorovic S, et al. Copper incorporation into recombinant CotAlaccase from Bacillus subtilis: characterization of fully copper loaded enzymes. J BiolInorg Chem 2008; 13(2):183–