افزایش بازدهی روش طبیعی استفاده از محیط اسپیزیزن برای انتقال پلاسمید به درون باکتری باسیلوس سوبتیلیس با استفاده از یک پپتید کاتیونیک تراوا کننده غشا باکتریایی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری تخصصی زیست فناوری پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج)، تهران، ایران

2 دانشجوی دکتری تخصصی زیست شناسی مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج)، تهران، ایران،

3 ‏ دانشجوی دکتری تخصصی زیست فناوری پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج)، تهران، ایران

4 دانشجوی دکتری تخصصی مهندسی بافت، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج)، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: تعدادی از گونه‌های باکتریایی قادرند تا مولکول DNA را از محیط اطرافشان در‌یافت نمایند؛ میزان این دریافت به شرایطی مانند بزرگی پلاسمید و نوع میزبان بستگی دارد. در مورد باکتری باسیلوس سوبتیلیس نیز این امکان البته با میزان انتقال بسیار پایینی وجود دارد. در حال حاضر روش مرسوم برای انتقال پلاسمید خارجی به درون باکتری باسیلوس سوبتیلیس استفاده از روش طبیعی در یک محیط کشت حداقل (اسپیزیزن) است. در این روش نیز میزان انتقال مطلوب و در خورتوجه نیست. هدف از این مطالعه، بررسی تکنیکی نوین بر پایه پپتید کاتیونیک CM11 به عنوان بک پپتید تراوا کننده غشاء، برای افزایش مؤثر نرخ ترانسفورماسیون DNA به باکتری باسیلوس سوبتیلیس است.
مواد و روش‏‏ها: در این روش، از پپتید CM11 به عنوان عاملی برای بهینه‏سازی انتقال pWB980 به باکتری باسیلوس سوبتیلیس استفاده شد. برای این منظور، فرآیند مستعد‏سازی باسیلوس سوبتیلیس با دو روش مجزا و در حضور غلظت‌های مختلف پپتید انجام شد. بدین ترتیب که در روش نخست، باکتری به مدت 14 ساعت در حضور غلظت‌های مختلف پپتید تیمار شد و سپس در معرض پلاسمید قرار گرفت. در روش دوم، غلظت‏ها‏ی مختلف پپتیدی همراه با پلاسمید به شکل همزمان به باکتری عرضه شد. پس از غربال‏گری باکتری‏ها‏ی دریافت کننده پلاسیمد بر روی محیط کشت LB آگار حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین تعداد کل باکتری‏ها‏ی ترانسفورم شده به ازای هر میکرو‏گرم DNA پلاسمیدی محاسبه و با کنترل مقایسه شد.
نتایج: انتقال پلاسمید pWB980 به باکتری در بهترین حالت معادل 5/6 برابر بیشتر از شرایط استاندارد (کنترل) گزارش شد که از لحاظ آماری دارای اختلاف معنی داری بود (P value <0.001).
بحث و نتیجهگیری: این مطالعه نشان داد که پپتید CM11 به عنوان یک پپتید تراوا کننده غشاء سلولی می‏تواند ترانسفورماسیون DNA خارجی به باکتری‌ باسیلوس سوبتیلیس را به طور در خور توجهی بهینه نموده و تا حدود زیادی مشکل نرخ پائین انتقال طبیعی را برطرف نماید.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Increasing plasmid transformation efficiency of natural spizizen method in Bacillus Subtilis by a cell permeable peptide

نویسندگان [English]

  • Hossein Aghamollaei 1
  • Mohammad Heiat 2
  • Mohammad Eftekhari Shirkouhi 3
  • Mehrdad Moosazadeh Moghaddam 4
1 Ph.D student of Medicine Biotechnology, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran
2 Ph.D student of Molecular Biology, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran
3 Ph.D student of Medicine Biotechnology, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran
4 Ph.D student of Tissue Engineering, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran,
چکیده [English]

Introduction: Some of bacterial species are able to uptake DNA molecule from environment, the yield of this process depends on some conditions such as plasmid size and host type. In the case of Bacillus subtilis, DNA uptake has low efficacy. Using Spizizen minimal medium is common method in plasmid transformation into B. subtilis, but rate of this process is not suitable and noteworthy. The aim of this study was investigation of novel method for improvement of DNA transformation into B. subtilis based on CM11 cationic peptide as a membrane permeable agent.
Materials and methods: In this study, for optimization of pWB980 plasmid transformation into B. subtilis, the CM11 cationic peptide was used. For this purpose, B. subtilis competent cell preparation in the present of different concentration of peptide was implemented by two methods. In the first method, after treatment of bacteria with different amount of peptide for 14h, plasmid was added. In the second method, several concentration of peptide with plasmid was exposed to bacteria simultaneously. Bacteria that uptake DNA were screened on LB agar medium containing kanamycin. The total transformed bacteria per microgram of DNA was calculated and compared with the control.
Results: Plasmid transformation in best conditions was 6.5 folds higher than the control. This result was statistically significant (P value <0.001).
Discussion and conclusion: This study showed that CM11 cationic peptide as a membrane permeable agent was able to increase plasmid transformation rate into B. subtilis. This property was useful for resolution of low transformation efficacy. 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Transformation
  • CM11 Peptide
  • pWB980
  • Bacillus subtilis

