بهینه‌سازی تولید پلی‌فسفات توسط باسیلوس مگاتریوم سویه G11

نویسندگان

1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، ایران

2 استاد میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه: پلی ­فسفات­ها ‏که دانه­های ولوتین نیز نامیده می­شوند،بسپارهای خطی از ارتوفسفات­های اتصال یافته با پیوندهای پرانرژی فسفوانهیدریدی هستند که در باکتری‏ها، مخمرها، قارچ‏ها، گیاهان و جانوران مشاهده می­شوند. این بسپار به­طور کامل ایمن و غیرسمی است و کاربردهای متعددی در صنایع غذایی و دارویی دارد.
مواد و روش‏‏ها: در این تحقیق به علت اهمیت بالای این بسپارها در صنایع مختلف، چندین عامل مانند نوع منبع کربن، غلظت منبع کربن و غلظت فسفر برای افزایش تولید پلی­فسفات در باسیلوس مگاتریوم سویه­ G11 مطالعه و بهینه شدند. این کار با تعیین مقدار فسفر حذف شده از محیط و میزان پلی­فسفات ذخیره شده در سلول انجام شد. برای اثبات معنی­دار بودن نتایج به­دست آمده، از آزمون­هاى آماری تحلیل واریانس یک طرفه و توکی ‏استفاده شد.
نتایج: رشد باسیلوس مگاتریوم در حضور سوکروز (جذب نوری 026/3) بهتر از گلوکز (جذب نوری 616/2) بود ولی فعالیت سلولی از لحاظ تولید پلی­فسفات و حذف فسفر، در محیط گلوکز بیشتر و به­ترتیب برابر با 033/0 گرم بر گرم وزن خشک توده سلولی و 61/1 گرم بر لیتر بود. به­علاوه تولید پلی­فسفات و حذف فسفر در راستای هم، با افزایش غلظت گلوکز محیط، کاهش یافتند. در بررسی اثر فسفر دو مرحله بالارونده و پائین­رونده مشاهده شد. افزایش غلظت فسفر از 25/0 تا یک گرم بر لیتر موجب افزایش تولید پلی‏فسفات و حذف فسفر از محیط شد درحالی‏که افزایش بیشتر غلظت فسفر، یعنی از یک تا چهار گرم بر لیتر موجب کاهش آن‏ها شد. براساس اطلاعات به­دست آمده از تحلیل واریانس یک طرفه و توکی، در کل اختلاف آماری معنی­داری (01/0P<) در تولید پلی­فسفات و حذف فسفر از محیط در هر مرحله از بهینه­سازی وجود داشت. در نهایت می­توان گفت برای این سویه بهترین غلظت گلوکز و نمک دی­پتاسیم فسفات برای تولید پلی­فسفات به ترتیب برابر با 5 و 5/0 گرم بر لیتر است.
بحث و نتیجهگیری: مطابق با داده­های به­دست آمده، بهترین منبع کربن برای رشد و تکثیر سلول، بهترین منبع کربن برای تولید پلی­فسفات و حذف فسفر از محیط نیست. از آنجایی­که برای تولید پلی­فسفات بین غلظت­های 1، 2 و 5/0 گرم بر لیتر فسفر اختلاف آماری معنی­داری وجود نداشت در نتیجه برای صرفه­جویی در مقدار مصرف  فسفر و صنعتی بودن آن، 5/0 گرم بر لیتر بهترین غلظت فسفر برای تولید پلی­فسفات است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Optimization of polyphosphate production by Bacillus megaterium strain G11

نویسندگان [English]

  • Sara Ghashghaei 1
  • Giti Emtiazi 2
1 M.Sc of Microbiology, University of Isfahan, Iran
2 Professor of Microbiology, University of Isfahan, Iran
چکیده [English]

