خالص‏سازی و تعیین ویژگی‏های آمیلوپولولاناز مقاوم به حلال و نمک‏دوست خارج سلولی جدا شده از آرکی نمک‏دوست Halorubrum سویه Ha25

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران

2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران

3 استاد بیوشیمی، دانشگاه تربیت مدرس، ایران

4 دانشیار بیوشیمی، دانشگاه تهران، ایران

5 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران

چکیده

  مقدمه : نمک­دوست­ها، به ویژه هالوآرکی­ها یکی از مهم‏ترین گروه­های میکروارگانیسم­های افراطی­دوست هستند. هیدرولازها ی نمک­دوست بسیار مطالعه شده­اند و برای کاربردهای صنعتی و زیست فن­آوری مورد توجه هستند. با توجه به اهمیت هیدرولازهای نمک­دوست، مطالعه حاضر اولین گزارش در مورد خالص­سازی آنزیم آمیلوپولولاناز از یک آرکی نمک­دوست است .   مواد و روش ‏‏ ها: آرکی نمک­دوست Halorubrum سویه Ha25 آنزیم آمیلوپولولاناز خارج سلولی نمک­دوست و مقاوم به حلال را در غلظت بالای نمک سدیم کلراید تولید می­کند. به منظور خالص­سازی آنزیم، از رسوب­دهی پروتئین­ها با حلال اتانول و کروماتوگرافی تعویض آنیونی استفاده شده وجرم مولکولی آنزیم بعد از تخلیص، به کمک روش SDS - PAGE تعیین شد. بعد از تخلیص آنزیم، ویژگی­های آنزیم بررسی شد. به منظور تعیین پایداری آنزیم در حضور حلال­های آلی، محلول­ آنزیمی به طور جداگانه در مجاورت هفت حلال آلی قرار گرفت. در انتها محصول عملکرد آنزیم روی دو سوبسترای نشاسته و پولولان به روش کروماتوگرافی لایه­ی نازک بررسی شد .   نتایج: جرم مولکولی آنزیم به کمک روش SDS - PAGE به میزان kDa 140 تعیین شد. بیشینه­ی فعالیت آمیلولیتیک و پولولیتیک آنزیم در دمای 50 درجه سانتی‏گراد بود. اسیدیته بهینه برای فعالیت آمیلولیتیکی 0/7 و برای فعالیت پولولیتیکی 5/7 تعیین شد. آنزیم در محدوده وسیع غلظتی صفر تا 5/4 مولار از نمک NaCl فعال بود. اثر حلال­های آلی مختلف روی فعالیت پولولیتیک و آمیلولیتیک آنزیم آمیلوپولولاناز نشان داد که آنزیم در حضور حلال­های غیر قابل اختلاط با آب دارای پایداری بیشتری نسبت به حلال­های قابل اختلاط با آب است. تنها محصول عملکرد آنزیم روی هر دو سوبسترای نشاسته و پولولان، گلوکز تعیین شد .   بحث و نتیجه ‏ گیری: آرکی نمک­دوست Halorubrum سویه Ha25 ، آنزیم آمیلوپولولاناز نمک­دوست و گرمادوست را تولید می­کند. با توجه به فعالیت آنزیم در شرایطی نظیر دما و شوری بالا و آب فعال کم، این آنزیم گزینه­ای مناسب به منظور کاربردهای زیست فن­آوری، نظیر تیمار پسآب­های داراری شوری بالا، حلال­های آلی و ترکیبات نشاسته­ای است .  

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Purification and characterization of an extracellular halophilic and organic solvent-tolerant amylopullulanase from a haloarchaeon, Halorubrum sp. strain Ha25.

نویسندگان [English]

  • Maryam Siroosi 1
  • Mohammad Ali Amoozegar 2
  • Khosro Khajeh 3
  • Mehran Habibi Rezaei 4
  • Mostafa Fazeli 5
1 PhD student of Microbiology, University of Tehran, Iran
2 Associate Professor of Microbiology, University of Tehran, Iran
3 Professor of Biochemistry, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
4 Assistant Professor of Biochemistry, University of Tehran, Iran
5 M.Sc. of Microbiology, University of Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: Halophiles, especially haloarchaea are one of the most important groups of extremophiles. Halophilic hydrolases have been studied worldwide and have been considered for biotechnology and industrial technologies. This study is the first report in amylopullulanase production in halophilic microorganisms.
Materials and methods: A halophilic archaeon, Halorubrum sp. strain Ha25, produced extracellular halophilic organic solvent-tolerant amylopullulanase. The enzyme was purified using ethanol precipitation and anion exchange chromatography method. Molecular mass of purified enzyme was determined by SDS–PAGE method. After purification, the enzyme was characterized. To study the effects of organic solvents in the stability of the enzyme, the enzyme solution was incubated in the presence of various organic compounds and then, residual enzyme activity was measured. Mode of action of the enzyme was determined by thin-layer chromatography.
Results: Molecular weight of the purified enzyme was estimated to be 140 kDa by SDS–PAGE method. Optimum temperature for amylolitic and pullulytic activities was 50 °C. Optimum pH for amylolitic activity was 7.0 and for pullulytic activity was 7.5. This enzyme was active over a wide range of concentrations (0-4.5 M) of NaCl. The effect of organic solvents on the amylolitic and pullulytic activities showed that this enzyme was more stable in the presence of non-polar organic solvents than polar solvents. The enzyme solely hydrolyzed pullulan and soluble starch to glucose.
Discussion and conclusion: Halorubrum sp. strain Ha25 produces thermophilic and extremely halophilic amylopullulanase. The catalytic function under multi extreme condition of high temperature, high salinity, and low water activity might possess biotechnological and commercial values such as treatment waste solutions with starch residues, high salt content and solvents.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Halophilic amylopullulanase
  • Organic solvent-tolerance
  • Protein purification
  • Extreme halophilic archaea
  • Halorubrum
  • Organic solvent
  • Tolerance

