شناسایی و تفکیک قارچ‏ها به روش ATR-FTIR در یک مجموعه آثار چرمی مربوط به عصر سلجوقی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری مرمت اشیاء فرهنگی و تاریخی، دانشگاه هنر اصفهان، ایران

2 استادیار مرمت اشیاء فرهنگی و تاریخی، دانشگاه هنر اصفهان، ایران

چکیده

  مقدمه : آسیب­های زیستی نقش مهمی در تخریب آثار تاریخی از جمله چرم، دارند. در این میان میکروارگانیسم­ها، از مهم­‏ترین عوامل تخریب زیستی هستند. شناخت قارچ­ها و سایر میکروارگانیسم­های موجود بر چرم و سایر آثار تاریخی، در درک بهتر صدمات و خسارات احتمالی ناشی از آن­ها که زمینه­ساز انتخاب راهکار صحیح برخورد با اشیاء است، ضرورت و اهمیت دارد. روش­های معمول شناسایی پاتوژن­ها و قارچ­ها، بسته به نوع روش، معمولاً همراه با مشکلاتی است و در این بین طیف­سنجی FTIR به­عنوان روشی موفق در تشخیص و شناسایی میکروارگانیسم­ها معرفی شده­است .   مواد و روش ‏‏ ها: در این مطالعه، نمونه­هایی از اشیاء چرمی تاریخی مربوط به عصر سلجوقی، برای شناسایی جنس قارچ­ها، در محیط SDA کشت یافت و بر اساس ویژگی­های ماکروسکوپی، میکروسکوپی و ریخت‏شناسی شناسایی شد. سپس میکروارگانیسم­ها با هدف امکان­سنجی تفکیک و شناسایی بر اساس ویژگی‏ها ساختاری به­روش ATR - FTIR ، ارزیابی شدند. در این راستا، از دو شیوه­ی ارزیابی ویژگی­های طیفی بر اساس شکل و موقعیت پیک و تحلیل خوشه­ای بر اساس مساحت زیر نمودار و موقعیت پیک استفاده شد .   نتایج: قارچ­های شناسایی شده مربوط به جنس­های پنی­سیلیوم (9 مورد، 3/33 درصد)، آسپرژیلوس (5 مورد، 5/18 درصد)، کلادوسپوریوم (4 مورد، 8/14 درصد)، رایزوکتونیا (2 مورد، 4/7 درصد)، تریکوفیتون (1 مورد، 7/3 درصد) و مخمر (1 مورد، 7/3 درصد) بود. جنس دو گونه از قارچ­ها (2 مورد، 4/7 درصد) نیز شناسایی نشد و در 3 نمونه (1/11 درصد) نیز رشد میکروارگانیسم­ها مشاهده نشد. بررسی نوار­های جذبی طیف­های ATR - FTIR نمونه­های کشت­یافته، گویای برخی تفاوت­های ساختاری در بین میکروارگانیسم­ها (قارچ، مخمر، باکتری) و نیز در سطح جنس و بعضاً گونه­ی قارچ­ها بود .   بحث و نتیجه ‏ گیری: فعالیت قارچ­ها آسیب­هایی چون تجزیه، هیدرولیز و تخریب ساختار چرم و تانن­های گیاهی، تغییرات بصری و نیز مشکلات متعدد برای افرادی که با این آثار در تماس­اند را در پی دارد. از این­رو، حذف این عوامل و درمان مناسب آثار، برای جلوگیری از گسترش آسیب به ساختار چرم، امری ضروری است. بررسی ساختار قارچ با استفاده از طیف­سنجی ATR - FTIR نتایج مناسبی در مورد امکان تفکیک قارچ، مخمر و باکتری به­دست داد. FTIR ، ابزاری کمابیش مناسب برای تفکیک و شناسایی آسان و سریع میکروارگانیسم­ها و جنس­های مختلف قارچ است. همچنین، در برخی موارد امکان تفکیک در سطح گونه نیز وجود دارد. مزایای این روش در مقایسه با روش­های معمول دیگر، FTIR را به ابزاری مناسب در بررسی قارچ­ها در مقیاس بزرگ تبدیل می­کند. از این­رو طیف­سنجی IR در کنار سایر روش­های معمول شناسایی، بهبود بهره­وری در طبقه­بندی و شناسایی قارچ­ها را در پی دارد. علاوه­بر این، با توجه به مشخص کردن ترکیب شیمیایی در این روش، می­توان از آن در درک بهتر فرآیندهای شیمیایی پیچیده در رشد قارچ و تخریب بستر، استفاده کرد .  

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Differentiation and identification of fungi by ATR-FTIR method in a leather collection relating back to Seljuk period

نویسندگان [English]

  • Alireza Koochakzaei 1
  • Hosseyn Ahmadi 2
  • Mohsen Mohammadi Achachluei 1
1 Ph.D. student student of conservation and restoration of historic and cultural property, Art University of Isfahan, Iran
2 Assistant Professor of conservation and restoration of historic and cultural property, Art University of Isfahan, Iran
چکیده [English]

  Introduction: Biodegradation is one of the main degrading factors of leather artifacts. Determination of fungi and other microorganisms has vital importance for conservation of valuable objects made from organic materials. Usual classic techniques for identification of pathogens and fungi have some difficulties, but FTIR spectroscopy has been introduced as useful technique for characterization and determination of microorganisms .   Materials and methods: In this study, historic leathers were related to the Seljuk period. The leathers were sampled in laboratory and fungi were cultivated in SDA medium. Genuses of fungi were identified according to macroscopic, microscopic and morphologic characteristics. Microorganisms were analyzed by ATR-FTIR spectrometer and differences of spectral properties were assessed. Spectral properties were assessed according to form and absorption region of peaks. Cluster analysis was used for evaluation of different regions and areas on the measured spectra .   Results: Results showed the presence of Penicillium sp. (9 samples, 33.3%), Aspergillus sp. (5 samples, 18.5%), Cladosporium sp. (4 samples, 14.8%), Rhizoctonia sp. (2 samples, 7.4%), Trichophyton sp. (1 sample, 3.7%) and also one sample of yeast (3.7%). Two species of fungi remained unidentified (7.4%) and there was not any growth in 3 samples (11.1%). Spectral properties indicated to structural differences between microorganisms (fungi, yeast, bacteria). It showed characteristics of fungi genus and species in some cases .   Discussion and conclusion : Active fungi induce decomposition, hydrolysis and decay of leather and its vegetable tannins. The decay leads to aesthetic change and health problems. Therefore, it is necessary to remove of fungi and appropriate treatment of leather artifacts. Application of ATR-FTIR spectroscopy had good results for identification of fungi, yeast and bacteria. Assessments showed the potential of ATR-FTIR spectroscopy for easy and rapid discrimination between microorganisms and specially fungi genus and species in some cases. This study indicated the possibility of developing FTIR–ATR spectroscopy as a reliable method for rapid identification of fungal pathogens. Advantages of the method showed that it was an appropriate technique for fungi evaluation in large scale. IR spectroscopy could help in identification and classification of fungi. Combining the advantages of FTIR spectroscopy with other used routine techniques, might improve the efficiency of fungal classification and identification. Chemical composition of the samples can be simultaneously analyzed. Chemical analysis by FTIR spectroscopy results to better understanding of fungi growth and complex chemical processes during fungal development and substrate degradation .  