Introduction: Polyphosphates, also called volutin granules, are linear polymers from orthophosphates linked by energy-rich phosphoanhydride bands that have been seen in bacteria, yeasts, fungi, plants and animals. These polymers are completely safe and nontoxic, and have numerous applications in food and drug industries.
Materials and methods: Due to the great importance and wide range of the utilization of these polymers in various industries, several factors such as various carbon sources, carbon source concentration and phosphorus concentration were studied and optimized. In order to increase polyphosphate production in Bacillus megaterium strain G11. The optimization process was carried out with determination of the amount of polyphosphate accumulated in cell and phosphorus removed from the medium. One-way ANOVA and Tukey tests were usedin order to determine whether there was a significant difference between data obtained in this research.
Results: Growth of B. megaterium in the presence of sucrose (OD=3.026) was better than glucose (OD=2.616) whereas polyphosphate production and phosphorus removal from medium were higher in the presence of glucose (0.033 g g-1 dry cell weight and 1.61 g l-1, respectively). On the other hand, polyphosphate production and phosphorus removal from medium coordinately were decreased with increasing glucose concentration. Furthermore, in studying the effects of phosphorus, we faced two phases of rising and falling. Actually, the increase of phosphorus concentration (0.25-1 g l-1) in medium caused an increase in polyphosphate production and phosphorus removal from medium whereas both of them were decreased with a more increase in amount of phosphorus (1-4 g l-1). One-way ANOVA and Tukey tests showed that there was a significant difference (P<0.01) between data obtained at each optimization step and the best glucose and dipotassium phosphate concentrations for polyphosphate production were 5 and 0.5 g l-1 respectively.
Discussion and conclusion: According to data obtained in this study, the best carbon source for cell growth and proliferation was not the best source for polyphosphate production and phosphorus removal from medium. Since there was no statically significant difference between 1, 2, and 0.5 g l-1 concentrations for polyphosphate production, therefore, for industrialization and economization in the level of phosphorus consumption, 0.5 g l-1 was the best phosphorus concentration.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bacillus megaterium
  • Polyphosphate
  • Optimization

مقدمه

میکروارگانیسم­ها فسفر را جذب و آن را وارد ترکیب چندین درشت ­مولکول سلولی می­کنند. تعدادی از میکروارگانیسم­ها توانایی ذخیره فسفر را به­عنوان پلی‏فسفات در دانه‏های خاصی به نام ولوتین دارند (1). پلی‏فسفات‏ها، بسپاری از فسفات‏های متصل شده با پیوندهای فسفوانهیدریدی هستند و در باکتری‏ها، مخمرها، قارچ‏ها، گیاهان و جانوران یافت می‏شوند (2). بسپارهای تولید شده توسط ارگانیسم‏های ذخیره‏کننده پلی‏فسفات شامل پلی‏فسفات، پلی‏هیدروکسی‏آلکالونات‏ها و گلیکوژن است (3). پلی‏فسفات‏ها با فرمول Mn+2PnO3n+1در مقایسه با ATP مولکول­هایی با پیوند انهیدریدی پرانرژی هستند (2) و ممکن است بیشینه 10 تا 20 درصد وزن خشک سلولی را در بر گیرند (4). آنزیم‏های اصلی مرتبط با سوخت و ساز پلی‏فسفات در باکتری‏ها شامل: پلی‏فسفات کیناز 1 (PPK1) (مسئول سنتز پلی­فسفات)، پلی‏فسفات کیناز 2 (PPK2)، پلی‏فسفات-آدنوزین‏مونو‏فسفات-فسفوترانسفراز (PAP)، اگزوپلی­فسفاتاز (PPX) و اندوپلی­فسفاتاز (PPN) (مسئول تجزیه پلی‏فسفات) هستند (5 و 6). عامل‏های محیطی زیادی مانند نوع و مقدار سوبسترا، هوازی یا بی­هوازی بودن محیط کشت، اسیدیته‏، نوع و مقدار یون­های فلزی بر تشکیل پلی‏فسفات­ها اثر می‏گذارند (1 و 2). اثر نوع و مقدار سوبسترا بر روی سنتز پلی­فسفات در سویه­های مختلف متفاوت است (7). امروزه کاربردهای متعددی برای این ‏بسپار ذکر می‏شود که از آن جمله می‏توان به موارد زیر اشاره کرد:

1- استفاده در محصولات غذایی بسته­بندی به‏عنوان افزودنی مجاز برای جلوگیری از رشد باکتری‏ها: پلی‏فسفات‏های معدنی ایمن[1] تشخیص داده شده‏اند و به شکل گسترده به­عنوان افزودنی‏های غذایی برای افزایش ویژگی‏های عملکردی اصلی (حفظ مزه و بو، افزایش بازده به علت توانایی اتصال به آب و معلق‏سازی، تاخیر در ترشیدگی اکسایشی و کاهش رنگ و ...) در صنایع مختلف استفاده می‏شوند (8). همچنین تاکنون مطالعات زیادی، اثر ضد میکروبی پلی‏فسفات بر روی باکتری‏های متعدد را اثبات نموده است (9 و 10).