مقدمه

باسیلوس سوبتیلیس[1] باکتری استوانه‌ای شکل گرم مثبتی است که بیشتر در خاک یافت می شود. این باکتری با داشتن یک سیستم ترشحی فعال و کارامد، قادر است پروتئین‏ها‏ی متنوعی را به محیط پیرامونی خود ترشح نماید. استفاده از این ویژگی در تولید پروتئین‏ها‏ی نوترکیب باعث تسهیل مراحل تولید این پروتئین‌ها می‏شود (1). از دیگر مزایای این میکرو ارگانیسم که آن را به عنوان یک میزبان مناسب در تکثیر و بیان ژن‏های هترولوگ معرفی می‌کند توان رشد سریع، سهولت دستکاری ژنتیکی در ژنوم باکتری، غیر بیماری‏زا بودن، ژنوم مشخص و تعیین ترادف شده و ظرفیت بالا در ترشح پروتئین است (2). با همه این مزایا استفاده از این باکتری به عنوان میزبان دارای معایبی نیز است. تولید پروتئینازهای داخل و خارج سلولی مثل WPRA که باعث تجزیه پروتئین‌های ترشحی می‌شود از مشکلات بزرگ همسانه سازی و بیان در این باکتری است که این مشکل با ساخت سویه‌هایی مثلWB600 و WB700 که ژن‏های پروتئاز آن‏ها غیر فعال شده و قادرند چپرون‏هایی مثل PRSA را در حد وسیعی تولید کنند حل شده است (3، 4 و 5). از دیگر معایب این باکتری به عنوان میزبان که کار با آن را برای محققان دشوار می‏نماید نرخ بسیار پایین انتقال DNA خارجی به درون سلول باکتری یا در اصطلاح ترانسفورماسیون است. علت این محدودیت وجود دیواره ضخیم پپتیدوگلیکان در اطراف غشاء سلولی باسیلوس سوبتیلیس است که مانند یک سد به شدت راه نفوذ ماکرومولکول‏ها‏ی خارجی به درون سلول باکتری را کاهش می‏دهد.

با توجه به این‏که فرآیند کلونینگ و انتقال DNA پلاسمیدی از مهم‏ترین فرآیند‏ها‏ی کاربردی در بیوتکنولوژی و مهندسی ژنیتک است که طی آن ژن هدف در قالب یک ناقل پلاسمیدی وارد باکتری میزبان می‏شود، بهینه‏سازی آن باعث دستیابی به نتایج اولیه و ثانویه بهتر در طی تراریخت نمودن باکتری هدف خواهد شد که این موضوع در مورد باکتری باسیلوس سوبتیلیس که دارای مزیت‏ها‏ی بسیاری در حوزه انتقال ژن‏ها‏ی نوترکیب و بیان آن‏هاست و از طرفی توانایی جذب پایین DNA خارجی را دارد، از اهمیت بسزایی برخوردار است.