کلیدواژه‌ها [English]

  • Historical leather
  • Biodeterioration
  • Fungi
  • ATR-FTIR
  • Spectral properties

مقدمه

آسیب­های زیستی نقش مهمی در تخریب آثار تاریخی از جمله چرم، دارند. در این میان میکروارگانیسم­ها، از مهم­‏ترین عوامل تخریب زیستی هستند (1). گونه­های مختلفی از قارچ و کپک، معمولاً به موادی مانند کاغذ، پارچه، چوب، رنگ­ها و چرم حمله و علایم شناخت مناسبی بر روی اشیاء ایجاد می‏کنند (2). اکثر این قارچ­ها از گونه­های آلرژن شایع هستند و برخی قابلیت تولید مایکوتوکسین[1] را دارند. بنابراین، برای انسان­های در تماس با این آثار، خطرناک هستند (3). آن‏ها از راه استنشاق اسپور سمی و تماس مستقیم پوستی وارد بدن شده و می­توانند باعث بیماری‏های مختلفی شوند (4). همچنین، یکی دیگر از نگرانی­های اصلی در زمینه­ی کلونیزاسیون قارچی، تغییرات در ویژگی­های بصری از طریق تغییر رنگ به‏وسیله­ی اسید­های ضعیف تولید شده توسط قارچ و یا تجمع رنگدانه­ها که ایجاد لکه­های مختلفی می­کند، است (5). همه آثار چرمی دارای ساختاری پروتئینی هستند، که شرایط مناسبی برای رشد قارچ­های پروتئولیتیک[2] دارند که به تجزیه ساختار چرم و صدمات جبران ناپذیر به آن‏ها منجر می­شود (6). تخریب زیستی مواد آلی به­عنوان یک فرآیند بازیافت بسیار با اهمیت است، اما در مورد آثار موزه­ای، این فرآیند آسیب به مستندات تاریخی را در بر دارد و موجب از دست دادن اطلاعات با ارزشی می­شود (7). بنابراین، شناخت قارچ‏های موجود بر چرم و سایر آثار تاریخی، در درک بهتر صدمات و خسارات احتمالی ناشی از آن‏ها، که زمینه­ساز انتخاب راهکار صحیح برخورد با اشیاء است، ضرورت و اهمیت دارد. در ارتباط با بررسی قارچ­های آسیب­رسان در آثار تاریخی چرمی و آسیب­های زیستی ناشی از آن‏ها گزارش­هایی منتشر شده­است (1، 2، 8-10). در این میان، آسپرژیلوس و پنی­سیلیوم از شایع­‏ترین کپک­ها در ارتباط با کپک­زدگی چرم و کاغذ پوست معرفی شده­اند (11). با این حال کپک­های دیگری نیز وجود دارند که به تخریب اشیاء پوستی منجر می­شوند (12 و 13). فعالیت میکروارگانیسم­ها محدود به قارچ­ها و کپک­ها نیست و گروهی از باکتری­ها همچون اﺳﺘﺮﭘﺘﻮﻣﺎﯾــﺴﺖ­ها[3] نیز، نقش مهمی در تخریب آثار دارند (14). روش­های معمول شناسایی پاتوژن­ها و قارچ­ها، بسته به نوع روش، معمولاً همراه با مشکلاتی چون حساسیت کم، زمان­بر بودن، هزینه­ی بالا و عدم شناسایی گونه­های جدید است و به­طور معمول در تعداد نمونه­های زیاد قابل استفاده نیستند (15- 18). در میان روش­های پیشنهادی برای بررسی سریع، روش­های زیست­شناسی مولکولی[4] به­عنوان روش­های سریع و حساس برای شناسایی درنظر گرفته می­شوند. اما این روش­ها هنوز در مقیاس بزرگ کارآمد نیستند (16 و 18). در این بین تشخیص و شناسایی میکروارگانیسم­ها با استفاده از روش­های اسپکتروسکوپی[5] به­دلیل حساسیت، سرعت، هزینه­ی پایین، سادگی روش و عدم استفاده از ترکیبات مضر شیمیایی قابل بررسی و مطالعه است (16 و 19). طیف­سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه (FTIR) از جمله تکنیک­های طیف­سنجی در بررسی ساختاری مواد است که با توجه به میزان جذب پرتو­های عبوری مادون قرمز بر اساس ارتعاش مولکولی پیوندهای موجود در ساختار مواد (به ویژه ترکیبات آلی)، می­تواند برای ارزیابی ساختاری به­کار رود. با توجه به مشخص­شدن ویژگی­های ساختاری و مولکولی در این شیوه، از این روش می­توان در ابعاد گسترده­ای از علوم زیستی برای دستیابی به اهداف مختلف، استفاده کرد. از جمله روش‏های این طیف­سنجی شیوه­ی انعکاسی یا طیف­بینی انعکاس کل تضعیف­شده تبدیل فوریه مادون قرمز (ATR-FTIR[6]) است که به ارزیابی پرتوهای انعکاس یافته از نمونه می­پردازد. یکی از مزایای این شیوه نسبت به روش عبوری، حداقل مراحل مورد نیاز برای آماده‏سازی نمونه و نیز ارزیابی نمونه­های مختلف که امکان ثبت طیف عبوری آن‏ها وجود ندارد، است. طیف FTIR از هر ترکیب شناخته شده، اثر انگشت منحصر به فردی را ارائه می­کند (20). از این­رو بر اساس برخی مطالعات، طیف­سنجی FTIR به­عنوان روشی موفق در تشخیص و شناسایی میکروارگانیسم­ها مطرح شده­است (17 و 21). از این روش در موارد گوناگونی همچون تشخیص و شناسایی سلول­های سرطانی (22 و 23)، سلول­های آلوده به ویروس (24) و میکروارگانیسم­ها همچون قارچ­ها (16، 18، 19، 25-30) استفاده شده است. این روش، شیوه­ای سریع در تفکیک قارچ­ها در سطح جنس است (18) و در برخی موارد نیز امکان تفکیک در سطح گونه نیز وجود دارد (31 و 32). در راستای آنچه گفته شد، تعدادی شیء چرمی تاریخی مربوط به دوره­ی سلجوقی (با قدمتی حدود 800 سال) با هدف شناسایی قارچ­های موجود بر روی آن‏ها بر اساس ویژگی‏های ماکروسکوپی، میکروسکوپی و ریخت‏شناسی بررسی شدند. پس از شناسایی، برخی از آن‏ها با هدف امکان­سنجی تفکیک و شناسایی میکروارگانیسم­ها به­وسیله­ی طیف­بینی انعکاس کل تضعیف­ شده تبدیل فوریه مادون قرمز (ATR-FTIR) بر اساس ویژگی‏های ساختاری، ارزیابی شدند.

