ارزیابی میزان حساسیت و ویژگی آزمون هوج در تشخیص مقاومت به کارباپنم از نمونه‏ها‏ی کلبسیلا پنومونیه

نویسندگان

1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، ‏دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات استان مرکزی، ‏اراک، ‏ایران

2 دانشیار میکروبیولوژی، ‏مرکز تحقیقات آزمایشگاه‏ها‏ی رفرانس ایران، ‏‏تهران، ‏ایران

چکیده

  مقدمه: کارباپنم آخرین سد دفاعی در برابر عفونت ‏ های باکتریایی گرم منفی ای است که بر آنتی بیوتیک‏ها‏ی با طیف اثر وسیع مقاوم می‏باشند، ‏از این رو استفاده از روشی مناسب، ‏برای تعیین تولید آنزیم کارباپنماز در این عوامل عفونی که مهار کننده آنتی بیوتیک کارباپنم است‏، ‏امری ضروری به نظر می‏رسد. ‏هدف از این مطالعه، ‏بررسی کیفی آزمون هوچ برای یافتن روشی مناسب برای تعیین کارباپنماز است .   مواد و روش ‏‏ ها: تعداد 36 نمونه کلبسیلا پنومونیه با مقاومت آنتی بیوتیکی چندگانه و مولد آنزیم کارباپنماز از مراکز بیمارستانی و آزمایشگاه‏های تشخیص طبی جمع آوری و با کمک روش کروم آگار تایید شد. ‏تمامی نمونه‏ها‏ از نظر هاله عدم رشد برگ شبدری در روش دیسکی آزمون هوج طبق دستورالعمل CLSI بررسی شدند .   نتایج: تمامی نمونه‏ها‏ جمع آوری شده از نظر تولید کارباپنماز با روش کروم آگار تایید و سپس تعداد 30 مورد با روش آزمون هوچ، ‏مثبت گزارش شد. ‏تمامی موارد مثبت آزمون هوچ با کروم آگار تایید شد. ‏حساسیت روش هوچ 3/83 درصد ‏محاسبه شد. ‏همچنین، تمامی ایزوله‏ها‏ی کنترل منفی با نتیجه منفی همراه بوده و اختصاصیت آزمون 100 درصد ‏گزارش شد‏. ‏از سوی دیگر مشاهده شد که تمامی موارد مثبت، ‏به آنتی بیوتیک‏ها‏ی آمپی سیلین، ‏آمیکاسین، ‏جنتامایسین، ‏تتراسایکلین، ‏سفتازیدیم، ‏سیپروفلوکساسین و ایمی پنم مقاوم بوده اند .   بحث و نتیجه ‏ گیری: با توجه به نتایج به‏دست‏ آمده از آزمون هوج بر روی نمونه‏ها‏ی جمع آوری شده، ‏استفاده از این روش در تشخیص‏ها‏ی اولیه و در شرایطی که تهیه محیط‏ها‏ی اختصاصی و یا استفاده از روش‏ها‏ی مولکولی مقدور نیست، ‏می‏تواند‏‏ در امر تشخیص مناسب باشد .

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Evaluation of sensitivity and specificity of Hodge Test in diagnosis of carbapenem resistance in Klebsiella pneumoniae isolates

نویسندگان [English]

  • Bahareh Hajihashemi 1
  • Mohammad Farzanehkhah 1
  • Masoud Hajia 2
  • Mohammad Rahbar 2
1 MSc of Microbiology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Arak, Iran
2 Associate Professor of Microbiology, Reference Health Laboratories Research Center, Tehran, Iran
چکیده [English]

  Introduction : Carbapenem is the last defensive line against gram negative bacterial infections that are resistant to extended spectrum antibiotics. Hence, using a proper method for determining the production of carbapenemase enzyme which controls the infection factors resistant to carbapenem antibiotic seemed to be essential. The aim of this study was qualitative analysis of Hodge test for finding a suitable method in determining carbapenemase .   Materials and methods : Thirty six samples of Klebsiella pneumoniae with multiple antibiotic resistances capable of producing carbapenemase enzyme were collected from medical centers and laboratories, and approved through CHROMagar method. All the samples were analyzed with regards to the form of sensitive zone as clover shape in Hodge test, according to CLSI instruction .   Results : All collected samples were identified for carbapenemase producing with CHROMagar KPC method. Thirty samples were reported positive with Hodge test, respectively. The sensitivity of Hodge test was calculated to be 83.3%. Also, all the negative control isolations were accompanied by negative result and its sensitivity was reported to be 100%. On the other hand, it was observed that all the positive cases were resistant to antibiotics including Ampicillin, Amikacin, Gentamicin, Tetracycline, Ceftazidime, Ciprofloxacin and Imipenem .   Discussion and conclusion : According to the obtained results from Hodge test on the collected samples, using this method was determined to be appropriate in primary diagnosis and under the conditions where preparation of specific culture media or using molecular methods was not possible .