 2- کاربرد پلی‏فسفات در انتقال دارو و ژن: پلی‏فسفات‏ها به­عنوان یک دسته مهم از مواد زیستی برجسته، سازش‏پذیری و تجزیه­پذیری خوبی داشته و تشابه ساختاری با اسیدهای نوکلئیک و اسیدهای تایکوئیک طبیعی دارند. در سال‏های اخیر تعدادی هم­بسپار با واحدهای فسفات ساخته شده و برای انتقال دارو و ژن به‏کار رفته است. سیستم انتقال آنتی‏بیوتیک هدف‏دار، غلظت در حال چرخش دارو را کاهش می‏دهد و ارتباط اندام‏های غیر هدف را با آنتی‏بیوتیک محدود می‏کند. ارزیابی سمیت بالقوه مواد بسپاری برای کاربردهای انتقال دارو بسیار مهم و حائز اهمیت است. پلی­فسفات­های خطی به­طور ممتد در سیستم انتقال دارو بررسی شده و سمی نبودن آن برای گروه­های سلولی مختلف محرز شده است (11 و 12).

3- کاربرد پلی­فسفات در ترمیم و نوسازی استخوان: در سال­های اخیر پلی­فسفات کلسیم، به­عنوان ماده­ای امید بخش در مهندسی بافت استخوان، نه تنها به خاطر سازگاری زیستی برجسته بلکه به علت تجزیه­پذیری قابل کنترل، قدرت فشردگی بالا و تشابه با عناصر شیمیایی استخوان، توجه بسیاری از پژوهشگران را به خود جلب کرده است (13).

 در نتیجه، به علت اهمیت بالای این بسپار در صنعت غذا و دارو، در این تحقیق، مطالعاتی برای تعیین بهترین شرایط برای رسیدن به بیشترین میزان تولید پلی­فسفات توسط باسیلوس مگاتریوم سویه G11 انجام شد.

 

مواد و روش­ها

میکروارگانیسم­

باسیلوس مگاتریوم سویه­ G11 یک سویه تولید کننده پلی­فسفات به میزان بالا و قابل­توجه است که از خاک اطراف کارخانه تولید کننده کود شیمیایی فسفر در شهر ماهشهر استان خوزستان جداسازی و شناسایی شده است (14). این باکتری در آگار مغذی کشت، در 4 درجه سانتی­گراد نگهداری و برای هر آزمایش دوباره فعال شد.

بهینه­سازی نوع منبع کربن، غلظت منبع کربن و غلظت فسفر

 به منظور دستیابی به میزان بیشتر پلی­فسفات، فاکتورهای مؤثر در تولید تحت روش یک عامل در یک زمان[2] و براساس برتری آن‏ها در تولید، بهینه شدند. در این بررسی، روش کار به این شکل بود که ابتدا منابع کربن گلوکز، لاکتوز و سوکروز برای تولید پلی‏فسفات و کاهش فسفر از محیط با یکدیگر مقایسه شدند. پس از به دست آوردن بهترین منبع کربنی، نقش غلظت آن (5، 10، 15، 20 و 25 گرم بر لیتر) و سپس غلظت فسفر (25/0، 5/0، 1، 2 و 4 گرم بر لیتر) بررسی شد. میزان پلی­فسفات تولید شده و فسفر حذف شده از محیط به شکل کمی هر 6 ساعت یک­بار تا 54 ساعت تعیین شد.