مواد و روش­ها

در این بررسی نمونه­هایی مربوط به یک مجموعه شیء چرمی شامل: مشک، کفش و بقایایی از خز، پوست و سایر اشیاء چرمی که در جریان آواربرداری سال 1385 محوطه­ی تاریخی قلعه­کوه قاین در استان خراسان جنوبی کشف شده­بود، مطالعه شد. این آثار که منسوب به دوره­ی سلجوقی­اند (قرن 11 تا 13 میلادی)، از زمان کشف تا کنون، تحت مالکیت سازمان میراث فرهنگی، صنایع دستی و گردشگری استان خراسان جنوبی واقع در بیرجند، هستند. برای شناسایی نوع قارچ، از روش کشت در محیط سابورو دکستروز آگار (SDA؛ محصول شرکت کیولب[7] کانادا) استفاده­شد. شیوه­ی تهیه، مطابق روش پیشنهادی تولید کننده (65 گرم در هر لیتر) بود. روش کشت، بر اساس اصول مطرح شده در استانداردهای ملی ایران، شماره­ی 9899 و 3194 بود (33 و 34). ابزار و محل نمونه برداری، با استفاده از آب ژاول، اتانول و اشعه­ی UV، و محیط کشت تهیه شده در اتوکلاو با دمای 121 درجه سانتی‏گراد‏‏ و فشار psi 20 به مدت 15 دقیقه استریل شدند. نمونه­ها پس از کشت، به مدت 18 روز در دمای 28 درجه سانتی‏گراد‏‏ و رطوبت نسبی 70 درصد، قرار گرفتند. شایان ­ذکر است محفظه انکوباتور نیز پیش از قرار‏گیری نمونه­ها، ضد عفونی شده ­بود. برای شناسایی قارچ­ها، ویژگی‏های ماکروسکوپی آن‏ها از جمله شکل، رنگ و سرعت رشد کلونی بررسی شدند. پس از آن ویژگی‏های میکروسکوپی شامل: صفات ریخت‏شناسی و ویژگی‏های ظاهری قارچ­ها با میکروسکوپ نوری (مدل BK-POL/BK-POLR ساخت کمپانی آلشن[8] کشور چین) بررسی شد. پس از شناسایی جنس قارچ­ها، نمونه‏هایی به­شکل جامد و از هر دو بخش میسلیوم و اسپور مورد مطالعه FTIR قرار گرفتند. برای بررسی ساختاری از دستگاه طیف­سنج تبدیل فوریه مادون قرمز[9] مدل نیکولت نکسوز 470[10] ساخت شرکت ترمو نیکولت[11] آمریکا، متصل به نرم­افزار OMNIC، مجهز به ابزار ثبت انعکاسی (ATR)[12] با سطح آنالیزور کریستال ZnSe، به­روش ATR، استفاده شد. محدوده­ی مورد بررسی 600 تا cm-14000 و طیف­ها حاصل 32 پیمایش با تفکیک­پذیری cm-14 بودند. قبل از هر آزمون، دستگاه با طیف هوا به­عنوان زمینه، کالیبره می­شد. سپس طیف­ها به­منظور سنجش امکان تفکیک و شناسایی جنس­ها و گونه­های مختلف قارچ و نیز سایر میکروارگانیسم­ها بر اساس شکل و موقعیت پیک­ها ارزیابی شدند. علاوه ­بر این تحلیل خوشه­ای به روش وارد[13] نیز بر اساس مساحت زیر نمودار طیف­ها در 4 محدوده­ 2800 تا cm-13000، 1485 تا cm-11780،
1185 تا cm-11485 و 900 تا cm-11185 و همچنین موقعیت قرارگیری کلیه­ی پیک­ها، پس از تصحیح خط زمینه[14]، ارزیابی شد. در این راستا از ویرایش 19 برنامه SPSS استفاده­شد.

 

نتایج

شناسایی قارچ­ها و تأثیرات آن‏ها

در مجموع از آثار مورد بررسی،23 نمونه­ قارچ همراه یک نمونه مخمر جداسازی شد. جدایه‏های بررسی شده، بر اساس نتایج حاصل از بررسی ویژگی‏های ماکروسکوپی و میکروسکوپی، مربوط به جنس­های پنی­سیلیوم (9 مورد، 3/33 درصد)، آسپرژیلوس (5 مورد، 5/18 درصد)، کلادوسپوریوم (4 مورد، 8/14 درصد)، رایزوکتونیا (2 مورد، 4/7 درصد) و تریکوفیتون (1 مورد، 7/3 درصد) و همچنین مخمر (1 مورد، 7/3 درصد) بود. جنس دو گونه از قارچ­ها (2 مورد، 4/7 درصد) نیز شناسایی نشد. علاوه بر موارد ذکر شده، در 3 نمونه (1/11 درصد) نیز رشد میکروارگانیسم­ها مشاهده نشد. نتایج حاصل از بررسی ماکروسکوپی و میکروسکوپی قارچ­ها و شناسایی جنس آن‏ها، در جدول 1 ذکر شده­است. موارد مشخص شده در این جدول، مورد طیف­سنجی ATR-FTIR قرار گرفتند. علاوه بر نمونه‏های ذکر شده در جدول، در 16 نمونه دیگر، کلونی باکتری تشکیل شد و از بین این موارد نیز دو نمونه بررسی شد.

 

جدول 1- قارچ­های شناسایی شده بر روی نمونه­های چرم

جنس قارچ

کد نمونه چرم

تعداد

1-A

1-B

1-C

4-C

4-C-1

5-B

9-A

9-B

9-C

10

Cs-A

Cs-A-G

Cs-B-Z

Cs-C-Z

Cs-E

Cs-F

Sh-2

Sh2-5

2R-SH2

SH2 Tri

پنی­سیلیوم

*

*

*

*

*

*

*

 

 

*

 

 

 

 

 

 

 

 

*

 

9

آسپرژیلوس

 

 

 

 

 

 

 

 

*

 

 

*

*

*

 

*

 

 

 

 

5

کلادوسپوریوم

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

*

 

 

*

 

*

*

 

 

4

رایزوکتونیا

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

*

 

 

 

*

 

 

 

 

 

2

تریکوفیتون

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

*

1

مخمر

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

*

 

 

 

 

 

 

 

 

1

شناسایی نشد

 

 

 

 

 

 

 

*

 

 

 

*

 

 

 

 

 

 

 

 

2

 

در بین قارچ­های شناسایی شده، بیش­تر گونه­ها مربوط به دو جنس آسپرژیلوس و پنی­سیلیوم است، که با توجه به همه­جایی بودن این دو جنس، قابل توجیه است (36). در گزارش­های منتشر شده نیز، معمولاً بیش­‏ترین درصد قارچ­ها را در آرشیو و موزه­ها دارا هستند (1، 37 و 38). در آثار چرمی و پوستی، کلاژن و کراتین، بخش اعظم پروتئین موجود در ساختار آن‏ها را شامل می­شود. این قارچ­ها با تولید آنزیم­های پروتئاز (39-43) به تجزیه ساختار پروتئینی چرم منجر می­شوند. پروتئازهایی مانند کلاژنازها و کراتینازهای حاصل از آسپرژیلوس و پنی‏سیلیوم را می­توان از عوامل شایع در آسیب آثار بررسی شده دانست (44). فعالیت قارچ­ها به تجزیه پروتئین­ها به آمینو اسیدها منجر می­شود و برخی از اسید­های آلی را تولید می­کند؛ که نتیجه­ی آن هیدرولیز الیاف کلاژن و تخریب چرم است (شکل 1).