کلیدواژه‌ها [English]

  • Klebsiella pneumoniae
  • Extended spectrum β-lactamase
  • Carbapenemase
  • Modified Hodge test

مقدمه

امروزه عفونت‏ها‏ی ناشی از انتروباکتریاسه‏ها‏ی مقاوم به کارباپنم رو به گسترش بوده و این امر نگرانی‏ها‏یی را در حیطه درمان ایجاد کرده است. ‏انتروباکتریاسه‏ها‏ی مقاوم به کارباپنم به طور معمول نه تنها به آنتی‏بیوتیک‏ها‏ی بتالاکتام بلکه به اکثر کلاس‏های ضدمیکروبی نیز مقاوم هستند. ‏کارباپنم آخرین سد دفاعی در برابر عفونت‏های باکتریایی گرم منفی است که بر آنتی بیوتیک‏ها‏یی با طیف اثر وسیع مقاوم است‏ (1).‏ ‏از جمله کارباپنم‏ها‏ می‏توان‏ ایمی پنم، ‏مروپنم و ارتاپنم را نام برد که طیف اثر گسترده تری نسبت به سایر آنتی بیوتیک‏ها‏ی بتالاکتام دارند. بهترین درمان در عفونت‏ها‏ی ایجاد شده توسط انتروباکتریاسه‏ها‏یی است‏ که تولید کننده بتالاکتامازهای مختلف هستند. ‏با افزایش استفاده از کارباپنم‏ها‏، ‏شمار باکتری‏ها‏ی مقاوم با مکانیزم‏ها‏ی مقاومتی متفاوت رو به افزایش است‏ (2).‏ ‏از مهم‏ترین مکانیزم‏ها‏ی مقاومتی علیه کارباپنم تولید کارباپنماز است‏ که KPC و VIM از شایع‏ترین آن‏ها‏‏ در انتروباکتریاسه‏ها‏ هستند (1).‏ ‏کلونی‏ها‏ی انتروباکتریاسه‏ها‏ی مقاوم به کارباپنم که از بیماران جداسازی و نگه‏داری می‏شود خود می‏توانند منبع انتقال این باکتری‏ها‏ باشند. ‏

کارباپنماز، ‏برای اولین بار در سال 1996 میلادی در ایالات متحده کشف و پس از آن گسترش جهانی یافت (3).‏ ‏از دیگر کشورهای پیشرو پس از ایالات متحده می‏توان‏ اسرائیل، ‏شمال شرقی آمریکا و یونان را نام برده که تولید آن آندمیک شده است. جدا سازی کارباپنماز از کلبسیلا پنومونیه برای اولین بار ‏در سال 2001 میلادی انجام شد‏ (4) و پس از آن برخی کشورهای اروپایی از جمله فنلاند، ‏آلمان، ‏فرانسه، ‏ایتالیا، ‏نروژ و هلند و همچنین انگلستان موفق به این امر شدند (5 و 6). در ادامه نیز برخی کشورهای آسیایی از جمله ایران و ترکیه، ‏عربستان و ‏عراق نیز به مطالعه و جداسازی کارباپنماز پرداختند (7-10).‏ ‏

از روش‏ها‏ی قابل انجام برای شناسایی کارباپنماز، ‏می‏توان‏ آزمون هوچ و بررسی مولکولی ژن‏ها‏ی موثر را نام برد. ‏در کنار روش‏ها‏ی ذکر شده، استفاده از محیط‏ها‏ی میکروبیولوژی اختصاصی کروموژنیک نیز از جمله روش‏ها‏ی مورد اعتماد است‏ (11).‏ ‏

 هدف از انجام این مطالعه، بررسی میزان کارایی تشخیص اختصاصی کلبسیلا پنومونیه کارباپنماز مثبت  با استفاده از روش آزمون هوچ‏ در سویه با مقاومت چندگانه خواهد بود. ‏در این آزمون، ‏رشد باکتری مورد سنجش در برابر باکتری حساس (E.coli) به دیسک آنتی بیوتیک (مروپنم و یا ارتاپنم) کشت داده شده و هاله عدم رشد برگ شبدری باکتری حساس (E.coli) بررسی می‏شود. ‏