در حال حاضر روش‏ها‏ی متعددی برای انتقال DNA خارجی به درون باکتری باسیلوس سوبتیلیس وجود دارد که مقرون به صرفه و پر کاربردترین آن‏ها‏ ‌انتقال DNA به درون سلول صلاحیت دار شده با روش طبیعی است. هرچند این روش بسیار ساده و در دسترس است، اما انتقال DNA خارجی توسط آن با بهره وری بسیار پایینی انجام می‏گیرد. اساس این روش استفاده از یک محیط کشت ترکیبی حداقلی (اسپیزیزن)[2] برای رشد و تکثیر باکتری باسیلوس سوبتیلیس است به نحوی که در این محیط سلول‏ها‏ی باکتریایی به علت نبود برخی از مواد اولیه مورد نیاز برای رشد کامل، توانایی ساخت پپتیدوگلیکان دیواره سلولی خود را به شکل کامل ندارند. بنابراین، سلول رشد یافته به شکل پروتوپلاست است. در این شرایط با توجه به نبود دیواره سلولی کامل در اطراف سلول باکتری، DNA خارجی بیشتری در مجاورت غشاء سلول قرار می‏گیرد و جذب DNA از محیط پیرامونی افزایش می‏یابد (6). بنابراین، به نظر می‏رسد اگر بتوان بدون تهدید حیات باکتری ابتدا بر سد ضخیم پپتیدوگلیکان دیواره سلولی باکتری غلبه نمود و در ادامه تراوایی غشاء سلولی را نیز افزایش داد می‏توان راندمان انتقال DNA خارجی به درون باکتری را به میزان در خور توجهی بهبود بخشید. تاکنون تحقیقات زیادی در مورد پپتید‏ها‏ی کاتیونیک تراوا کننده غشاء[3] به عنوان ابزاری برای انتقال و رها‏سازی داروها و دیگر ترکیبات زیستی در سطح سلول‏ها‏ی هدف انجام شده است. این پپتیدها به طور میانگین از 20 تا 50 اسید آمینه تشکیل شده اند و به علت دارا بودن تعداد در خور توجهی اسید آمینه‏ها‏ی لیزین و آرژینین در ساختار خود دارای بار الکتریکی مثبت هستند. همچنین، این پپتیدها در کنار داشتن بار مثبت به علت داشتن ساختارهای آمفی پاتیک قادرند بدون نیاز به گیرنده غشایی در عرض غشاء نفوذ کرده و با ایجاد ساختارهای حفره مانند[4] غشاء سلول را نسبت به ترکیبات محیط پیرامونی خود بویژه ماکرومولکول‏ها‏یی مانند پروتئین و الیگونوکلئوتیدها نفوذپذیر نمایند. (7). این دسته از پپتید‏ها‏ می‏توانند در باکتری‌های گرم مثبت مانند باسیلوس سوبتیلیس از طریق میانکنش با تیکوئیک اسید موجود در دیواره سلولی باکتری که دارای بار منفی است به غشاء سلول نفوذ کرده و با ایجاد ناپایداری در ساختار آن موجب نفوذپذیر شدن این غشاء نسبت به ترکیبات پیرامونی سلول باکتریایی شوند (8 و 9). (شکل 1)

 

 

 

پپتید کاتیونی

 

B

 

 

پپتید کاتیونی

 

A

شکل 1- نحوه میانکنش پپتیدهای کاتیونیک با ساختارهای آنیونیک موجود در دیواره سلولی (A) و ساختار غشایی (B) باکتری‏ها‏ی گرم مثبت

 

 

سکروپین[5] و میلیتین[6] پپتیدهایی هستند که توانایی در خور توجهی برای ایجاد تغییرات بر روی ساختار غشاء باکتری‏ها‏ دارند و به ترتیب جزو پپتیدهای سیستم ایمنی در نوعی پروانه[7] و زنبور عسل هستند. پپتید‏ها‏ی سکروپین از 37 تا 39 اسید آمینه تشکیل شده اند که دارای یک انتهای N به شدت آمفی پاتیک با ساختار آلفا هلیکس هستند که توسط یک قسمت ارتجاعی به انتهای C آبگریز متصل شده است. همچنین، پپتید‌ میلیتین نیز از 26 اسید آمینه تشکیل شده است که بر خلاف سکروپین یک انتهای C به شدت آمفی پاتیک با ساختار آلفا هلیکس دارد که به انتهای N آبگریز متصل شده است (10 و 11).

با توجه به نقش و پتانسیل پپتیدهای کاتیونیک در افزایش تراوایی غشاء سلول‏ها‏ی باکتریایی، در این مطالعه، نحوه اثر پپتید CM11 که هیبریدی مشتق شده از پپتیدهای سکروپین و میلیتین است بر میزان انتقال پلاسمید DNA خارجی به درون سلول‏ها‏ی باسیلوس سوبتیلیس بررسی شد. این پپتید (CM11) با توالی WKLFKKILKVL-NH2 تشکیل یافته از نواحی Cecropin A (1-7 residues) -Mellitin (5-8 residues) است که با تعداد اسیدآمینه کمتر دارای عملکردی مشابه با پپتیدهای سکروپین و ملیتین است (12 و 13). بر این اساس از پپتید CM11 به عنوان یک پپتید تراواکننده غشاء باکتریایی به منظور بررسی و ایجاد تغییر در راندمان انتقال پلاسمید pWB980به درون باکتری باسیلوس سوبتیلیس استفاده شد.

مواد و روش‏ها‏

سنتز پپتید

پپتید هیبرید CM11 بر پایه کربوکسیماید انتهای C متصل شده به رزین اختصاصی[8] در فاز جامد و با استفاده از روش استاندارد سنتز شد (آزمایشگاه سنتز دارو، گروه زیست شناسی دانشگاه امام حسین (ع)). پپتید سنتز شده توسط HPLC فاز معکوس بر روی ستون C18 با استفاده از یک شیب غلظتی از استونیتریل 10 تا 60 درصد در آب با 1/0 درصد ‏تری فلورواستیک اسید با خلوص بالای 90 درصد خالص‏سازی شد. در انتها برای تأیید صحت و همسانی پپتید از آزمون طیف سنجی جرمی[9] استفاده شد (14).