 

 

 

شکل 1- چپ: بقایای لنگه کفشی چرمی (SH2 Tri) ؛ a: کلونی­های سفید تشکیل شده بر روی سطح چرم مربوط به قارچ تریکوفیتون؛
b: لکه­های قرمز ایجاد شده توسط فعالیت قارچ؛ راست: شکل [15]SEM از مقطع عرضی لکه­های قرمز با بزرگنمایی 5000 برابر که نشان­دهنده­ نفوذ قارچ به لایه­های زیرین چرم و تخریب شدید الیاف کلاژن است که به­شکل کاهش استحکام و پودری شدن الیاف سطحی چرم دیده می­شود (آرشیو نگارنده)

 

 

همچنین قارچ­ها و باکتری­ها چه در شرایط هوازی و غیر هوازی، جدا از هیدرولیز و تخریب الیاف کلاژن، هیدرولیز تانن­های گیاهی را نیز در پی دارند. به­عنوان مثال، کاتشین[16] که از مهم­‏ترین تانن­های گروه متراکم[17] شونده است، تحت تأثیر قارچ­ها و باکتری­ها هیدرولیز شده، که نتیجه­ی آن تشکیل اسید­های آلی است. نتیجه فعالیت در شرایط بی­هوازی، هیدرولیز کاتشین و تشکیل متابولیت­های اسیدی[18] است. در شرایط هوازی نیز ترکیباتی چون بتا-کتوآدیپات[19]، پروتوکاتکوئیک[20]، ﻓﻠﻮروﮔﻠﻮﺳﻴﻨﻮل کربوکسیلیک اسید[21] و کاتکول[22]تولید می­شود که در نهایت به تشکیل سیتریک اسید و پروئیک اسید منجر می­شوند (45-50). تشکیل این اسید­ها افزایش شدت هیدرولیز در الیاف کلاژن را نیز در پی دارد. این قارچ­ها علاوه بر تخریب ساختار چرم، سمومی را تولید می­کنند که می­تواند برای افرادی که در تماس با آن‏ها هستند، مضر باشد. این قارچ­های آلرژی­زا با توجه به قابلیت تولید مایکوتوکسین (2، 3 و 35) مشکلات متعددی را برای افراد ایجاد می­کنند و از راه استنشاق اسپور سمی و تماس مستقیم پوستی وارد بدن شده و می­توانند باعث بیماری­های مختلفی شوند (4). آسپرژیلوس قابلیت تولید زهرابه­های آفلاتوکسین [23]B1، G1 و M1، اکراتوکسین A[24]، پاتولین[25]، استریگما توسیستین[26] و سیکلوپیازونسور[27] و پنی­سیلیوم توانایی تولید اکراتوکسین A، سیترینین[28]، پاتولین، سیکلوپیازونسور و پنیترم A[29]، را دارد. همچنین کلادوسپوریوم می­تواند فاگی کلادوسپوریک اسید[30] و اپی­کلادوسپوریک اسید[31] تولید کند (51 و 52). قارچ‏های جنس کلادوسپوریوم و پنی­سیلیوم به­عنوان عوامل ایجاد آسم شناخته شده­اند و جنس آسپرژیلوس عامل طیف وسیعی از بیماری­هایی است که تحت عنوان آسپرژیلوزیس[32] شناخته می­شود (53).

تفکیک بر اساس شکل و موقعیت پیک در طیف ATR-FTIR

شکل 2، دیاگرام ATR-FTIR، مربوط به قارچ (کد نمونه­ی P8 در جدول 2) را نشان می­دهد. در این دیاگرام، برخی از مهم­ترین گروه­های عاملی موجود در ساختار قارچ مشخص شده­است. باندهای جذبی
cm-11642 (Amide I)، cm-11550 (Amide II) (30 و 54)، cm-11315 (Amide III)­(18) ، cm-11453 (CH3) (16)  و cm-11417 (C-N) (18)  مربوط به ترکیبات پروتئینی موجود در قارچ است. جذب­هایی در  محدوده­ی cm-11730 (C=O) (16 و 54) ، 2856 و
 cm-12930 (CH2 و CH3) (18، 30 و 55) اشاره به ساختار چربی­های قارچ دارد. پیک­های موجود در
1076 و cm-11243 مربوط به PO2 در فسفولیپید­ها (16, 19 و 54) و یا اسیدهای نوکلئیک (18) است. همچنین، پیک­های 1034 و cm-1 1152 اشاره به C-O در کربوهیدرات­ها (پلی ساکاریدها) دارند (18 و 56). در این محدوده، بتا (3-1) پلی­ساکاریدها[33]
در حدود 1150، 1100 و cm-11078،
بتا (3-1) گلوکان[34] در cm-11035، گالاکتومانان­ها[35]، بتا (3-1) پلی ساکاریدها در cm-11015، بتا (6-1) گلوکان­ها[36] در cm-1990 و مانان­ها[37] در حدود
cm-1965 جذب­هایی را دارند (18). طیف جذبی در cm-13372 به OH آب (18) مربوط است و cm-11378 نیز اشاره به پیوند C-H در CH2 (16) دارد. همچنین جذب در حدود cm-11209 اشاره به C-C-N دارد (16).

 

 

شکل 2- گروه­های عاملی کلی موجود در طیف ATR-FTIR قارچ (پنی­سیلیوم) در محدوده­ی cm-1 4000-600، پس از تصحیح خط زمینه

 

در شکل 3، تفاوت­های ساختاری بین قارچ، مخمر و باکتری بر اساس تفاوت در نوارهای جذبی طیف
ATR-FTIR ارزیابی شده است. تفاوت واضحی میان نوار جذبی باکتری (رنگ قرمز) با طیف­های مخمر و قارچ به ویژه در بازه­ی 900 تا cm-11200 مربوط به ترکیبات پلی­ساکارید (29) وجود دارد. همچنین شدت جذب در محدوده­ی 2800 تا cm-13000 برای گروه­های CH2 و CH3 بسیار کاهش یافته است. تفکیک نوارهای جذبی ATR-FTIR مربوط به مخمر و قارچ کمی مشکل­تر است. مطابقت طیف مخمر با طیف­های جذبی کلیه قارچ­های بررسی شده، گویای کاهش شدید شدت جذب مخمر در حدود 1075 تا cm-11080 نسبت به قارچ­هاست. این طیف اشاره به بتا (3-1) پلی­ساکاریدها در دیواره­ی سلولی قارچ­ها و یا گروه عاملی PO2 در فسفولیپید و نوکلئیک اسیدها دارد.