محیط تولید

محیط غنی از فسفر به شکل پایه حاوی گلوکز (10 گرم بر لیتر)، کلرید منیزیم (0407/0 گرم بر لیتر)، سولفات آهن (01/0 گرم بر لیتر)، کلرید کلسیم (014/0 گرم بر لیتر)، دی­پتاسیم فسفات (456/2 گرم بر لیتر)، کلرید منگنز (0059/0 گرم بر لیتر)، آمونیوم مولیبدات (001/0 گرم بر لیتر) و کلرید روی (00082/0 گرم بر لیتر) است. اسیدیته‏ اینمحیطبایدقبلازاتوکلاوباکلریدریک اسیدوهیدروکسید سدیمیکنرمال در2/7تنظیمشود (15). نوع و مقدار منبع کربن و مقدار نمک دی­پتاسیم فسفات بسته به مرحله آزمایش تغییر می­کند.

تعیین مقدار فسفر حذف شده از محیط

پنج میلی­لیتر از کشت مایع برداشته و در 5000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد (15). محلول رویی برای محاسبه فسفر باقیمانده در محیط استفاده شد. تعیین فسفر به روش رنگ­سنجی بر پایه واکنش با معرف بارتون (آمونیوم وانادات و آمونیوم مولیبدات) است که سبب تشکیل کمپلکس زرد رنگ فسفووانادومولیبدات و جذب نوری در طول موج 450 نانومتر می­شود (2).

تعیین میزان پلی‏فسفات

توده سلولی حاصل از مرحله قبل، دو بار با محلول کلرید سدیم 5/1 مولار شامل اتیلن­دی­آمین­تترا اسید استیک 01/0 مولار و فلورید سدیم یک میلی‏مولار (بافر شستشو) شستشو داده شد. سپس سوسپانسیونی از 5/1 میلی­لیتر بافر شستشو و توده سلولی رسوب یافته تهیه و به مدت 10 دقیقه با 2 دقیقه وقفه، روی یخ سونیکه شد. سپس در 12000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه ‏سانتریفیوژ و به 5/0 میلی­لیتر از محلول رویی به‏دست آمده، 100 میکرولیتر اسید کلریدریک غلیظ اضافه و برای شکست پیوند­های فسفو انهیدریدی، به مدت 45 دقیقه در 100 درجه سانتی­گراد حرارت داده شد. ‏فسفر آزاد شده با کمک معرف بارتون ارزیابی شد (16).

اندازه گیری وزن خشک توده سلولی

هر 6 ساعت یک بار یعنی همزمان با نمونه­برداری برای تعیین مقدار فسفر باقی مانده و مقدار پلی­فسفات تولید شده، 5 میلی­لیتر از محیط کشت مایع در 5000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ، با آب مقطر 3 بار شستشو و سپس در دمای 70 درجه سانتی­گراد تا ثابت شدن وزن، قرار داده شد (17). به­علاوه رشد سلولی با اندازه­گیری جذب نمونه در 600 نانومتر تعیین شد.

تعیین منحنی استاندارد فسفر

456/2 گرم نمک دی­پتاسیم فسفات را در یک لیتر آب مقطر حل کرده که حاوی ppm 1000 از P2O5 است. محلول استاندارد ppm 100 با رقیق نمودن قسمتی از محلول اصلی به نسبت حجمی 1:10 تهیه شد و از این محلول استاندارد، محلول­هایی با غلظت ppm ‏100، -30، 20، 10 و صفر تهیه شد.

 برای تعیین منحنی استاندارد از غلظت­های تهیه شده یک میلی­لیتر در لوله­های آزمایش ریخته و به همه آن‏ها 1/0 میلی­لیتر اسید نیتریک با غلظت 1:2، 6/0 میلی­لیتر معرف بارتون و 3/0 میلی­لیتر آب مقطر اضافه کرده و پس از 10 دقیقه، جذب نمونه­های مختلف در طول موج 450 نانومتر با دستگاه اسپکتروفوتومتر خوانده شد. برای نمونه­های مجهول، جذب نوری (OD) به­دست آمده در فرمول مربوط به منحنی استاندارد قرار داده شد و به این ترتیب میزان فسفر آن‏ها مشخص شد (18).

تحلیل آماری

برای مقایسه تولید پلی­فسفات و حذف فسفر از محیط در شرایط مختلف در نظر گرفته شده، از آزمون‏های تحلیل واریانس یک طرفه[3] و توکی[4] ‏ استفاده شد. سطح معنی­داری در کلیه موارد 01/0 بود.

 

 

نتایج

بهینه­­سازی منبع کربن

در این بررسی، سه قند گلوکز، سوکروز و لاکتوز با غلظت یک درصد برای تولید پلی­فسفات و کاهش فسفر از محیط با یکدیگر مقایسه شدند.