مقدمه

هالوآرکی­ها در راسته Halobacterialesو خانواده­یHalobacteriaceae قرار داشته و نمک‏دوست­های افراطی[1] هستند که برای رشد به حداقل 5/1 مولار از نمک NaCl نیاز دارند (2). نمک‏دوست‏ها، میکروارگانیسم­های افراطی­دوستی هستند که قابلیت بقاء و رشد در محیطی با میزان شوری بالا را داشته و منبعی برای آنزیم­های نمک­دوست هستند (3). بسیاری از فرآیندهای صنعتی در شرایط فیزیکی و شیمیایی سختی انجام می­شوند که برای عملکرد بسیاری از آنزیم­های معمول، مناسب نیست. از این­رو، یافتن آنزیم­های افراطی­دوستی[2] که بتوانند در شرایطی مانند شوری و دمای بالا فعالیت داشته باشند، بسیار ارزشمند است. در سال­های اخیر توجه به آنزیم­های تولید شده توسط میکروارگانیسم­های افراطی­دوست که توانایی فعالیت در شرایط سخت را دارند، افزیش یافته است (4). آنزیم‏های نمک­دوست جدا شده از آرکی­های نمک­دوست می­توانند دارای کاربردهای متعددی در صنایع باشند زیرا در غلظت بالای نمک، دمای بالا و آب فعال کم دارای فعالیت هستند (5). پروتئین­های آرکی­های نمک­دوست در مقایسه با پروتئین­های معمولی به واسطه­ی تعداد کمتر اسیدهای­آمینه آب­گریز و اسیدهای­آمینه­ای با بار منفی که در سطح خود دارند، می­توانند در غلظت بالای نمک که در داخل و خارج سلول با آن روبرو هستند پایدار باشند (6).

آنزیم­های خانواده α-آمیلاز دارای فعالیت­های زیست­فن­آوری متعددی هستند و در صنایع مواد شوینده، کاغذ، مواد غذایی و دارویی کاربرد دارند (7). پولولانازها (پولولان-6 گلوکانوهیدرولاز)، انواعی از آنزیم­های شاخه شکن بوده و به خانواده­ی آنزیمی
 α-آمیلاز متعلق هستند. این آنزیم­ها بسته به توانایی و یا عدم توانایی هیدرولیز پیوند گلیکوزیدی (4,1) -α در نشاسته، آمیلوپکتین و الیگوساکاریدهای مربوطه به دو نوع I و II (آمیلوپولولاناز) تقسیم می­شوند. نوع I بر خلاف نوع II قادر به هیدرولیز پیوند گلیکوزیدی (4,1) -α نیست. هر دو نوع آنزیم I و II قادر به شکست پیوندهای گلیکوزیدی (6,1) -α در پولولان بوده و مالتوتریوز را به عنوان محصول تولید می­کنند. پولولان هیدرولاز نوع I (نئوپولولاناز) و پولولان هیدرولاز نوع II (ایزوپولولاناز)، توانایی هیدرولیز پیوند گلیکوزیدی (4,1) -α را در پولولان داشته و پنوز و ایزوپنوز را تولید می­کند (8). پولولان هیدرولاز نوع III توانایی هیدرولیز پیوندهای گلیکوزیدی (4,1) -α و (6,1) -α را در پولولان داشته و مالتوتریوز، پنوز و مالتوز را به عنوان محصول تولید می­کند (9).

در این پژوهش، آنزیم آمیلوپولاناز از آرکی نمک‏‏دوست Halorubrum سویه Ha25 تخلیص شده و وزن مولکولی آن تعیین شد. سپس ویژگی­های کینتیکی آن نظیرVmax و Km و هم­چنین شرایط بهینه فعالیت آنزیم بررسی شد. محصولات حاصل از عملکرد آنزیم روی سوبستراهای نشاسته و پولولان نیز به کمک روش کروماتوگرافی لایه نازک تعیین شد. این مطالعه، اولین گزارش در خالص­سازی آنزیم آمیلوپولولاناز نمک‏دوست از یک میکروارگانیسم نمک­دوست است.

 

مواد و روشها

سویه آرکیایی و شرایط کشت

آرکی نمک­دوست سویه Ha25 از دریاچه نمک آران بیدگل در ایران جدا شد. بررسی­های بیوشیمیایی، فنوتیپی و ریخت‏شناسی به همراه تعیین توالی ژن
S rRNA16 و بررسی شباهت توالی
 S rRNA16 این سویه با سایرتوالی­های ثبت شده در پایگاه اطلاعاتی EzTaxon-e server، نشان داد که این سویه به جنس Halorubrumمتعلق بوده و بیش‏ترین شباهت را به گونه‏Halorubrum chaoviator Halo-GT (AM048786) دارد (1 و 10). تولید آنزیم پولولاناز سویه­ Ha25 در شرایط هوازی، دمای 40 درجه سانتی‏گراد، در انکوباتور شیکردار با حرکت دورانی 200 دور در دقیقه و در محیط کشت دارای (w/v) 23 درصد نمک تام (NaCl 4/18 درصد، MgSO4.7H2O 7/2 درصد، MgCl2.6H2O 3/2 درصد، KCl54/0 درصد، CaCl2.2H2O058/0 درصد)، 2 درصد مالتوز، 5/0 درصد پپتون گوشت، 5/0 درصد عصاره­ی گوشت و (v/v) 04/0 درصد محلول عناصر کم­مصرف، (11) با اسیدیته 2/7-4/7، بعد از گذشت سه روز به بیشترین میزان خود رسید. مایع رویی این محیط کشت برای خالص سازی آنزیم استفاده شد.