 

شکل 3- مقایسه نوار جذبی طیف ATR-FTIR قارچ، مخمر و باکتری

 

بررسی طیف ATR-FTIR گونه­هایی از جنس­های رایزوکتونیا، کلادوسپوریوم، آسپرژیلوس، پنی­سیلیوم و تریکوفیتون در شکل 4، نشان از برخی تفاوت­های ساختاری در نوارهای جذبی جنس­های مختلف قارچ دارد. در کلادوسپوریوم، در حدود cm-1997 (برای پلی­ساکاریدها) بر خلاف جنس­های دیگر جذبی نمی‏توان مشاهده کرد و در تریکوفیتون جذب مربوط به گالاکتومانان­ها و بتا (3-1) پلی­ساکاریدها در دیواره­ی سلولی، در حدود cm-11010 دیده ­می­شود. علاوه بر این، نوار جذبی قارچ تریکوفیتون از نظر شکل و شدت جذب، به روشنی با جنس­های دیگر، متفاوت است. نمونه­ی آسپرژیلوس نیز با داشتن دو جذب مشخص در 1222 و cm-11349 که در نمونه­های دیگر چندان قابل مشاهده نیست و عدم مشاهده­ی دو جذب در حدود 1315 و cm-11378 بر خلاف سایر نمونه­ها، از قارچ­های دیگر تفکیک پذیر است. همچنین شدت جذب حدود cm-11450 در آسپرژیلوس کاهش قابل توجهی دارد. در نمونه­ی رایزوکتونیا، جذب در cm-11378، شدت آن افزایش یافته و همچنین در cm-11325 طیف جذبی مربوط به پلی­ساکاریدها نسبت به سایر قارچ­ها شکلی شارپ­تر و نوک تیزتر دارد، که در دیگر نمونه­ی بررسی شده نیز (کد نمونه Rh2 در جدول 2)، قابل مشاهده بود و علاوه بر آن سایر قارچ­ها این جذب را در حدود    cm-11035 نشان می­دهند. تفاوت­های جزئی دیگری نیز همچون cm-11743 برای C=O در کلادوسپوریوم و برخی موارد دیگر نیز قابل مشاهده است. براساس ویژگی‏های ماکروسکوپی در نمونه­های جنس کلادوسپوریوم، احتمالاً سه گونه با ویژگی­های کلونی متفاوت وجود دارد. شکل 5، طیف‏های ATR-FTIR این قارچ­ها را نشان می­دهد. براساس ویژگی‏های ماکروسکوپی، Cla1 و Cla2 مربوط به یک گونه، Cla3 نیز گونه­ای دیگر و همچنین Cla4 و Cla5 نیز احتمالاً متعلق به گونه­ی دیگری از جنس کلادوسپوریوم هستند. بر این اساس، طیف­های
 ATR-FTIR این قارچ­ها را نیز می­توان به سه دسته مبنی بر تفاوت­ها و تشابهات نوار جذبی تقسیم کرد. Cla1 و Cla2 در cm-11204، Cla4 و Cla5 به ترتیب در
1212 و cm-11211 دارای جذبی با شدت کم­تر هستند؛ و در Cla3، شکل پیک در این ناحیه کاملاً متفاوت شده و با طیف مجاور دچار هم‏پوشانی شده‏است. Cla1,2 هر دو در cm-11251.4، Cla3 در cm-11241 و Cla3,4 در cm-11247 دارای جذب هستند. در حدود cm-11355 نیز نوارهای جذبی Cla1,2 از طیف­های 3 نمونه­ی دیگر کاملاً متمایز است، علاوه بر این، طیف C=O در این دو نمونه در حدودcm-11745 مشخص است، اما در Cla3 چندان قابل مشاهده نیست و در Cla4,5 نیز از لحاظ شدت و شکل پیک متمایز از گروه اول است.     Amide I، در Cla1,2 در 1641 و cm-11640، Cla3
در cm-11631 و Cla4,5 در cm-11639 دارای جذب است.

در این پژوهش، بررسی به­منظور تفکیک گونه­های مختلف پنی­سیلیوم نیز بر اساس ویژگی­های میکروسکوپی و ماکروسکوپی و تلفیق با نوارهای جذبی طیف­های ATR-FTIR انجام شد، که نتایج چندان قابل استناد نبود و نیاز به بررسی­های بیش­تر محسوس است.

 

تحلیل خوشه­ای بر اساس مساحت زیر نمودار
 
ATR-FTIR

در شکل 6، نمودارهای مربوط به تحلیل خوشه­ای طیف­های قارچ­ها بر اساس مساحت زیر نمودار در چهار بازه­ی مختلف را می‏توان مشاهده کرد. نمونه­ها در این نمودارها، مطابق جدول 2، کد ­گذاری شده­اند.

 

 

شکل 4- طیف­های ATR-FTIR قارچ­هایی از جنس (از بالا به پایین) تریکوفیتون، پنی­سیلیوم، آسپرژیلوس، کلادوسپوریوم و رایزوکتونیا

 

 

شکل 5- طیف­های ATR-FTIR از گونه­هایی از قارچ کلادوسپوریوم

 

 

 

 

جدول 2- کد میکروارگانیسم­های مورد بررسی ATR-FTIR، بر اساس نوع و جنس آن‏ها

 

نوع و جنس

پنی­سیلیوم

آسپرژیلوس

کلادوسپوریوم

رایزوکتونیا

تریکوفیتون

مخمر

شناسایی نشد

باکتری

کد نمونه

P1

P2

P3

P4

P5

P6

P7

P8

P82

P9

Asp

Cla1

Cla2

Cla3

Cla4

Cla5

Rhi1

Rhi2

Tri

Yea

Un1

Un2

Ba1

Ba2

                                                 

 

 

با توجه به تعداد نمونه­های هر گروه از قارچ­ها، هدف از خوشه­بندی بیش­تر تفکیک کلادوسپوریوم و پنی­سیلیوم است. در مورد سایر قارچ­ها، با توجه به تعداد محدود آن‏ها که در حدود 1 یا 2 نمونه است، تفکیک به این روش ممکن نیست. با وجود این، ارزیابی در محدوده­ی 2800 تا cm-1 3000، امکان جداسازی قارچ‏های کلادوسپوریوم را تا حدودی فراهم می­آورد. این محدوده که به گروه­های CH2 و CH3 مربوط است، در نمونه­های کلادوسپوریوم، تقریباً مساحت بیش­تری را نسبت به قارچ پنی­سیلیوم در بر می­گیرد و با در نظر گرفتن میزان بیش­تر C=O در محدوده­ی cm-11740 در نمونه­های کلادوسپوریوم (شکل 4)، می­توان عنوان کرد که میزان چربی در قارچ کلادوسپوریوم به مراتب بیش‏تر از پنی­سیلیوم است. باکتری­ها نیز با توجه به ­نتایج حاصل، در بازه­های 2800 تا cm-1 3000 و 1185تا
cm-1 1485 از جنس­های مختلف قارچ تفکیک‏پذیر هستند و در محدوده­ی 900 تا cm-1 1185 به طور کامل از قارچ­ها و مخمرها جداسازی شده­اند. این بازه به ترکیبات پلی­ساکاریدی مربوط است که در ساختار باکتری میزان آن بسیار کم­تر از قارچ و مخمر است و می­تواند در تفکیک آن‏ها استفاده شود.