سویه باکتریایی و پلاسمید

سویه باسیلوس سوبتیلیس [10]WB600 (دریافت شده ازگروه تحقیقاتی دکتر یخچالی، پژوهشگاه ملی ژنتیک) به عنوان میزبان استاندارد برای بررسی انتقال پلاسمید استفاده شد. همچنین، از پلاسمید pWB980[11] (3.8 kbp) حاوی نشانگر انتخابی آنتی بیوتیکی کانامایسین به عنوان DNA خارجی استفاده شد. این ناقل مشتقی از پلاسمیدpUB110، دارای پروموتر P43 و همچنین یک توالی دنباله مشتق از پلاسمید pUC18 است که برای کلونینگ در باکتری باسیلوس سوبتیلیس زیاد استفاده می‏شود.

تهیه محلول پپتیدی

پپتید لیوفیلیز شده در بافر فسفات سالین با اسیدیته 2/7 با غلظت یک میلی‌گرم بر میلی‌لیترحل و از آن استوک تهیه شد.

تهیه محیط کشت ترکیبی اسپیزیزن

به منظور تهیه و آماده‏سازی محیط کشت حداقلی اسپیزیزن (6) از ترکیبات زیر استفاده می‏شود(گرم بر لیتر):

25 K2HPO4. 3H2O: ؛ 6 : K2HPO4؛
2 :
Na2SO4 ؛ 0135/0 : FeCl3 ؛ 00034/0 : MnSO4؛ 3/0 : MgSO4. 7H2O ؛ 1 : Na3C6H5O7؛
 4 :
Glucose ؛ 2 : Glutamate و 04/0 : L-Tryptophane؛

 

مستعدسازی سلول‏ها‏ی باکتریایی باسیلوس سوبتیلیس WB600

برای بررسی تاثیر پپتید هیبریدی CM11 بر توانایی باکتری باسیلوس سوبتیلیس WB600 در جذب و دریافت DNA خارجی از دو روش مختلف برای تهیه سلول‏های مستعد این باکتری استفاده شد. در روش اول سوش مورد نظر باکتری از طریق انکوباسیون 18 ساعته بر روی محیط کشت آگار لوریا برتانی احیا شد. سپس 5 ویال استریل شامل: یک میلی‏لیتر محیط کشت حداقلی اسپیزیزن تهیه و به هر ویال غلظت مختلفی از پپتید که شامل: 5/0، 1، 2، 3 و 6 میکروگرم در میلی‏لیتر بود، اضافه شد. سپس به هر ویال یک کلونی از باکتری احیا شده تلقیح و در دمای 35 درجه سانتی‏گراد با تکانش 150 دور در دقیقه گرمادهی شد تا در OD600 دانسیته سلولی برابر 5/0 شود. در روش دوم، آماده‏سازی اولیه باکتری‌ها در محیط کشت اسپیزیزن و بدون استفاده از پپتید انجام شد و پپتید در مرحله نهایی ترانسفورماسیون به همراه پلاسمید به محیط حاوی باکتری اضافه شد.

ترانسفورماسیون B.subtillis WB600

در روش اول برای انتقال پلاسمید به باکتری، ابتدا 10میکرولیتر از پلاسمید pWB98 با غلظت 100 نانوگرم بر ماکرولیتر به هر یک از 5 ویال حاوی 1 میلی‌لیتر محیط کشت اسپیزیزن حاوی باکتری و مقادیر متفاوت از پپتید (5/0، 1، 2، 3 و6 میکروگرم در میلی‏لیتر) اضافه شد و 14 ساعت در 30 درجه سانتی گراد انکوبه شد. در روش دوم انتقال پلاسمید به شکل هم‏زمان با غلظت‏ها‏ی مورد نظر پپتید تلقیح شد. بنابراین، به هر یک از ویال‏ها‏ی حاوی یک میلی‌لیتر محیط کشت اسپیزیزن و باکتری مستعد شده، 10 ماکرولیتر از پلاسمید pWB980 با غلظت 100 نانوگرم بر میکرولیتر به همراه غلظت‏ها‏ی مورد نظر پپتید (5/0، 1، 2، 3 و6 میکروگرم در میلی‏لیتر) اضافه شد و در 30 درجه سانتی‏گراد برای مدت 14 ساعت گرمادهی شد. به منظور مقایسه میان راندمان انتقال پلاسمید در روش طبیعی و روش استفاده از پپتید از نمونه‏ها‏ی کنترل استفاده شد. برای این منظور در نمونه کنترل همه مراحل از قبیل فرآیند مستعدسازی سلول و ترانسفورماسیون در عدم حضور پپتید انجام شد. آزمایش‏ها‏ برای بررسی قابلیت تکرار پذیری و مطالعه آماری سه بار تکرار شد.