سنجش فعالیت آنزیمی و تعیین غلظت پروتئین

برای تعیین فعالیت پولولیتیکی و آمیلولیتیکی، از محلول پولولان 5/0 درصد و نشاسته­ی محلول یک درصد در بافر Tris-HClبا غلظت 50 میلی مولار، محتوی 20 میلی مولار CaCl2 با اسیدیته 0/8 تا 5/7 (بافر A) به عنوان سوبسترا استفاده شد. به این صورت که میزان 50 میکرو لیتر از محلول آنزیمی با 450 میکرو‏لیتر از محلول سوبسترا مخلوط شده و به مدت یک ساعت در دمای 50 درجه­ سانتی‏گراد گرماگذاری شد. بعد از گرماگذاری، میزان قندهای احیاء کننده با کمک معرف دی­نیتروسالیسیلیک اسید تعیین شد (12). به این ترتیب که میزان 500 میکرو لیتر از معرف دی­نیتروسالیسیلیک اسید به مخلوط واکنش آنزیمی اضافه شد و در آب جوش به مدت 10 دقیقه قرار گرفت. بر حسب تعریف یک واحد آنزیم مقدار آنزیمی است که موجب هیدرولیز یک میکرومول سوبسترا در یک دقیقه در یک میلی‏لیتر محلول آنزیمی شود.

غلظت پروتئین نمونه­ها با روش برادفورد تعیین شد. از آلبومین سرم گاوی به عنوان استاندارد استفاده شد (13). غلظت پروتئین بخش­های خارج شده از ستون، از طریق تعیین جذب نمونه­ها در طول موج 280 نانومتر تعیین شد.

خالص سازی آنزیم

تمام مراحل خالص سازی آنزیم در دمای 4 درجه سانتی‏گراد انجام شدند. مایع رویی کشت سه روزه آرکی از طریق سانتریفیوژ محیط کشت به مدت 20 دقیقه با دور x g ­9000­، از سلول­ها و سایر مواد جامد جدا شد. یک حجم اتانول سرد مطلق منفی20 درجه سانتی‏گراد) به تدریج به مایع رویی محیط کشت در حال هم زدن، اضافه شد. رسوب پروتئینی حاصل به کمک سانتریفیوژ به مدت 20 دقیقه با دور x g ­10000 جدا شد و در کمترین میزان بافر A حل شده و ترکیبات نامحلول از طریق سانتریفیوژ مجدد به مدت 20 دقیقه با دور x g ­10000 جدا شدند. سپس این محلول علیه بافر A به مدت 15 ساعت دیالیز شد. این محلول حاصل روی ستون گروماتوگرافی تعویض آنیونی
 Q-Sepharose (آمرشام بیوساینس[3]، ابعاد ستون: 15 سانتی‏متر در یک سانتی­متر) که از قبل با بافر A به تعادل رسیده بود، قرار گرفت. ستون با همین بافر شستشو داده شد تا جایی که غلظت پروتئین­های بخش­های خارج شده از ستون به صفر رسید. سپس پروتئین­های متصل به ستون از طریق یک شیب غلظت خطی از غلظت صفر تا یک مولار نمک سدیم کلراید در بافر A، با شدت جریان یک میلی­لیتر در دقیقه از آن خارج شدند. بخش‏هایی از ستون که دارای فعالیت آمیلوپولولانازی بودند، جمع‏آوری شده و برای مطالعات بیشتر بررسی شدند. جرم مولکولی و میزان خلوص آنزیم از طریق
 SDS-PAGE و با روش لاملی[4] تعیین شد (14). به منظور حذف نمک‏ها از مایع رویی محیط کشت برای انجام SDS-PAGE، نمونه به کمک سنتریکون تغلیظ شد و سپس با بافر A به حجم اولیه رسانده شد و این عمل چندین بار تکرار شد تا نمک‏ها از مایع رویی محیط کشت حذف شوند.

بررسی اثر دما، اسیدیته و غلظت نمک سدیم کلرایدروی فعالیت آنزیم

اثر اسیدیته روی فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم در محدوده بین 5/4 تا 0/10 تعیین شد. برای این منظور از بافر مخلوط با غلظت 50 میلی مولار
(0/5-5/4، سدیم استات؛ 5/7-0/6، سدیم فسفات؛ 0/9-0/8، Tris-HCl؛ 0/12-5/9، Glycine-NaOH) و شرایط استاندارد تعیین فعالیت آنزیمی که در بالا به آن اشاره شد انجام شد. نیمرخ دمایی و دمای بهینه­ی فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی، از طریق تعیین فعالیت آنزیمی با گرماگذاری مخلوط واکنش آنزیمی در محدوده دمایی بین 35 تا 70 درجه سانتی‏گراد، با فواصل دمایی 5 درجه سانتی‏گراد تعیین شد. مخلوط واکنش‏های آنزیمی به مدت یک ساعت در دماهای ذکر شده گرماگذاری شدند و بعد از این مدت معرف دی­نیتروسالیسیلیک اسید به آن­ها اضافه شد و سپس به مدت 10 دقیقه در آب جوش قرار داده شد. برای تعیین غلظت بهینه نمک سدیم کلراید برای فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم، سنجش فعالیت آنزیمی در شرایطی انجام شد که مخلوط واکنش دارای صفر تا 5/4 مولار نمک بود.