 

B

 

A

D

 

C

شکل 6- نتایج تحلیل خوشه­ای بر اساس مساحت زیر نمودار طیف­های ATR-FTIR، پس از تصحیح خط زمینه در چهار محدوده­ی
 (A) 2800 تا cm-13000، (B) 1485تا cm-11780، (C) 1185 تا cm-11485 و (D) 900 تا cm-11185


تحلیل خوشه­ای بر اساس موقعیت پیک در طیف­های ATR-FTIR

شکل 7، نمودار تحلیل خوشه­ای بر اساس عدد موجی پیک­های مربوط به آزمون ATR-FTIR نمونه‏های قارچ و دیگر میکروارگانیسم­ها را نشان می‏دهد. در این بررسی، باکتری­ها به طور کامل از سایر میکروارگانیسم­های بررسی شده تفکیک‏پذیر هستند و قارچ تریکوفیتون نیز در خوشه­ای مجزا نسبت به سایر قارچ­ها قرار گرفته­است. نمونه­های پنی­سیلیوم نیز به جز کد نمونه­ی P9، در خوشه­های مشابه قرار دارند که نشان دهنده­ی امکان تفکیک این قارچ به­این شیوه­است. اما در مورد قارچ کلادوسپوریوم، گونه­های این قارچ در دو دسته­ی مجزا قرار دارند. با وجود این، گونه­های مشابه Cla1,2 و Cla4,5، خوشه­هایی مشابه دارند، که نشان دهنده­ی تفکیک­پذیری این قارچ در سطح گونه است. در این بررسی، مخمر و آسپرژیلوس نیز، تا حدودی نسبت به سایر قارچ­ها تفکیک‏پذیر هستند. اما در این نمودار، با وجود تشابه قارچ­های رایزوکتونیا، امکان تفکیک آن‏ها از جنس پنی­سیلیوم امکان پذیر نیست.

 

 

شکل 7- نتایج تحلیل خوشه­ای بر اساس عدد موجی مربوط به پیک­های ATR-FTIR در محدوده­ی 600 تا cm-14000

 


بحث و نتیجه­گیری

آثار چرمی با ارزشی در گذر زمان، باقی مانده­ و امروزه در بسیاری از موزه­ها و آرشیو­ها دیده می­شوند. ساختار چرم بسیار آسیب­پذیر بوده و از این رو سرعت تخریب آن نسبت به بسیاری از آثار دیگر، بیش­تر است. عوامل متعددی در تخریب آثار چرمی دخیل­اند؛ که دسته­ی مهمی از آن‏ها عوامل زیستی و به ویژه قارچ­ها هستند. بررسی اشیاء چرمی قلعه­کوه قاین، نشان­دهنده­ی فعالیت قارچ­هایی از جنس پنی­سیلیوم، آسپرژیلوس، کلادوسپوریوم، رایزوکتونیا و تریکوفیتون و نیز باکتری و مخمر بود. این قارچ­ها با توجه به تولید زهرابه­های گوناگون، توانایی ایجاد مشکلات و بیماری­های گوناگونی را برای کارکنانی که با این اشیاء در ارتباطند دارند. از طرفی فعالیت این قارچ­ها که همراه با تولید آنزیم­های پروتئاز است، موجب تخریب چرم شده و جدا از آسیب­های ساختاری چون تجزیه و هیدرولیز الیاف، در ویژگی­های ظاهری اثر نیز تأثیر می­گذارند. میکروارگانیسم­ها علاوه بر ساختار کلاژن، تانن­های گیاهی را نیز تخریب می­کنند که معمولاً محصول نهایی آن، اسیدهای آلی است. این اسید­های آلی، که حاصل فعالیت قارچ بر روی چرم است، هیدرولیز اسیدی زنجیره­های کلاژن چرم را در پی دارد. هر چند شرایط مخازن، محیط ایده آل رشد قارچ نیست، اما این عوامل قابلیت فعالیت آرام، اما پیوسته را دارند؛ که نتیجه­ی آن، از دست دادن اطلاعات و آثار ارزشمند تاریخی است. از این­رو، نتایج حاصل می­تواند در انتخاب راهکار مناسب درمانی برای این آثار، مفید واقع شود. بررسی ساختار قارچ با استفاده از طیف­سنجی ATR-FTIR و بر اساس شکل و موقعیت پیک، نتایج مناسبی در مورد امکان تفکیک قارچ، مخمر و باکتری عرضه کرد. باکتری­ها در محدوده 900 تا cm-11200 مربوط به پلی‏ساکاریدها و 2800 تا cm-13000 برای CH2 و CH3 با قارچ­ها و مخمر­ها تفاوت واضحی دارد. همچنین شدت جذب در حدود 1075 تا cm-11080 مربوط به بتا (3-1) پلی­ساکاریدها در دیواره­ی سلولی و یا گروه عاملی PO2 در فسفولیپید و نوکلئیک اسیدها در مخمر نسبت به قارچ کاهش یافته­است. بررسی جنس­های رایزوکتونیا، کلادوسپوریوم، آسپرژیلوس، پنی­سیلیوم و تریکوفیتون، برخی تفاوت­های ساختاری در بازه­ی 900 تا cm-11750 را نشان می­دهد. همچنین در برخی موارد، بر اساس موقعیت و شکل پیک، امکان تفکیک گونه‏های قارچ نیز، وجود دارد. در موارد بررسی شده، این روش در تفکیک گونه­های مورد بررسی جنس کلادوسپوریوم عملکرد مناسبی از خود نشان داد. بر اساس نتایج تحلیل آماری مساحت زیر نمودار به روش خوشه­ای نیز می­توان گفت، این شیوه به ­سبب تفاوت در میزان چربی در جنس­های پنی­سیلیوم و کلادوسپوریوم، تا حدودی می­تواند در تفکیک آن‏ها، در محدوده­ی 2800 تا cm-13000 مورد استفاده قرار گیرد و عملکرد مناسبی در تفکیک قارچ و باکتری به ویژه در ناحیه 900 تا cm-11185 مربوط به پلی­ساکاریدها دارد. اما تحلیل آماری خوشه­ای بر اساس عدد موجی مربوط به پیک­ها، عملکرد مناسب­تری در تفکیک قارچ­ها و سایر میکروارگانیسم­ها از خود نشان داد. در این شیوه تفکیک­پذیری تعداد بیش­تری از قارچ­ها ممکن بود. جدا از آن، نمونه­های P8 و P82 که به یک کلونی مربوط هستند، در این شیوه، تشابه بیش­تری را نسبت به ارزیابی مساحت زیر نمودار نشان می­دهند. از این رو، می­توان FTIR را در کنار سایر روش­های شناسایی، به عنوان ابزاری کمابیش مناسب برای تفکیک آسان و سریع قارچ و دیگر میکروارگانیسم­ها، به­کار برد. سادگی در آماده­سازی نمونه، اجتناب از استفاده از مواد شیمیایی با توجه به هزینه و اثرات منفی زیست محیطی آن‏ها، قابل اطمینان بودن نتایج، زمان کوتاه در هر تحلیل در مقایسه با روش­های معمول دیگر، روش
ATR-FTIR را به ابزاری مناسب در بررسی قارچ­ها در مقیاس بزرگ تبدیل می­کند. با وجود این نمی­توان تنها با استناد به نتایج این شیوه در ارتباط با قارچ­ها و سایر میکروارگانیسم­ها اظهار نظر کرد و به نظر می­رسد نتایج این روش در ارتباط با شناسایی و تفکیک میکروارگانیسم­ها، تنها در تلفیق با سایر روش­های شناسایی قابل بررسی و بحث است. از این­رو طیف‏سنجی IR در کنار سایر روش­های معمول مورد استفاده، بهبود بهره­وری در طبقه­بندی و شناسایی قارچ­ها را در پی دارد. علاوه ­بر این، با توجه به ­مشخص کردن ترکیب شیمیایی در این تحلیل، می­توان از آن در درک بهتر فرآیندهای شیمیایی پیچیده در رشد قارچ و تخریب بستر، استفاده کرد.