 

مواد و روش‏ها

جمع آوری نمونه‏ها‏

تعداد 36 ایزوله کلبسیلا پنومونیه مولد آنزیم کارباپنماز جمع آوری شده از مراکز درمانی دو استان تهران و استان اصفهان، ‏بر روی محیط بلاد آگار کشت داده شد. ‏معیار انتخاب نمونه‏ها‏، ‏مقاومت‏ها‏ی چندگانه آنتی بیوتیکی و تولید آنزیم کارباپنماز بودند که در تشخیص‏ها‏ی ابتدایی برای آن‏ها‏‏ گزارش شده است. ‏نمونه‏ها‏ شامل: ترشحات‏ها‏ی ریوی، ‏مایع شکمی، ‏مجاری ادراری، ‏مایع مغزی نخاعی، ‏مایع چشمی، ‏بافت و زخم حاصل از سوختگی بودند. ‏

تشخیص کلبسیلا در مراکز جمع آوری نمونه با توجه به ظاهر کلونی به دلیل وجود کپسول، ‏رنگ‏آمیزی گرم و پس از آن استفاده از محیط‏ها‏ی افتراقی شامل: اوره آز، ‏سیمون سیترات، ‏TSI MR-VP, و SIM انجام شد‏. ‏همچنین، ارزیابی تولید آنزیم کارباپنماز توسط محیط کروموژنیک CHROMagarKPC انجام شد. ‏

آزمون تاییدی آنزیم کارباپنماز

ابتدا تمامی نمونه‏ها‏ در محیط CHROMagarKPC کشت و رشد بر روی آن بررسی شد تا از وجود آنزیم کارباپنماز در نمونه‏ها‏ اطمینان حاصل شود‏. ‏برای این منظور ابتدا محیط پایه CHROMagarOrientation  بر طبق شرکت سازنده به غلظت 33 گرم در لیتر آب مقطر تهیه، ‏جوشانده وسپس اتوکلاو شد. ‏سپس محلول مکملی CHROMagarKPCsupplement را با غلظت 40 میلی گرم در میلی لیتر تهیه و به میزان 10 میلی‏لیتر به هر لیتر محیط پایه اضافه شد. ‏تقسیم محیط تهیه شده به پلیت‏ها‏ انجام و پس از سرد شدن آن‏ها‏‏‏، ‏کشت نمونه‏ها‏ بر روی محیط کروم آگار ساخته شده انجام شد. ‏رشد باکتری‏ها - نشان از وجود کارباپنماز و نوع باکتری تولید کننده این آنزیم است -، ‏همراه با رنگ کلونی‏ها‏ی ایجاد شده بررسی شد. ‏در صورتی‏که باکتری ذکر شده اشریاشیاکلیباشد، کلونی‏ها‏ی صورتی پررنگ مایل به قرمز، ‏اگر کلبسیلا، ‏سیتروباکتر و انتروباکترباشد به رنگ آبی متالیک و اگر سودوموناس باشدکلونی‏ها‏ی کرم، ‏مات و شفاف ایجاد می‏کند. ‏

آزمون هوچ‏[1]

این آزمون‏، ‏طبق دستورکار CLSI[2] انجام شد، ‏شرح وقایع بدین شکل‏ است که:

سوسپانسیون باکتری با رقت نیم مک فارلند از باکتری E.coli ATCC 25922 تهیه شد. ‏تهیه رقت 10/1 با محیط مولر هینتون براث و یا سالین از سوسپانسیون مرحله قبل با رقت نیم مک فارلند تهیه شد‏. ‏

کشت چمنی با سواپ استریل از سوسپانسیون با رقت 10/1 E. ‏coliATCC25922 بر روی محیط مولر هینتون آگار انجام شد‏. ‏برای خشک شدن کشت مذکور، ‏در دمای اتاق به مدت 3 الی 5 دقیقه انکوبه شد‏.

یک دیسک مروپنم 10 میکروگرمی در مرکز پلیت قرار داده شد.