تعیین پایداری دمایی و مقاومت آنزیم نسبت به حلال‏های آلی

به منظور تعیین پایداری دمایی آنزیم در دمای 70 درجه­ سانتی‏گراد، نمونه­ی آنزیمی به مدت 35 دقیقه در دمای 70 درجه­ سانتی‏گراد قرار گرفت. سنجش باقیمانده فعالیت آنزیمی نمونه آنزیمی تیمار شده در دمای 70 درجه سانتی‏گراد، در فاصله زمانی بین 5 تا 35 دقیقه و هر 5 دقیقه یک بار، در شرایط استاندارد سنجش آنزیمی انجام شد. فعالیت نمونه آنزیمی که تیمار دمایی نشده بود، 100 درصد در نظر گرفته شد.

به منظور تعیین پایداری آنزیم در حضور حلال‏های آلی، نمونه­ی آنزیمی در حضور غلظت (v/v) 20 و 50 درصد حلال­های آلی مختلف نظیر دی متیل سولفوکساید[5]، n-بوتانول، دی متیل فرمامید[6]، اتانول، 2-­پروپانول، استون و کلروفرم به مدت یک هفته در انکوباتور شیکردار با دمای 20 درجه سانتی‏گراد و با حرکت دورانی 150 دور در دقیقه قرار گرفت (31). باقی مانده فعالیت آنزیمی هر روز سنجش شد. فعالیت نمونه آنزیمی که در مجاورت حلال قرار نگرفته بود، به عنوان کنترل در نظر گرفته شد. سپس نیمه عمر فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیمی تعیین شد.

تعیین ویژگی­های کینتیکیVmax و Kmآنزیم

ویژگی‏های کینتیکی آنزیم، توسط گرماگذاری نمونه آنزیمی با غلظت­های مختلف نشاسته­ی محلول و پولولان در بافر A به عنوان سوبسترا در دمای 50 درجه سانتی‏گراد به مدت 60 دقیقه تعیین شد. مقادیرVmax و Kmآنزیم از طریق رسم منحنی لاین ویور برک[7] به دست آمد.

کروماتوگرافی لایه­ی نازک

نمونه آنزیمی در حضور پولولان 5/0 درصد و نشاسته محلول یک درصد در بافر A به عنوان سوبسترا و در دمای 50 درجه سانتی‏گراد به مدت دو ساعت گرماگذاری شد. فعالیت آنزیمی با قرار دادن مخلوط واکنش در دمای حدود 100 درجه سانتی‏گراد به مدت 10 دقیقه، متوقف شد. نمونه­های حاصل از عملکرد آنزیم به شکل یک لکه روی کاغذ کروماتوگرافی قرار گرفتند و بعد از خشک شدن لکه‏ها، این کاغذ در تانک محتوی سیستم حلالی n-بوتانول، متانول و آب ((v/v) 4:2:1) برای جدا کردن محصولات قندی تولید شده، قرار گرفت. وقتی حلال به بالای کاغذ رسید، کاغذ از تانک خارج شده و پس از خشک شدن، برای آشکار شدن لکه­ها سولفوریک اسید و متانول ((v/v) 1:1) روی سطح کاغذ پاشیده شده و به مدت 5 دقیقه در دمای 100 درجه­ سانتی‏گراد قرار گرفت (14). قندهای گلوکز (G1)، مالتوز (G2)، مالتوتریوز (G3)، مالتوتترائوز (G4)، مالتوپنتائوز (G5)، مالتوهگزائوز (G6)، مالتوهپتائوز (G7) و قند پنوز نیز به عنوان شاهد در کنار نمونه­ها قرار گرفتند.

 

نتایج

خالص سازی و تعیین ویژگی­های آنزیم

آنزیم خارج سلولی آمیلوپولولاناز از محیط کشت سه روزه­ی آرکی با روش رسوب­دهی پروتئین­ها به کمک حلال آلی اتانول و استفاده از ستون تعویض آنیونی تخلیص شد. نمونه پروتئینی حاصل از رسوب‏دهی با اتانول بر روی ستون Q-Sepharose قرار گرفت و بعد از شستشوی ستون با گرادیان خطی از نمک سدیم کلراید، آنزیم در غلظت 38/0 مولار از این نمک از ستون خارج شد. سه بخش دارای فعالیت از ستون به دست آمد (شکل 1). خلاصه­ای از مراحل مختلف خالص سازی در جدول 1 نشان داده شده­اند. جرم مولکولی آنزیم آمیلوپولولاناز با کمک SDS-PAGE به میزان 140 کیلودالتون تعیین شد (شکل 2).

 

 

 

 

 

جدول 1- خلاصه­ای از مراحل مختلف خالص­سازی آنزیم آمیلوپولولاناز از مایع رویی محیط کشت سویه­ Ha25

مراحل خالص­سازی

بازده ( درصد)

خالص­سازی (برابر)

فعالیت ویژه

(واحد آنزیمی  بر میلی­گرم)

پروتئین کل  (میلی­گرم)

فعالیت کل  

(واحد آنزیمی)

آنزیم خام

100

1

5/4

100

450

50 درصد اتانول (v/v)

31

2

9

5/15

140

Q-Sepharose

5/3

2/3

5/14

1/1

16

 

 

شکل 1- کروماتوگرافی تعویض آنیونی به کمک ستون Q-Sepharose

 

 

 