غربال‏گری و محاسبه تعداد باکتری‏های دریافت کننده پلاسمید

پس از اتمام فرآیند ترانسفورماسیون برای مشخص نمودن تعداد باکتری‏های ترانسفورم شده، ویال‌ها به مدت 5 دقیقه و با نیروی 2000 در مقیاس نیروی گرانش[12]سانتریفیوژ شدند. رسوب‌های حاصل در 20 میکرولیتر محیط کشت تازهLB مایع به شکل سوسپانسیون درآمدند و بر روی محیط آگار LB دارای 30 میکرو‌گرم بر میلی‌لیترکانامایسین کشت داده شدند. برای بررسی عملکرد و نحوه تاثیرگذاری غلظت‏ها‏ی متفاوت پپتید بر فرآیند ترانسفورماسیون، شاخص‏ها‏یی طبق جدول 1 بررسی و محاسبه و در ادامه تغییر و کارآمدی انتقال پلاسمید با استفاده از نتایج و فرمول زیر ارزیابی شد. بررسی‏ها‏ سه بار تکرار شده و مقدار میانگین باکتری‏ها‏ی شمارش شده در هر روش به عنوان شاخصه اصلی انتقال پلاسمید در نظر گرفته شد.

 

 

 

 

محاسبه آماری

آمارهای توصیفی با استفاده از شاخصه پراکندگی انحراف معیار و شاخصه مرکزی میانگین تعداد کلونی‏ها‏ی باسیلوس سوبتیلیس رشد یافته بر روی محیط کشت LB حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین گزارش شدند. یک آزمون آماری تی-تست[13] مستقل برای مقایسه دو نوع روش و مقایسه داده‌های کمی میان دو گروه در نظر گرفته شد. مدل آنالیز واریانس[14] برای تحلیل آماری شاخصه‌های دیگر مانند تاثیر دوز‏ها‏ی پپتیدی استفاده شد و احتمال کمتر از 05/0
(
P value < 0.05) برای معنادار بودن از نظر آماری در نظر گرفته شد. داده‏ها‏ با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 16 تحلیل شدند.

 

نتایج

همان‏طور که در شکل 2 نشان داده شده است، کارایی فرآیند انتقال پلاسمید به باکتری در روش اول و با استفاده از غلظت پپتیدی 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر به میزان CFU/µg DNA 104X2/4 است که این میزان 5 برابر نمونه کنترل (CFU/µg DNA 104X 7/0) است. همچنین، نتایج نشان دادند که کارآمد‏ترین حالت انتقال پلاسمید به باکتری باسیلوس سوبتیلیس هنگامی رخ می‌دهد که سلول‏های باکتری با استفاده از روش دوم و با غلظت 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر پپتید تیمار شوند. به طوری که با استفاده از این روش تعداد CFU/µg DNA 104X1/5 از باکتری‏ها‏ پلاسمید pWB980 را دریافت نمودند که این میزان در حدود 7 برابر گروه کنترل است. طبق نتایج به دست آمده میزان ترانسفورماسیون در حضور غلظت‏ها‏ی 5/0 و 3 میکروگرم در میلی‏لیتر از پپتید در هر دو روش تقریبا مشابه بود. محاسبات آماری نشان دادند که تعداد باکتری‏ها‏ی دریافت کننده پلاسمید در هر دو روش دارای اختلاف آماری معناداری با گروه کنترل هستند (P value <0.001). همچنین، یافته‌ها مشخص نمودند که با افزایش غلظت پپتید در هر دو روش، کاهش معناداری در تعداد باکتری‏ها‏ی دریافت کننده پلاسمید روی می‌دهد (P value <0.001).

 

 

 

 

شکل 2- نمودار مقایسه میزان نرخ انتقال پلاسمید pWB980 به باکتری باسیلوس سوبتیلیس WB600در حضور پپتید CM11، در روش اول سلول‏ها‏ی باکتریایی در تمامی مراحل رشد و آماده‏سازی در محیط اسپیزیزن و همچنین، مرحله انتقال پلاسمید توسط پپتید تیمار شدند اما در روش دوم فقط در مرحله انتقال پلاسمید این تیمار انجام شد‏.

 

A: مقایسه تغییر در میزان نرخ انتقال پلاسمید در روش آماده‏سازی نوع اول و روش استاندارد

B: مقایسه تغییر در میزان نرخ انتقال پلاسمید در روش آماده‏سازی نوع دوم و روش استاندارد

C: مقایسه تغییر در میزان نرخ انتقال پلاسمید در روش آماده‏سازی نوع اول و نوع دوم

 

 