تشکر و قدردانی

نگارندگان بر خود لازم می­دانند از کارکنان اداره کل میراث فرهنگی، صنایع دستی و گردشگری خراسان جنوبی، به ویژه جناب آقای مهندس محمدعلی بزرگمهر به­سبب در اختیار قرار دادن نمونه­های مورد بررسی، کمال تشکر را داشته باشند.



[1]. Mycotoxin

[2]. Proteolytic

[3]. Streptomycetes

[4]. Molecular biology methods

[5]. Spectroscopic techniques

[6]. Attenuated Total Reflectance Fourier Transform Infrared

[7]. Quelab

[8]. Alltion

[9]. FTIR Spectrometer

[10]. Nicolet Nexus 470

[11]. Thermo Nicolet

[12]. PIKE MIRacle attenuated total reflectance (ATR)

[13]. Ward’s algorithm

[14]. Baseline correction

[15]. Scanning Electron Microscope

[16]. Catechin

[17]. Condensed Tannins

[18]. Acid metabolites

[19]. β-ketoadipate

[20]. Protocatechuic

[21]. Phloroglucinol carboxylic acid

[22].Catechol

[23]. Aflatoxin B1

[24]. Ochratoxin A

[25]. Patulin

[26]. Sterigmatocystin

[27]. Cyclopiazonsaure

[28]. Citrinin

[29]. Penitrem A

[30]. Fagicladosporic acid

[31]. Epicladosporic acid

[32]. Aspergillosis

[33]. β (1→3) polysaccharides

[34]. β (1→3) glucan

[35]. Galactomannans

[36]. β (1→6) glucans

[37]. Mannans

 

References

(1) Mesquita N, Portugal A, Videira S, Rodríguez-Echeverría S, Bandeira AML, Santos MJA, et al. Fungal diversity in ancient documents. A case study on the Archive of the University of Coimbra. International Biodeterioration & Biodegradation 2009; 63 (5): 626-9.

(2) Ebrahimi A, Karimi S, Lotfalian S, Majidi F. Allergenic fungi in deteriorating historic objects of Shahrekord Museum, in Iran. Jundishapur Journal of Microbiology 2011; 4 (4): 261-5.

(3) Milanesi C, Baldi F, Vignani R, Ciampolini F, Faleri C, Cresti M. Fungal deterioration of medieval wall fresco determined by analysing small fragments containing copper. International Biodeterioration & Biodegradation 2006; 57 (1): 7-13.

(4) Bennett JW, Klich M. Mycotoxins. Clinical Microbiology Reviews 2003; 16 (3): 497-516.

(5) Arai H. Foxing caused by Fungi: twenty-five years of study. International Biodeterioration & Biodegradation 2000; 46 (3): 181-8.

(6) Strzelczyk AB. Observations on aesthetic and structural changes induced in Polish historic objects by microorganisms. International Biodeterioration & Biodegradation 2004; 53 (3): 151-6.

(7) Cappitelli F, Sorlini C. From Papyrus to Compact Disc: The Microbial Deterioration of Documentary Heritage. Critical Reviews in Microbiology 2005; 31 (1): 1-10.

(8) Nigam N, Dhawan S, Nair MV. Deterioration of feather and leather objects of some Indian museums by keratinophilic and non-keratinophilic fungi. International Biodeterioration & Biodegradation 1994; 33 (2): 145-52.

(9) Strzelczyk AB, Bannach L, Kurowska A. Biodeterioration of archeological leather. International Biodeterioration & Biodegradation 1997; 39 (4): 301-9.

(10) Pinzari F, Colaizzi P, Maggi O, Persiani AM, Schütz R, Rabin I. Fungal bioleaching of mineral components in a twentieth-century illuminated parchment. Anal Bioanal Chem 2012; 402 (4): 1541-50.

(11) Polacheck I, Salkin IF, Schenhav D, Ofer L, Maggen M, Haines JH. Damage to an ancient parchment document by Aspergillus. Mycopathologia 1989; 106 (2): 89-93.

(12)       Allsopp D, Seal KJ. An Introduction to Biodeterioration. London: Edward Arnold; 1986.

(13) Nigam N, Kushwaha RKS. Biodegradation of keratinous substrates. In: Toishi K, editor. Biodeterioration of Cultural Property 2. Proceedings of the 2nd International Conference on Biodeterioration of Cultural Property; 1992 Oct 5-8; Yokohama, Japan. Tokyo: International Communications Specialists; 1993. p:180-5.

 

(14) Karbowska-Berent J, Strzelczyk A. The Role of Streptomycetes in the Biodeterioration of Historic Parchment. Torün, Poland: Wydawn, Uniwersytetu Mikołaja Kopernika; 2000.

(15) Vaneechoutte M, Van Eldere J. The possibilities and limitations of nucleic acid amplification technology in diagnostic microbiology. Journal of Medical Microbiology 1997; 46 (3): 188-94.

(16). Erukhimovitch V, Tsror L, Hazanovsky M, Talyshinsky M, Mukmanov I, Souprun Y, et al. Identification of fungal phyto-pathogens by Fourier-transform infrared (FTIR) microscopy. Journal of Agricultural Technology 2005; 1 (1): 145-52.

(17) Lamprell H, Mazerolles G, Kodjo A, Chamba JF, Noël Y, Beuvier E. Discrimination of Staphylococcus aureus strains from different species of Staphylococcus using Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy. International Journal of Food Microbiology 2006; 108 (1): 125-9.

(18) Salman A, Tsror L, Pomerantz A, Moreh R, Mordechai S, Huleihel M. FTIR spectroscopy for detection and identification of fungal phytopathogenes. Spectroscopy 2010; 24: 261-7.

(19) Erukhimovitch V, Pavlov V, Talyshinsky M, Souprun Y, Huleihel M. FTIR microscopy as a method for identification of bacterial and fungal infections. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2005; 37 (5): 1105-8.

(20) Naumann D, Helm D, Labischinski H. Microbiological characterizations by FT-IR spectroscopy. Nature 1991; 351 (6321): 81-2.

(21) Gupta MJ, Irudayaraj JM, Debroy C, Schmilovitch Z, Mizrach A. Differentiation of food pathogens using FTIR and artificial neural networks. Transactions of the ASABE 2005; 48 (5): 1889-92.

(22) Rigas B, Laguardia K, Qiao L, Bhandare PS, Caputo T, Cohenford MA. Infrared spectroscopic study of cervical smears in patients with HIV: Implications for cervical carcinogenesis. Journal of Laboratory and Clinical Medicine 2000; 135 (1): 26-31.

(23) Huleihel M, Erukhimovitch V, Talyshinsky M, Karpasas M. Spectroscopic Characterization of Normal Primary and Malignant Cells Transformed by Retroviruses. Appl Spectrosc. 2002; 56 (5): 640-5.