شکل 2- تحلیل الکتروفورتیک آنزیم خالص شده. در این شکل، پروتئین­های موجود در هر مرحله­ی خالص سازی نشان داده شده­اند. ردیف 1: شاهد جرم مولکولی ردیف 2: کروماتوگرافی تعویض آنیونی ردیف 3: رسوب اتانولی ردیف 4: مایع رویی محیط کشت

 

اثر عوامل مختلف بر روی فعالیت آنزیم در شکل 3 نشان داده شده­اند. آنزیم هر دو فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی خود را در محدوده­ی وسیع اسیدیته از 5/4 تا 0/10 حفظ کرد. اسیدیته بهینه برای فعالیت آمیلولیتیکی 0/7 و برای فعالیت پولولیتیکی به میزان 5/7 تعیین شد. فعالیت نسبی آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم در اسیدیته 5/4 به ترتیب 23 و 31 درصد و در اسیدیته 0/10 به ترتیب 44 و 30 درصد تعیین شد (شکل 3 الف). نیمرخ دمایی آنزیم در شکل 3 ب نشان داده شده­ است. هر دو فعالیت آنزیمی در دمای 50 درجه سانتی‏گراد بیشینه است. در دمای 35 درجه سانتی‏گراد، فعالیت نسبی پولولیتیکی و آمیلولیتیکی آنزیم، به ترتیب 55 درصد و 40 درصد تعیین شد. در دمای 70 درجه­ سانتی‏گراد، هر دو فعالیت آنزیمی تنها 32 درصد از بیشترین میزان فعالیت خود را نشان می­دهند. بیشینه­ی فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی به ترتیب در غلظت 0/2 و 5/3 مولار از نمک سدیم کلراید تعیین شدند. در غلظت 5/4 مولار از این نمک، 44 درصد و 31 درصد از فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم باقی ماند، در حالی که در غلظت صفر مولار از نمک سدیم کلراید، به ترتیب 36 درصد و 7 درصد از فعالیت بیشینه­ی آنزیمی دیده شد (شکل 3 پ).


 

الف

ب

 


 

 

 

پ

 

شکل 3- اثر اسیدیته (الف)، دما (ب) و غلظت­های مختلف نمک سدیم کلراید (پ) بر روی فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم آمیلوپولولاناز. فعالیت آنزیمی مطابق با شرایط استاندارد اشاره شده در متن انجام شده است. بیشترین میزان فعالیت آنزیمی به عنوان 100 درصد در نظر گرفته شده است. فعالیت­های آنزیمی به شکل فعالیت نسبی ± انحراف معیار گزارش شده­اند.

ویژگی­های کینتیکی آنزیم از طریق سنجش استاندارد فعالیت آنزیمی و در حضور پولولان و نشاسته محلول به عنوان سوبسترا انجام شد. میزان Km و Vmaxبه کمک نمودار لاین ویوربرک تعیین شدند (شکل 4). میزان Kmبرای سوبسترای نشاسته محلول 8/1 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر و برای سوبسترای پولولان 8/4 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر تعیین شد. میزان Vmaxبرای سوبسترای نشاسته محلول 25 میکرومول بر دقیقه و برای سوبسترای پولولان  7/10 میکرومول بر دقیقه تعیین شد.

نحوه­ی عملکرد آنزیم بر روی سوبسترای نشاسته محلول و پولولان

محصول عملکرد آنزیم بر روی دو سوبسترای نشاسته محلول و پولولان در شکل 5 نشان داده شده­اند. از آن­جا که آنزیم خالص شده به شکل یک باند دارای هر دو فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی روی
SDS-PAGE دیده شد و به دلیل این‏که تنها محصول تولید شده توسط آنزیم حاصل از عملکرد بر روی هر دو سوبسترا تنها گلوکز بود، نوع آنزیم آمیلوپولولاناز تعیین شد (16).

 

شکل 5- الگوی عملکرد آنزیم آمیلوپولولاناز بر روی سوبستراهای نشاسته محلول و پولولان. ردیف 1: محصول عملکرد آنزیم روی سوبسترای نشاسته محلول ردیف 2: محصول عملکرد آنزیم روی سوبسترای پولولان ردیف 3: استاندارد قندی (قند یک کربنه تا هفت کربنه) ردیف 4: قند پنوز (محصول اصلی عملکرد آنزیم نئوپولولاناز)

 

 

شکل 4- منحنی لاین ویوربرک فعالیت آنزیمی با استفاده از نشاسته محلول و پولولان به عنوان سوبسترا. فعالیت آنزیمی مطابق با شرایط استاندارد تعیین شده است.

 


پایداری دمایی آنزیم و مقاومت به حلال­های آلی

به منظور تعیین پایداری دمایی آنزیم در دمای 70 درجه سانتی‏گراد، نمونه آنزیمی به مدت 35 دقیقه در این دما قرار گرفت. بعد از طی این زمان گرماگذاری، باقی مانده فعالیت آنزیمی سنجیده شد و مشخص شد فعالیت پولولیتیکی و فعالیت آمیلولیتیکی به ترتیب 36 درصد 39 درصد از فعالیت اولیه خود را نشان می­دهند. پایداری دمایی آنزیم در شکل 6 نشان داده شده است.

 

 

 

شکل 6- پایداری حرارتی آنزیم آمیلوپولولاناز در دمای 70 درجه­ سانتی‏گراد. فعالیت آنزیمی بدون تیمار حرارتی به عنوان 100 درصد در نظر گرفته شد. فعالیت­های نسبی به شکل ± انحراف معیار نشان داده شده­اند.