بحث و نتیجه‏گیری

در مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی انتقال DNA خارجی به درون سلول‏ها‏ی باکتریایی یکی از مهم‏ترین فرآیندهایی است که استفاده می‏شود. از آن‏جایی‏ که این فرآیند یکی از کلیدی‏ترین مراحل تولید پروتئین نوترکیب است، بهینه‏سازی و بهبود راندمان آن مورد توجه بسیاری از محققان و شرکت‏ها‏ی مرتبط با این حوزه است. در باکتری‏ها‏ی گرم منفی از جمله روش‏هایی که به طور گسترده برای افزایش بازدهی این فرآیند استفاده می‏شود، روش شیمایی کلسیم کلراید است. در این روش کلرید کلسیم به طور مستقیم در جذب DNA خارجی نقشی ندارد بلکه تنها با اتصال به DNA سبب تجمع بیشتر آن در سطح خارجی دیواره‌ باکتری شده که در این حالت به علت قرارگیری DNA در سطح سلول هدف و افزایش غلظت آن در فضای پیرامونی آن، استعداد و توانایی سلول در جذب و انتقال DNA به درون سیتوپلاسم، افزایش در خور توجهی می‏یابد. همچنین، وجود کاتیون موجود در این ترکیب شیمیایی (Ca2+) به عنوان یک عامل رقابتی برای پل‏ها‏ی Mg2+ پایدارکننده موجود در LPS غشایی خارجی باکتری عمل کرده و باعث بروز ناپایداری در این ساختار می‏شود که نتیجه آن افزایش تراوایی این غشاء نسبت به ماکرو مولکول‏ها‏ی پیرامونی سلول باکتری است. اما در مورد باکتری‏ها‏ی گرم مثبت مانند باسیلوس سوبتیلیس که دارای یک دیواره سلولی تشکیل یافته از پپتیدوگلیکان و تیکوئیک اسید در اطراف خود است استفاده از روش شیمیایی کلرید کلسیم مؤثر و کارامد نیست، زیرا این دیواره بسیار ضخیم‏تر غشاء خارجی موجود در باکتری‏ها‏ی گرم منفی بوده و همچنین، حتی با داشتن ساختارهایی با بار منفی مانند تیکوئیک اسید، کلرید کلسیم فاقد قابلیت لازم است که همانند LPS بتواند در آن باعث بروز ناپایداری و تراوایی شود.

همان‏طور که قبلا اشاره شد در حال حاضر برای انتقال DNA خارجی به درون باکتری باسیلوس سوبتیلیس از روش طبیعی در درون محیط کشت حداقلی اسپیزیزن استفاده می‏شود. در این روش که در سال 1958 ارایه شد از محیط کشت حداقلی استفاده می‏شود که موجب ایجاد ساختار پروتوپلاست یا سلول‏ها‏یی با دیواره ناقص در باسیلوس سوبتیلیس شده و به علت فقدان یا ناقص بودن این سد پپتیدوگلیکانی، در صورت وجود DNA خارجی میزان جذب آن توسط باکتری افزایش می‏یابد. البته در این شرایط تیکوئیک‏اسید موجود در غشاء سلولی باکتری نیز می‏تواند از طریق میانکنش با پپتید به عنوان یک عامل تشدید کننده فعالیت پپتید در سطح غشاء سلول عمل کند. تیکوئیک اسید در ساختار سلولی باکتری‏ها‏ی گرم مثبت به دو صورت حضور دارد؛ یا به شکل متصل به غشاء سیتوپلاسمی است که لیپوتیکوئیک اسید نامیده می‏شود و یا متصل به مورین است که به عنوان تیکوئیک‏اسید دیواره سلولی شناخته می‏شود. در شرایط پروتوپلاست یا وجود دیواره ناقص در اطراف سلول باکتریایی وجود لیپوتیکوئیک اسید با بار الکتریکی منفی می‏تواند به عنوان یک هدف اولیه برای جذب، هدایت و تجمع پپتیدهای کاتیونیک مانند CM11 در سطح غشاء سلول عمل کند (15). به نظر می‏رسد این تجمع اولیه به تسهیل میانکنش پپتید با فسفولیپیدهای غشایی و ایجاد حفره در آن منجر شود (شکل2).

بر این اساس در این مطالعه، ما از پپتید کاتیونیک CM11 به عنوان یک پپتید تراوا کننده غشاء سلولی استفاده نمودیم. پپتید CM11 به علت دارا بودن ساختار آمفی پاتیک این توانایی را دارد که در غشاء سلول باکتریایی نفوذ کرده و با ایجاد حفره در این ساختار باعث نفوذپذیری غشای سیتوپلاسمی آن نسبت به مولکول‏ها‏ی خارجی شود. با استناد به مطالعات انجام شده توسط دکتر یچیل شای[xv] از آن‏جا‏ که پپتید CM11 از 11 اسیدآمینه تشکیل شده است، به علت کوتاهی توانایی این را ندارد که در غشاء به شکل کامل نفوذ کرده و در آن یک حفره کامل ایجاد نماید. بنابراین، پیشنهاد شده است که این پپتید بر اساس مکانیسمی به نام فرش[xvi] با غشاء میانکنش داده و باعث بروز اختلال در آن می‏شود. در این مکانیسم برهم‏کنش میان فسفولیپید‏ها‏ی غشایی با بار منفی و پپتید کاتیونیک (بار مثبت) به فرش شدگی و پوشش کامل سطح غشاء سلولی با لایه ای از پپتید شده که در ادامه باعث ناپایداری غشاء منجر می‏شود (16 و 17).