بیشترین رشد باکتری در حضور سوکروز با جذب نوری برابر با 026/3 ‏و سپس به ترتیب گلوکز با جذب نوری 616/2 و لاکتوز با جذب نوری 542/0 دیده شد. از میان این سه قند، بیشترین فعالیت سلولی (گرم پلی‏فسفات بر گرم وزن خشک توده سلولی) برای تولید پلی­فسفات و کاهش فسفر، در حضور گلوکز انجام می‏شود. برای کاهش فسفر به ترتیب سوکروز و لاکتوز و برای تولید پلی­فسفات لاکتوز و سوکروز در مراتب بعدی هستند. در حضور گلوکز به­عنوان منبع کربن در محیط کشت، بیشترین فعالیت سلولی از لحاظ تولید پلی­فسفات در ساعت 30، برابر  با 033/0 گرم پلی‏فسفات بر گرم وزن خشک توده سلولی و بیشترین کاهش فسفر در محیط در ساعت 36، برابر با 61/1 گرم فسفر بر لیتر است (شکل 1). در حضور سوکروز، بیشترین فعالیت سلولی از لحاظ تولید پلی­فسفات در ساعت 30، برابر با 022/0 گرم پلی­فسفات بر گرم وزن خشک توده سلولی و بیشترین کاهش فسفر در ساعت 36، برابر با 91/1 گرم فسفر بر لیتر است (شکل 2). در حضور لاکتوز، بیشترین فعالیت سلولی از لحاظ تولید پلی­فسفات در ساعت 30 تا 36، برابر با 023/0 گرم پلی‏فسفات بر گرم وزن خشک توده سلولی و بیشترین کاهش فسفر در ساعت 36، برابر با 342/2 گرم فسفر بر لیتر است (شکل 3).

 

 

شکل 1- منحنی تولید پلی­فسفات در باسیلوس مگاتریوم سویه G11 و کاهش فسفر در محیط حاوی گلوکز (10 گرم بر لیتر) به­عنوان منبع کربن

 

 

 

 

شکل 2- منحنی تولید پلی‏فسفات در باسیلوس مگاتریوم سویه  G11و کاهش فسفر در محیط حاوی سوکروز (10 گرم بر لیتر) به­عنوان منبع کربن

 

 

 

شکل 3- منحنی تولید پلی­فسفات در باسیلوس مگاتریوم سویه G11و کاهش فسفر در محیط حاوی لاکتوز (10 گرم بر لیتر) به­عنوان منبع کربن

 

 

 

براساس نتایجآزمون تحلیل واریانس یک طرفه،در حضور منابع کربنی متفاوت، اختلاف آماری معنی­داری (01/0P<) در تولید پلی­فسفات و حذف فسفر از محیط به­وسیله این سویه وجود دارد. برای مشخص شدن این‏که بین کدام گروه­ها اختلاف معنی­دار وجود دارد از آزمون توکی استفاده شد. نتایج به­دست آمده نشان داد که بیشترین تولید پلی­فسفات به گلوکز متعلق بوده، در حالی‏که لاکتوز و سوکروز رفتار مشابهی نشان دادند. همچنین بهترین منبع کربن برای حذف فسفر از محیط به­ترتیب گلوکز، سوکروز و لاکتوز بودند. در نتیجه، گلوکز به­عنوان بهترین منبع کربن انتخاب و غلظت آن بهینه شد.

بهینه­سازی غلظت گلوکز

از آنجایی­که بیشترین فعالیت سلولی از لحاظ تولید پلی‏فسفات در این محیط در ساعت 30 رخ می‏دهد، پس از انتخاب گلوکز به­عنوان بهترین منبع کربن، غلظت‏های مختلفی از آن (5، 10، 15، 20 و 25 گرم بر لیتر) نیز در این ساعت برای تعیین بهترین غلظت برای تولید پلی­فسفات و کاهش فسفر بررسی و آزمایش شدند. نتایج نشان داد که با افزایش غلظت گلوکز در محیط، سرعت رشد بالا رفته و مقدار توده سلولی افزایش پیدا می‏کند. از طرفی هر چه توده سلولی بیشتر شود، مقدار فسفر بیشتری از محیط حذف می­شود، ولی همان­طور که در شکل دیده می­شود بیشترین میزان پلی‏فسفات (038/0 گرم پلی­فسفات بر گرم وزن خشک توده سلولی) در کمترین غلظت گلوکز (5 گرم بر لیتر) تولید شده و با افزایش گلوکز، مقدار آن کاهش یافته تا این‏که در بالاترین غلظت گلوکز (25 گرم بر لیتر) به کمترین میزان (013/0 گرم پلی­فسفات بر گرم وزن خشک توده سلولی) می‏رسد (شکل 4).