 

به منظور بررسی اثر حلال­های آلی بر روی پایداری آنزیم، هفت حلال آلی با ارزش log POWبین 97/1 تا 376/1- با غلظت­های (v/v) 20 و 50 درصد با نمونه آنزیمی مخلوط شدند. فعالیت آنزیمی به مدت هفت روز سنجش شد. نیمه عمر فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم در جدول 2 نشان داده شده است. همانطور که در جدول دیده می­شود، نیمه عمر فعالیت آمیلولیتیکی در دمای 20 درجه سانتی‏گراد و در عدم حضور حلال­های آلی 250 ساعت و نیمه عمر فعالیت پولولیتیکی 165 ساعت است. در غلظت 20 درصد حلال­های آلی قابل اختلاط با آب، نیمه عمر آنزیم کوتاهتر از حلال­های آلی غیر قابل اختلاط با آب است. این موضوع در مورد حلال پروپانول و استون دیده نشد، به طوری که آنزیم در حضور غلظت 20 درصد از حلال پروپانول کمترین نیمه عمر و در حضور حلال استون بیشترین نیمه عمر را دارا بود. در حضور غلظت 50 درصد این حلال­ها، همان الگوی مشاهده شده در مورد غلظت 20 درصد دیده شد.

 

 

جدول 2- اثر حلال­های آلی بر روی فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم آمیلوپولولاناز

غلظت حلال (20 درصد)

غلظت حلال (50 درصد)

Log Pow

حلال آلی

نیمه عمر فعالیت پولولیتیکی(ساعت)

نیمه عمر فعالیت آمیلولیتیکی(ساعت)

نیمه عمر فعالیت پولولیتیکی(ساعت)

نیمه عمر فعالیت آمیلولیتیکی (ساعت)

165

250

165

250

-

-

150

230

160

240

97/1

کلروفرم

125

215

140

220

88/0

n- بوتانول

33

53

16

40

074/0

پروپانول

65

101

72

82

- 038/0

DMF

155

155

160

280

-208/0

استون

57

99

50

54

-22/0

اتانول

46

41

44

36

-1/39

DMSO

 

 


بحث و نتیجه­گیری

در این مطالعه برای اولین بار یک آنزیم آمیلوپولولاناز نمک­دوست و مقاوم به حلال گزارش شده است. بررسی­های بیوشیمیایی، فنوتیپی و تعیین توالی ژن S rRNA16 نشان دادند که سویه­ Ha25 به جنس Halorubrum متعلق است. آنزیم تولید شده در محیط کشت مایع، به کمک رسوب­دهی اتانولی و ستون تعویض آنیونی خالص شد. جرم مولکولی آنزیم آمیلوپولولاناز با کمک SDS-PAGE به میزان تقریبی 140 کیلودالتون تعیین شد. جرم مولکولی این آنزیم مشابه با جرم مولکولی آمیلوپولولاناز جدا شده از Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum(150 کیلو دالتون)، Thermoanaerobacter ethanolicus 39 E (140 کیلو دالتون)، siculi Thermococcus (131 کیلو دالتون) است (15، 17، 18 و 19). دمای بهینه برای فعالیت آنزیم آمیلوپولولاناز سویه­ Ha25 (50 درجه­ سانتی‏گراد) مشابه با دمای مشاهده شده برای فعالیت آنزیم­های α-آمیلاز نمک­دوست جدا شده از Haloarcula hispanicaوHaloferax mediterranei است (20 و 21). در بسیاری از موارد دمای بهینه آنزیم‏های آمیلوپولولاناز بیشتر از 50 درجه سانتی‏گراد بوده است. برای مثال دمای بهینه آمیلوپولولاناز جدا شده از Pyrococcus furiosus (105 درجه­ سانتی‏گراد)، Closteridium thermosulfurogenes SVM17 (70 درجه­سانتی‏گراد) وGeobacillus stearothermophilus (65 درجه‏سانتی‏گراد) بوده است (22، 23 و 24). هر دو فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم آمیلوپولولاناز در محدوده­ی وسیعی از اسیدیته حفظ می­شوند، مشابه با آن­چه که در مورد α-آمیلازهای نمک­دوست جدا شده از
 Bacillus cereus Ms6،Halomonas meridianaو Marinobacter sp. EMB دیده شده است (25، 26 و 27). در حالی که اسیدیته بهینه­ای که برای فعالیت این آمیلوپولولاناز تعیین شده است بیشتر از مقادیر گزارش شده برای پولولاناز جدا شده از
(5 pH) Desulforucoccus mucosus،
(6 pH) Fervidobacterium pennavorans Ven5، (6 pH) P. woeseiو آمیلوپولولاناز جدا شده از
(5 pH) Thermoanaerobacter strain B6A بوده است (28، 29 و 30).

هر دو فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم در محدوده­ غلظت NaCl بین صفر تا 5/4 مولار دیده شده و فعالیت بهینه­ آن­ها به ترتیب در غلظت 2 و 5/3 مولار از نمک تعیین شد. این تحمل بالای نمک در آمیلازهای نمک­دوست جدا شده از

 Hfx. mediterranei،Har. hispanica،Nesterenkonia sp. strain F و Chromohalobacter sp. TVSP 101 نیز دیده شده است (20، 21، 31 و 32).