طبق این مکانیسم در یک غلظت آستانه، پپتید به شکل موقت و ناپایدار سوراخ‏ها‏یی در غشاء ایجاد می‏کند و در صورت ادامه افزایش غلظت، پپتید با پوشاندن سطح داخلی غشاء سلول باکتریایی باعث جداشدن نواحی از غشاء به شکل ساختارهای میسلی می‏شود که در نهایت به از هم پاشیدگی ساختار غشاء و مرگ سلول منجر خواهد شد (18).

همچنین، باید توجه داشت که اتصال اولیه و در ادامه توانایی تشکیل حفره توسط پپتیدها فرآیندهایی مستقل اما پیوسته است که وابسته به غلظت پپتید می‏باشد. بر این اساس بروز و تشدید فعالیت ضد میکروبی این نوع از پپتیدها وابسته به غلظت و بر پایه یک منحنی سیگموئیدی است به نحوی که در زیر آستانه غلظت، پپتید فقط باعث تراوا شدن و ناپایداری غشاء شده اما به ساختار کلی سلول باکتریایی صدمه ای وارد نمی‏شود. در غلظت آستانه که می‏تواند همان حداقل غلظت مهاری[xvii] باشد تخریب ساختار غشاء افزایش یافته که در نهایت منجر به صدمه و مرگ سلول می‏شود (18).

بنابراین، در غلظتی پایین‏تر از غلظت آستانه با وجود متصل شدن پپتید به غشاء باکتریایی، به علت عدم پوشش کافی، فعالیت ضد میکروبی آن کم است اما با نزدیک شدن غلظت پپتید به غلظت آستانه، فعالیت ضد میکروبی به سرعت به بیشینه خود می‏رسد که نتیجه آن مرگ باکتری است. در این مطالعه، اثر پپتید CM11 بر تغییر و افزایش نرخ انتقال پلاسمید در یک سریال غلظتی از 5/0 تا 6 (نزدیک غلظت به MIC) میکروگرم در میلی‏لیتر بررسی شد. مطالعات ما نشان داد که میزان MIC پپتید برای سویه مورد نظر باسیلوس سوبتیلیس 8 میکروگرم بر میلی‌لیتر است که در واقع همان غلظت آستانه پپتید است (19).

همانطور که اشاره شد، به طور کلی ترانسفوراسیون در باکتری باسیلوس سوبتیلیس ناکارآمد و در میزان پایینی انجام می‏شود، این یافته به وضوح در نمونه‌های کنترل این آزمایش مشهود بود. در صورتی‏که نتایج حاصل از نمونه‌های آزمایش، این موضوع را اثبات نمود که با استفاده از پپتید CM11می‌توان بازدهی انتقال پلاسمید pWB980را به درون باکتری باسیلوس سوبتیلیس را به میزان معنی‌داری افزایش داد.

نتایج نشان داد که بالاترین نرخ ترانسفورماسیون باکتری در غلظت 2 میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر رخ می‏دهد (5/6 برابر نسبت به کنترل) که با افزایش غلظت پپتید و نزدیک شدن به غلظت MIC تعداد باکتری‏ها‏ی ترانسفورم شده کاهش می‏یابد. همچنین، میزان نرخ انتقال پلاسمید به باکتری در غلظت‏های 5/0 و 3 میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر تقریبا یکسان بود. تمامی این یافته‏ها‏ در هر دو روش ترانسفورماسیون قابل مشاهده بود؛ اما در روش دوم بازدهی انتقال مقدار بیشتری را نشان می‏داد. بر پایه مباحث اشاره شده در بالا می‏تواند نتیجه گرفت که در روش اول چون باکتری‏ها‏ مدت زمان طولانی‏تری در معرض پپتید قرار گرفته اند، مرگ باکتری‏ها‏ در طی فرآیند مستعد‏سازی به مراتب بیشتر خواهد بود و بنابراین، میزان نرخ ترانسفورماسیون در مقایسه با روش دوم کاهش می‏یابد. همچنین، باکتری‏هایی که در معرض غلظت‏ها‏ی 1، 3 و 6 میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر پپتید تیمار شده اند در مقایسه با باکتری‏ها‏ی تیمار شده توسط غلظت 2 میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر پپتید، نرخ ترانسفورماسیون پایین‏تری دارند که نشان دهنده یک رابطه معکوس میان میزان غلظت پپتید و نرخ انتقال پلاسمید است زیرا افزایش غلظت به نزدیک‏تر شدن به حد MIC منجر شده که در این غلظت مرگ سلولی اتفاق می‏افتد. در غلظت 6 میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر که نزدیک به MIC است نرخ انتقال حتی پایین‏تر از نمونه‏ها‏ی استانداری است که علت آن نزدیک شدن غلظت پپتید به حد آستانه است. همچنین، نتایج نشان است که در غلظت‏ها‏ی 5/0 و 3 میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر پپتید اختلاف در خور توجهی در نرخ انتقال پلاسمید وجود ندارد. به نظر می‏رسد این عدم اختلاف در میزان نرخ ترانسفورماسیون ناشی از یک توازن و تعادل میان تشدید دریافت DNA و مرگ سلول‏ها‏ی باکتریایی توسط پپتید است به طوریکه در غلظت 5/0 میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر نرخ دریافت DNA پایین‏تر از میزان دریافت آن در غلظت 3 میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر است اما در مقابل نیز مرگ باکتری‏ها‏ در مقیاس کمتری رخ می‏دهد.