(24) Salman A, Erukhimovitch V, Talyshinsky M, Huleihil M, Huleihel M. FTIR-Spectroscopic method for detection of cells infected with herpes viruses. Biopolymers 2002; 67: 406-12.

(25) Gordon SH, Jones RW, McClelland JF, Wicklow DT, Greene RV. Transient Infrared Spectroscopy for Detection of Toxigenic Fungi in Corn:  Potential for On-line Evaluation. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1999; 47 (12): 5267-72.

(26) Mariey L, Signolle JP, Amiel C, Travert J. Discrimination, classification, identification of microorganisms using FTIR spectroscopy and chemometrics. Vibrational Spectroscopy. 2001; 26 (2): 151-9.

(27) Maquelin K, Kirschner C, Choo-Smith L-P, Ngo-Thi NA, van Vreeswijk T, Stämmler M, et al. Prospective Study of the Performance of Vibrational Spectroscopies for Rapid Identification of Bacterial and Fungal Pathogens Recovered from Blood Cultures. Journal of Clinical Microbiology 2003; 41 (1): 324-9.

(28) Naumann A, Navarro-González M, Peddireddi S, Kües U, Polle A. Fourier transform infrared microscopy and imaging: Detection of fungi in wood. Fungal Genetics and Biology 2005; 42 (10): 829-35.

(29) Fischer G, Braun S, Thissen R, Dott W. FT-IR spectroscopy as a tool for rapid identification and intra-species characterization of airborne filamentous fungi. Journal of Microbiological Methods 2006; 64 (1): 63-77.

(30) Szeghalmi A, Kaminskyj S, Gough K. A synchrotron FTIR microspectroscopy investigation of fungal hyphae grown under optimal and stressed conditions. Anal Bioanal Chem 2007; 387 (5): 1779-89.

(31) Lefier D, Hirst D, Holt C, Williams AG. Effect of sampling procedure and strain variation in Listeria monocytogenes on the discrimination of species in the genus Listeria by Fourier transform infrared spectroscopy and canonical variates analysis. FEMS Microbiology Letters 1997; 147 (1): 45-50.

(32) Beattie SH, Holt C, Hirst D, Williams AG. Discrimination among Bacillus cereus, B. mycoides and B. thuringiensis and some other species of the genus Bacillus by Fourier transform infrared spectroscopy. FEMS Microbiology Letters 1998; 164 (1): 201-6.

(33) ISIRI 3194, Food microbiology – Heat resistant molds - Detection method of spore. 1386.

(34) ISIRI 9899, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guideline of general requirements for examination. 1386.

(35) Rezaeian F, Zamen Milani F, Kazemi G, Nia M, GhaemMaghami, Vahed Jabari M Survey of tea and traditional drinks contamination to mycotoxinogenic fungi in Tabriz city. Proceedings of the 9th Iranian Nutrition Congress; 2006 September 4-7; Tabtiz university of medical sciences, Tabriz, Iran.

(36) Singh A, Ganguli M, Singh AB. Fungal spores are an important component of library air. Aerobiologia 1995; 11 (4): 231-7.

(37) Abrusci C, Martín-González A, Del Amo A, Catalina F, Collado J, Platas G. Isolation and identification of bacteria and fungi from cinematographic films. International Biodeterioration & Biodegradation 2005; 56 (1): 58-68.

(38) Vivar I, Borrego S, Ellis G, Moreno DA, García AM. Fungal biodeterioration of color cinematographic films of the cultural heritage of Cuba. International Biodeterioration & Biodegradation. 2013; (accepted)

(39) Hamdy HS. Extracellular collagenase from Rhizoctonia solani: Production, purification and characterization. Indian Journal of Biotechnology (IJBT) 2008; 7 (3): 333-40.

(40) Krishna KV, Gupta M, Gupta N, Gaudani H, Trivedi S, Patil P, et al. Optimization of growth and production of protease by Penicillium species using submerged fermentation. International Journal of Microbiology Research 2009; 1 (1): 14-8.

(41) Bensch K, Groenewald JZ, Dijksterhuis J, Starink-Willemse M, Andersen B, Summerell BA, et al. Species and ecological diversity within the Cladosporium cladosporioides complex (Davidiellaceae, Capnodiales). Studies in Mycology 2010; 67 (1): 1-94.

(42) Radha S, Nithya VJ, Himakiran Babu R, Sridevi A, Prasad N, Narasimha G. Production and optimization of acid protease by Aspergillus spp under submerged fermentation. Archives of Applied Science Research 2011; 3 (2): 155-63.

(43) Mihali CV, Buruiana A, Turcus V, Covaci A, Ardelean A. Morphology and ultrastracture aspects in species belongs to Trichophyton genus using light and scanning electron microscopy. Annals of RSCB 2012; 17 (1): 90-5.

(44) Popescu C, Budrugeac P, Wortmann FJ, Miu L, Demco DE, Baias M. Assessment of collagen-based materials which are supports of cultural and historical objects. Polymer Degradation and Stability 2008; 93 (5): 976-82.

(45) Chandra T, Madhavakrishna W, Nayudamma Y. Astringency in fruits. I- Microbial degradation of catechin. Canadian Journal of Microbiology 1969; 15 (3): 303-6.

(46) Arunakumari A, Mahadevan A. Utilization of aromatic substances by Pseudomonas solanacearum. Indian journal of experimental biology 1984; 22 (1): 32-6.

(47) Groenewoud G, Hundt HK. The microbial metabolism of (+) -catechin to two novel diarylpropan-2-ol metabolites in vitro. Xenobiotica 1984; 14 (9): 711-7.

(48) Sambandam T, Mahadevan A. Degradation of catechin and purification and partial characterization of catechin oxygenase fromChaetomium cupreum. World J Microbiol Biotechnol 1993; 9 (1): 37-44.

(49) Waheeta H, Mahadevan A. Degradation and cometabolism of catechin by Bradyrhizobium japonicum. Biodegradation 1997; 13: 601-7.

(50) Arunachalam M, Mohan Raj M, Mohan N, Mahadevan A. Biodegradation of Catechin. Proceedings of the Indian National Science Academy 2003; 69 (4): 353-70.

(51) Mohammadi Achachluei M. Pathologic assessment of manuscripts in the archive (Malek National Library and Museum Institution) respecting to biological deterioration. Research project in Malek National Library and Museum Institution. Tehran, Iran; 2012.

(52) Khodaparast SA. Fungal Kingdom. Rasht: University of Guilan Press; 2010.

(53) De Hoog GS. Atlas of Clinical Fungi, Second Edition. Washington D.C.: Amer Society for Microbiology; 2000.

(54) Dukor RK. Vibrational spectroscopy in the detection of cancer. In: Chalmers JM, Griffiths P, editors. Handbook of Vibrational Spectroscopy. 5. London: WILEY; 2002. p. 3335-60.

(55) Sivakesava S, Irudayaraj J, DebRoy C. Differentiation of microorganisms by FTIR-ATR and NIR spectroscopy. Transactions of the ASAE 2004; 47 (3): 951-7.

(56) Yang D, Castro D, EI-Sayed I, EI-Sayed M, Saxon R, Nancy Y. Fourier-transform infrared spectroscopic comparison of cultured human fibroblast and fibrosarcoma cells. Proceedings of SPIE 1995; 2389: 543-50.