آمیلازهایی که دارای این تحمل بالای نمک هستند، می­توانند در تصفیه پسآب­های آلوده به ترکیبات نشاسته­ای و دارای نمک بالا به کار بروند (31). با توجه به این‏که که بسیاری از آنزیم­ها عملکرد خود را در حضور حلال­های آلی از دست می­دهند، دست­یابی به آنزیم­هایی که به حلال­های آلی مقاومت دارند بسیار ارزشمند بوده و دارای کاربردهای متعددی در صنایع است. عوامل متعددی نظیر تغییر ساختار فضایی آنزیم، از دست رفتن انعطاف‏پذیری و کاهش آب فعال اطراف آنزیم در از دست رفتن فعالیت آنزیم در حضور حلال‏های آلی نقش دارند. آنزیم­هایی که به شکل طبیعی دارای مقاومت به حلال­های آلی هستند می­توانند دارای کاربردهای متعددی در جهت عملکرد در محیط‏های واجد این حلال­ها باشند، زیرا در این صورت نیازی به استفاده از روش­های مهندسی پروتئین در جهت ایجاد پایداری آنزیم­های معمولی نیست (33). بررسی نیمه عمر فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم در حضور غلظت 20 و 50 درصد حلال­های آلی نشان داد که پایداری آنزیم در حضور حلال­های آلی غیر قابل اختلاط با آب بیشتر از حلال­هایی است که قابل اختلاط با آب هستند. در این مورد دو استثنا دیده شد، به این صورت که آنزیم در حضور حلال پروپانول کمترین و در حضور حلال استون بیشترین نیمه عمر را دارا بود. این نتایج نشان می­دهند که پایداری آنزیم وابسته به قطبیت حلال مورد بررسی است، به این صورت که با افزایش قطبیت حلال میزان پایداری آنزیم کاهش پیدا می­کند و برعکس. پایداری α-آمیلازهای نمک­دوست جدا شده از Nesterenkonia sp. strain F، Haloarcula sp. strain S-1 وThalassobacillus sp. strain DF-E4 نیز همانند آنچه که در این مطالعه دیده شد بسته به قطبیت حلال مورد بررسی دارد (31، 34 و 35).

آنالیز محصولات قندی تولید شده حاصل از عملکرد آنزیم روی سوبستراهای نشاسته محلول و پولولان نشان داد که آنزیم تنها قند گلوکز را ایجاد می­کند. این موضوع نشان می­دهد که آنزیم قادر به شکست پیوندهای گلیکوزیدی (4,1) -α و (6,1) -α بوده و به این ترتیب نوع آنزیم، به احتمال زیاد آمیلوپولولاناز است. زیرا این آنزیم برخلاف سایر اعضای خانواده پولولانازها پنوز و ایزوپنوز را تولید نکرده و از طرفی قابلیت هیدرولیز پیوند گلیکوزیدی (4,1) -α را دارد. به منظور بررسی تولید احتمالی مقادیر بسیارکم از مالتوتریوز توسط این آنزیم که در روش کروماتوگرافی لایه نازک مشخص نشده است، ولی از مشخصات آنزیم آمیلوپولولاناز است لازم است که از روش­ حساسی نظیر HPLC استفاده کرد.

نتایج تحقیق حاضر نشان می­دهند که HalorubrumسویهHa25یک منبع تولید آنزیم آمیلوپولولاناز گرمادوست و نمک­دوستافراطی است. تولید این آنزیم در شرایط سختی مانند دمای بالا، غظت نمک زیاد و آب فعال کم انجام شده و از این رو می­تواند در چنین شرایطی که در صنایع بسیار دیده می­شود، کاربرد داشته باشد.



[1]. Extremophiles

[2]. Extremozymes

[3]. Amersham Biosciences

[4]. Laemmli

[5]. Dimethyl sulfoxide (DMSO)

[6]. N,N-Dimethyl formamide (DMF)

[7]. Lineweaver-Burk

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 References

(1)Fazeli M, Amoozegar M A,Habibi Rezaei M, Siroosi M, Production of an extracellular halophilic Pullulanase by Halorubrum sp. strain Ha25 isolated from Aran-Bidgol lake. Iranian Journal of Biology, in press

(2) Grant W D, Kamekura M, McGenity T J, Ventosa A. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed. New York: Springer; 2001; 294–334. (The Archaea and Deeply Branching and Phototrophic Bacteria; vol 1).

(3) Margesin R, Schinner F. Potential of halotolerant and halophilic microorganisms for biotechnology. Extremophiles 2001; 5 (2) :73-83.

(4) Adams M W W, Kelly R M. Enzymes from microorganisms in extreme environments. Chem. Eng. News 1995; 73 (51): 32-42.

(5) Makhdoumi Kakhki A, Amoozegar M A, Mahmodi Khaledi E. Diversity of hydrolytic enzymes in haloarchaeal strains isolated from salt lake. Int. J. Environ. Sci. Tech. 2011; 8 (4): 705-714.

(6) Mevarech M, Frolow F, Gloss L M, Halophilic enzymes: proteins with a grain of salt. Biophys Chem 2000; 86 (2) :155-164.

(7) Sivaramakrishnan S, Gangadharan D, Nampoothiri K M, Soccol C R, Pandey A. α-Amylases from microbial sources-an overview on recent developments. Food Technol Biotechnol 2006; 44 (2) :173-184.

(8) Niehaus F, Bertoldo C, Ka¨hler M, Antranikian G. Extremophiles as a source of novel enzymes for industrial application. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999; 51 (6) :711-729.

(9) Doma nacute–Pytka M, Bardowski J, Pullulan degrading enzymes of bacterial origin. Crit Rev Microbiol 2004; 30 (2) :107-21.


(10) Kim O S, Cho Y J, Lee K, Yoon S H, Kim M, Na H et al., Introducing EzTaxon-e: a prokaryotic 16S rRNA Gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species. Int J Syst Evol Microbiol 2012; 62 (3): 716-21.