 

 

شکل 4- مقدار تولید پلی‏فسفات در باسیلوس مگاتریوم سویه G11 و کاهش فسفر در محیط حاوی غلظت‏های متفاوتی از گلوکز به­عنوان منبع کربن

 

 

 

براساس اطلاعات بدست آمده از آزمون تحلیل واریانس یک طرفه، در کلاختلاف آماری معنی‏داری (01/0P<) در تولید پلی­فسفات و حذف فسفر از محیط بین غلظت­های مختلف گلوکز وجود داشت ولی نتایج به­دست آمده از آزمون توکی نشان داد که اختلاف معنی­داری بین غلظت­های 25، 20 و 15، بین 15 و 10 و بین 10 و 5 گرم بر لیتر برای حذف فسفر وجود ندارد وبیشترین حذف مربوط به گروه اول (25، 20 و 15) است. در نتیجه، بهترین غلظت برای حذف فسفر از محیط ‏15 گرم بر لیتر است. از طرفی بین هر 5 غلظت برای تولید پلی­فسفات اختلاف معنی­دار وجود داشت و بهترین غلظت به 5 گرم بر لیتر متعلق بود. از آنجایی‏که هدف ما در این مطالعه، بیشتر تمرکز بر تولید پلی­فسفات بود، غلظت 5 گرم بر لیتر گلوکز برای بهینه­سازی غلظت فسفر در محیط انتخاب شد.

 

 

بهینه­سازی غلظت فسفر

در مرحله بعد با به کار بردن غلظت­های متفاوتی از فسفر (25/0، 5/0، 1، 2 و 4 گرم بر لیتر) بهترین غلظت فسفر، برای تولید پلی­فسفات و کاهش فسفر، تعیین شد. بالاترین سرعت رشد و تولید توده سلولی در غلظت یک درصد فسفر شکل می­گیرد. افزایش غلظت فسفر از 25/0 تا یک گرم بر لیتر موجب افزایش توده سلولی و افزایش بیشتر غلظت فسفر، یعنی از 1 تا 4 گرم بر لیتر موجب کاهش توده سلولی می­شود. روند مصرف فسفر و تولید پلی­فسفات نیز مطابق با جذب باکتری بود؛ به عبارت دیگر، در بیشترین توده سلولی بیشترین مصرف فسفر (774/0 گرم فسفر بر لیتر) و تولید پلی­فسفات (42/0 گرم پلی‏فسفات بر گرم وزن خشک توده سلولی) و در کمترین توده سلولی کمترین مصرف فسفر (224/0 گرم فسفر بر لیتر) و تولید پلی­فسفات (28/0 گرم پلی‏فسفات بر گرم وزن خشک توده سلولی) دیده شد (شکل 5).

 

­­

شکل 5- مقدار تولید پلی­فسفات در باسیلوس مگاتریوم سویه G11و مصرف فسفر در محیط حاوی گلوکز (5 گرم بر لیتر) و غلظت­های متفاوتی از فسفر

 

 

براساس اطلاعات به­دست آمده از آزمون تحلیل واریانس یک طرفه، اختلاف آماری معنی­داری (01/0P<) در تولید پلی­فسفات و حذف فسفر از محیط بین غلظت­های مختلف فسفر وجود داشت. براساس نتایج به­دست آمده از آزمون توکی بهترین غلظت برای حذف فسفر از محیط، یک گرم بر لیتر بود و بین 2 و 5/0 که در مرتبه دوم و 4 و 25/0 که در مرتبه سوم قرار داشتند، اختلاف معنی­داری وجود نداشت. به ­علاوه برای تولید پلی‏فسفات بین غلظت­های 1، 2 و 5/0 گرم بر لیتر در مرتبه اول، 5/0 و 4 گرم بر لیتر در مرتبه دوم و 4 و 25/0 گرم بر لیتر در مرتبه سوم اختلاف معنی­داری دیده نشد.