 این مطالعه نشان داد که پپتید CM11 به عنوان یک پپتید کاتیونی تراوا کننده غشاء سلولی می‏تواند موجب افزایش بازدهی انتقال پلاسمید به درون باکتری باسیلوس سوبتیلیس شود. بنابراین، مطالعه فوق می‏تواند به عنوان مقدمه ای برای شناخت بیشتر این نوع پپتیدها به منظور کاربرد مؤثرتر آن‏ها‏ برای افزایش بازدهی انتقال پلاسمید به درون سلول‏ها‏ی باکتریایی باشد.



[1]. Bacillus subtilis

[2]. Spizizen

[3]. Cell Permeable Peptides

[4]. Pore

[5]. Cecropin

[6]. Melittin

[7]. Hyalophora cecropia

[8]. p-methyl-benzhydrylamine

[9]. Electrosprayionizationmassspectrometry

[10]. Amersham, England

[11]. Invitrogen, USA

[12] . g

[13] . t-Test

[14] .ANOVA

[xv]. YechielShai

[xvi]. Carpet Model

[xvii]. MinimalInhibitoryConcentration

References

(1) Wong SL. Advances in the use of Bacillus subtilis for the expression and secretion of heterologous proteins. Curr Opin Biotechnol 1995; (6): 517–22.

(2) Harwood CR, Wipat A. Functional analysis of the B.subtilis genome. Methods microbial 2002; (33): 336-67.

(3) Doi RH, Wong S, and Kawamura, F. potential use of bacillus subtilis for secretion and production of foreign protein. Trend Biotechnol 1984; (4): 232-5.

(4) Wu XC, Lee W, Tran L, and Wong SL. Engineering a Bacillus subtilis expression-secretion system with a strain deficient in six extracellular proteases. J Bacteriol 1991; 173(16): 4952-8.

(5) Ye R, Yang P, Wong S. Construction of protease deficient Bacillus subtilis strains for expression studies: inactivation of seven extracellular proteases and the intracellular LonA protease. Proceedings of the International Symposium on Recent Advances in Bioindustry; The Korean Society for Applied Microbiology, Seoul, Korea. 1996; 160-9.

(6) Spizizen, J. Transformation of Biochemically Deficient Strains of Bacillus Subtilis by Deoxyribonucleate. Proc Natl Acad Sci 1958; 44(10): 1072-8.

(7) Lundberg P, Langel U. A brief introduction to cell-penetrating peptides. J Mol Recognit 2003; 16(5): 227-33.

(8) Friedrich CL, Moyles D, Beveridge T, and Hancock E. Antibacterial action of structurally diverse cationic peptides on gram-positive bacteria. Antimicrob Agents Chemother 2000; 44(8): 2086-92.

(9) Torcato IM, Huang YH, Franquelim HG, Gaspar D, Craik DJ, and et al. Design and characterization of novel antimicrobial peptides, R-BP100 and RW-BP100, with activity against Gram-negative and Gram-positive bacteria. Biochim Biophys Acta 2013 Mar; 1828(3):944-55.

(10)             Moore AJ, Beazley WD, Bibby MC, and Devine DA. Antimicrobial activity of cecropins. J Antimicrob Chemother 1996; 37(6): 1077-89.

(11)             Raghuraman H, Chattopadhyay A. Melittin: a membrane-active peptide with diverse functions. Biosci Rep 2007; 27(4-5): 189-223.

(12)            Cavallarin L, Andreu D, and Segundo B. Cecropin A-derived peptides are potent inhibitors of fungal plant pathogens. Mol plant-microbe interact 1998; 11(3): 218-27.

(13)            Montesinos E. Antimicrobial peptides and plant disease control. FEMS microbiol lett. 2007; 270(1): 1-11.

(14)            Badosa E. Ferre R, Planas M, Feliu L, Besalu E, and et al. A library of linear undecapeptides with bactericidal activity against phytopathogenic bacteria. Peptides 2007; 28(12): 2276-85.

(15)             Pesche A. How do bacteria resist human antimicrobial peptides? Trends in Microbiol 2002; 10 (4):179- 86.