(11) Dyall-Smith M. The Halohandbook: Protocols for halobacterial genetics. March 2009; [39] Available at: http://www.microbiol.unimelb.edu.au/people/dyallsmith/resources/halohandbook/index.html.

(12) Miller G. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducingsugars. Anal Chem 1959; 31 (3) :426-428.

(13) Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal biochem 1976;72 (1-2): 248-54.

(14) Laemmli U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970 (5259) ; 227: 680-5.

(15) Chung Y C, Kobayashi T, Kanai H, Akiba T, Kudo T. Purification and Properties of Extracellular amylase from the Hyperthermophilic Archaeon Thermococcus profundus DT5432. Appl Environ Microbiol 1995; 61 (4): 1502-06.

(16) Mrudula S, Gopal R, Seenayya G. Purification and characterization of highly thermostable amylopullulanase from a thermophilic, anaerobic bacterium Clostridium thermosulfurogenes SVM17. MJM 2011; 7 (2): 97-106.

(17) Ganghofner D, Kellermann J, Staudenbauer W, Bronnenmeier K. purification and properties of amylopullulanase, a glucoamylase and an alpha glucosidase in the amylolytic enzyme system of Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum. Biosci Biotechnol Biochem 1998; 62 (2): 302-08

(18) Mathupala S, Lowe S, Gregory Zeikus J. Sequencing of the Amylopullulanase (apu) Gene of Therrnoanaerobacter ethanolicus 39E, and Identification of the Active Site by Site-directed Mutagenesis. J Biol Chem 1993; 268 (22): 16332-34.

(19) Jiao Y, Ming-Sheng L, Xu J, Fang Y. A GH57 Family Amylopullulanase from Deep-Sea Thermococcus siculi: Expression of the Gene and Characterization of the Recombinant Enzyme. Curr Microbiol 2011; 62 (1): 222-8.

(20) Hutcheon G, Bolhuis A. Characterisation of a highly stable a-amylase from the halophilic archaeon Haloarcula hispanica. Extremophiles 2005; 9 (6): 487-95.

(21) Perez-Pomares F, Ferrer J, Pire C, Marhuenda-Egea FC, Bonete MJ. α-Amylase activity from the halophilic archaeon Haloferax mediterranei. Extremophiles 2003; 7 (4): 299-306.

(22) Dong G, Vieille C, Zeikus G. Cloning, sequencing, and expression of the gene encoding amylopullulanase from Pyrococcus furiosus and biochemical characterization of the recombinant enzyme. Appl. Environ. Microbiol. 1997; 63 (9): 3577-84.

(23) Mrudula S, Reddy G, Gunda S. Purification and characterization of highly thermostable amylopullulanase from a thermophilic, anaerobic bacterium Clostridium thermosulfurogenes SVM17. MJM 2011; 7: 97-106.

(24) Zareian S, Khajeh K, Ranjbar B, Dabirmanesh B, Ghollasi M, Mollania N. Purification and characterization of a novel amylopullulanase that converts pullulan to glucose, maltose, and maltotriose and starch to glucose and maltose. Enzyme Microbial Technol 2010; 46 (2): 57-63.

(25) Al-ZaZaee M M, Gurumurthy D M, Rajeshwara A N. Identification, Characterization of Novel Halophilic Bacillus Cereus Ms6: a Source for Extra Cellular A-Amylase. Adv in Env Biol 2011; 5 (5): 992-9.

(26) Coronado M J, Vargas C, Hofemeister J, Ventosa A, Nieto J. Production and biochemical characterization of an α-amylase from the moderate halophile Halomonas meridiana. FEMS Microbiol. Lett. 2000; 183 (1): 67-71.

(27) Duffner F, Bertoldo C, Andersen J T, Wagner K, Antranikian G. A new thermoactive pullulanase from Desulfurococcus mucosus: Cloning, sequencing, purification, and characterization of the recombinant enzyme after expression in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 2000; 182 (22): 6331-38.

(28) Danson M J, Hough D W. The structural basis of protein halophilicity. Comp. Biochem. Physiol. 1997; 117 (3): 307-12.

(29) Diger A, Antranikian G. Isolation and Characterization of a Heat-Stable Pullulanase from the Hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus woesei after Cloning and Expression of Its Gene in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 1995; 61 (2): 567-75.

(30) Saha B, Lamed R, Lee C, Mathupala S. Characterization of an endo-Acting Amylopullulanase from Thermoanaerobacter Strain B6A. Appl Environ Microbiol 1990; 56 (4): 881-6.

(31) Shafiei M, Ziaee A, Amoozegar M A. Purification and characterization of an organic-solvent-tolerant halophilic α-amylase from the moderately halophilic Nesterenkonia sp. strain F. J Ind Microbiol Biotechnol 2011; 38 (2): 275-81.

(32) Prakash B, Madhukumar M S, Muralikrishna G, Sreeramulu K. Production, purification, and characterization of two extremely halotolerant, thermostable, and alkali-stable a-amylases from Chromohalobacter sp. TVSP 101. Process Biochem 2009; 44 (2): 210-15.

(33) Doukyua N, Ogino H. Organic solvent-tolerant enzymes. Biochem Eng J 2010; 48 (3): 270-82.

(34) Fukushima T, Echigo A, Inoue A, Usami R. Organic solvent tolerance of halophilic α-amylase from a haloarchaeon, Haloarcula sp. strain S-1. Extremophiles 2005; 9 (1): 85-9.

(35) Xin Li, Yu Y Y. Characterization of an organic solvent-tolerant α-amylase from a halophilic isolate, Thalassobacillus sp. LY18. Folia Microbiologica 2012; 57 (5): 447-53.