 

بحث

پلی­فسفات­ها مولکول­هایی بسیار حساس بوده و در دماهای بالا و اسیدیته‏ پایین به شکل خود به خودی تجزیه می­شوند (2). در این مطالعه، از کلریدریک اسید برای ایجاد محیطی با اسیدیته‏ پایین و حرارت 100 درجه سانتی‏گراد برای شکست پیوندهای فسفوانهیدریدی استفاده شد.

واگابو و همکاران[v] در سال 2008 اثر حضور دو منبع کربن متفاوت یعنی گلوکز و اتانول را در تجمع پلی‏فسفات توسط ساکارومیسس سرویزیه سویهVKM Y-1173 مقایسه کردند و به این نتیجه رسیدند که میزان پلی­فسفات تولید شده در هر دو حالت یکسان است (7). در این مطالعه، اثر سه منبع کربن گلوکز، سوکروز و لاکتوز بر روی تولید پلی­فسفات در باسیلوس مگاتریوم سویه­ی G11بررسی شد. از نتایج به­دست آمده، می­توان به این نکته اشاره کرد که لزوما بهترین منبع کربن برای رشد و تکثیر سلول، بهترین منبع کربن برای حذف فسفر از محیط و تولید پلی­فسفات نیست، چنان‏که رشد باسیلوس مگاتریوم در حضور سوکروز به نسبت بهتر از گلوکز است ولی فعالیت سلولی از لحاظ حذف فسفر و تولید پلی­فسفات، در محیط گلوکز بیشتر است. همچنین، در محیط لاکتوز با کمترین رشد در مقایسه با سوکروز با بیشترین رشد در عین این‏که حذف فسفر از محیط بسیار کمتر بوده ولی در هر دو حالت، باکتری رفتار مشابه از لحاظ تولید پلی­فسفات نشان داد و این ممکن است به این علت باشد که باکتری در محیط نامناسب برای رشد، میزان زیادی از فسفر جذب شده را، صرف تولید پلی‏فسفات کرده است و از آن به­عنوان ذخیره انرژی استفاده می‏کند.

دسن[vi] در سال 2002 اثر غلظت­های متفاوت گلوکز بر جذب فسفر و تولید پلی­فسفات در سویه­های باکتریایی متفاوتی از ویبریوو آکروموباکتر[vii] که از دریا جدا کرده بود را بررسی و به این نتیجه رسید که جذب فسفر و تولید پلی‏فسفات به شکل هماهنگ با هم، با افزایش غلظت گلوکز، کاهش می‏یابند (19). در باسیلوس مگاتریوم سویه G11که در این مطالعه بررسی شد، نیز نتایجی مشابه به­دست آمد، یعنی در پائین‏ترین غلظت گلوکز (5 گرم برلیتر) بیشترین فعالیت سلولی از لحاظ تولید پلی­فسفات و در بالاترین غلظت (25 گرم بر لیتر)، کمترین فعالیت ‏دیده شد. این احتمال وجود دارد که غلظت پایین منبع کربن به­عنوان یک عامل استرسی عمل کرده و در این شرایط باکتری از پلی­فسفات به عنوان ذخیره­ی انرژی استفاده می­کند.

همچنین از دیگر عوامل مطالعه شده، اثر غلظت فسفر بر تولید پلی‏فسفات بود. همان‏طور که در بخش نتایج نشان داده شد فسفر تا غلظت یک درصد محرک رشد و بیش از آن بازدارنده بود. از طرف دیگر اختلاف معنی­داری برای تولید پلی­فسفات بین غلظت­های 1، 2 و 5/0 گرم بر لیتر وجود نداشت. در نتیجه برای صرفه‏جویی در مقدار مصرف فسفر و صنعتی بودن آن، 5/0 گرم بر لیتر بهترین غلظت فسفر برای تولید پلی‏فسفات است.

 

 

تشکر و قدردانی

از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه اصفهان برای حمایت از این تحقیقتشکر و قدردانی می­شود.



[1]. Generally Recognized As Safe(GRAS)

[2]. One factor at a time

[3]. One way ANOVA

[4]. Tukey

[v] . Vagabov et al

[vi]. Dasan

[vii]. Achromobacter sp.

 References

(1) Machnicka A. Accumulation of phosphorus by filamentous microorganisms. Pol J Environ Stud 2006; 15(6): 947-53.

(2) Mussig-Zufika M, Kornmuller A, Merkelbach B, Jekel M. Isolation and analysis of intact Polyphosphate chains from activated sludges associated with biological phosphate removal. Water Res 1994; 28(8): 1725-33.

(3) Serafim LS, Lemos PC, Levantesi C, Tandoi V, Santos H, Reis MA. Methods for detection and visualization of intracellular polymers stored by polyphosphate-accumulating microorganisms. J Microbiol Meth 2002; 51(1): 1-18.

(4) Kulaev IS, Vagabov VM. Polyphosphate metabolism in micro-organisms. Adv Microb Physiol 1983; 24: 83-171.

(5) Brown MRW, Kornberg A. The long and short of it – polyphosphate, PPK and bacterial survival. Trends Biochem Sci 2008; 33(6): 284-90.

(6) Hooley P, Whitehead MP, Brown MRW. Eukaryote polyphosphate kinases: is the ‘Kornberg’complex ubiquitous Trends Biochem Sci 2008;33(12): 577-82.

(7) Vagabov VM, Trilisenko LV, Kulakovskaya TV, Kulaev IS. Effect of a carbon source on polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res 2008; 8(6): 877-82.

(8) Maier SK, Scherer S, Loessner MJ. Long-chain polyphosphate causes cell lysis and inhibits Bacillus cereus septum formation, which is dependent on divalent cations. Appl Environ Microbiol 1999; 65(9): 3942–49.

 

 

 

(9) Borch E, Lycken L. Influence of long-chain polyphosphate and heat treatment on Clostridium cochlearium and Clostridium sporogenes isolated from processed cheese spread. J Food Prot 2007; 70(3): 744–7.

(10) Akhtar S, Paredes-Sabja D, Sarker MR. Inhibitory effects of polyphosphates on Clostridium perfringens growth, sporulation and spore outgrowth. Food Microbiol 2008; 25(6): 802–08.

(11) Schofield SC, Berno B, Langman M, Hall G, Filiaggi MJ. Gelled calcium polyphosphate matrices delay antibiotic release. J Dent Res 2006; 85(7): 643-47.

(12) Liu J, Huang W, Pang Y, Zhu X, Zhou Y, Yan D. Hyperbranched polyphosphates for drug delivery application: design, synthesis, and in vitro evaluation. Biomacromolecules 2010; 11(6): 1564-70.

(13) Wang Q, Wang Q, Wan, C. The effect of porosity on the structure and properties of calcium polyphosphate bioceramics. Ceram – Silik 2011; 55(1): 43-8.

(14) Ghashghaei S. Role of phosphorus on synthesis of metachromatic granules and nanocrystal by bacteria. Isfahan: Isfahan Univ.; 2012. 82-3.

(15) Clark JE, Beegen H, Wood HG. Isolation of intact chains of polyphosphate from Propionibacterium shermanii grown on glucose or lactate. J Bacteriol 1986; 168(3): 1212-19.

(16) De Lima MAB, Do Nascimento AE, De Souza W, Fukushima K, De Campos-Takaki GM. Effects of phosphorus on polyphosphate accumulation by cunninghamella elegans. Braz J Microbiol 2003; 34(4): 363-72.

(17) Beffa T, Blanc M, Lyon PF, Vogt G, Marchiani M, Fischer JL, Aragno M. Isolation of Thermus strains from hot composts (60 to 80 degrees C). Appl Environ Microbiol 1996; 62(5): 1723–7.

(18) Kumar A, Kumar A, Devi S, Patil S, Payal C, Negi S. Isolation, screening and characterization of bacteria from Rhizospheric soils for different plant growth promotion (PGP) activities: an in vitro study. Recent Research in Science and Technology 2012; 4(1): 1-5.

(19) Dasan EV. Polyphosphate accumulation by marine bacteria. Cochin: Cochin University of Science and Technology; 2002. 145-54.