باکتری مورد آزمایش برای بررسی کارباپنماز از لبه دیسک قرار داده شده در مرکز به سمت لبه پلیت، ‏کشت خطی داده شد. ‏با دقت به این موضوع که سواپ با دیسک برخورد نکند. ‏در 2 ± 35 درجه سانتی‏‏گراد به مدت 16 تا 24 ساعت انکوبه شد. ‏پس از گذشت مدت زمان انکوبه، ‏بررسی هاله عدم رشد به شکل برگ شبدری در نمونه‏ها‏ی تولید کننده کارباپنماز انجام شد‏. مقایسه شکل هاله عدم رشد نمونه کنترل مثبت با نمونه‏ها‏ی انجام شده برای تشخیص موارد مثبت در آزمون‏ هوچ انجام شد. ‏

تعداد 15 نمونه از سوش‏ها‏ی کلبسیلا پنومونیه ای که تولید کننده کارباپنماز نبودند برای تعیین اختصاصیت آزمایش شدند. ‏

 

نتایج

تمامی نمونه‏ها‏ی جامعه آماری با آزمون‏ CHROMagarKPC تایید و مثبت گزارش شدند. ‏ازآنجاکه تمامی نمونه‏ها‏ی جمع آوری شده کلبسیلا پنومونیه بودند، ‏با رنگ آبی بر روی محیط مذکور رشد پیدا کردند. ‏

از 36 ایزوله جمع آوری شده تنها 30 مورد از آن‏ها‏‏ با ایجاد هاله عدم رشد برگ شبدری در آزمون هوج ثبت شدند. ‏تصاویر برخی از نمونه‏ها‏ی انجام شده با آزمون هوچ در شکل 1 قابل مشاهده هستند.

تمامی نمونه‏ها‏ی کنترل، ‏برای تعیین اختصاصیت که تولید کننده کارباپنماز نبودند در آزمون هوج با نتیجه منفی همراه بودند. ‏

باتوجه به میزان فراوانی مثبت‏ها‏ در روش آزمون هوچ‏ و همچنین نتایج ایزوله‏ها‏ی کنترل منفی، ‏میزان حساسیت این روش 3/83 درصد‏، ‏و اختصاصیت یا ویژگی آن 100 درصد ‏محاسبه می‏شود‏. ‏این مقادیر با توجه به نتایج به‏دست‏ آمده از فراوانی نمونه‏ها‏ی مثبت واقعی و نمونه‏ها‏ی منفی واقعی به‏دست‏ آمده است. ‏

در بررسی آنتی بیوگرام گزارش شده از مراکز جمع آوری نمونه‏ها‏، این نتیجه به دست آمد که تمامی آن‏ها‏‏ به آنتی بیوتیک‏ها‏ی آمپی سیلین، ‏آمیکاسین، ‏جنتامایسین، ‏تتراسایکلین، ‏سفتازیدیم، ‏سیپروفلوکساسین و ایمی پنم مقاوم هستند.

 ‏

 

 

‏شکل 1- تصاویری از نتایج آزمون هوج، نمونه های شماره241، 242، 243، 244، 134، 220، 221 مثبت و نمونه های شماره 135، 136، 219 منفی هستند.

 


فراوانی انواع نمونه‏ها‏ی مثبت به این شرح گزارش می‏شود: عفونت زخم‏ها‏ی حاصل از سوختگی با بالاترین درصد به مقدار 27 (75 درصد‏) و پس‏ از آن به ترتیب نمونه‏ها‏ی ادراری6 (7/16 درصد‏)، ‏نمونه‏ها‏ی ریوی 2 (6/5 درصد‏) و مایع مغزی نخاعی یک مورد(8/2 درصد‏) هستند. ‏نمودار فراوانی نمونه‏ها‏ در شکل 2 مشاهده می‏شود‏‏. ‏

 

شکل 2- نمودار درصد تنوع نمونه های مثبت

 

بحث و نتیجه‏گیری

امروزه مقاومت‏ها‏ی چندگانه باکتریایی مشکلات بسیاری را در زمینه درمان ایجاد کرده است . از این رو مطالعات بسیاری برای شناسایی آن‏ها‏‏ و راه‏ها‏ی مناسب برای درمان صحیح انجام می‏شود. ‏از آن‏جایی که عفونت‏های انتروباکتریاسه و در این گروه کلبسیلا پنومونیه از موارد شایع در عفونت‏های گزارش شده هستند، لازم است ‏بررسی‏ها‏ی بسیاری در این زمینه انجام شود. ‏از طرفی انتخاب موثرترین آنتی بیوتیک با کم‏ترین عوارض ناشی از مصرف آن و همچنین، تعیین حداقل‏‏ترین میزان تجویز یک آنتی بیوتیک بسیار ضروری است‏. ‏تعیین MIC باکتری و همچنین، شناسایی عامل مقاومت، ‏انتخاب صحیح آنتی بیوتیک را امکان‏پذیر می‏سازد. ‏

در خصوص روش‏ها‏ی تشخیص عوامل مقاومت، ‏در مطالعه ای که برای شناسایی کارباپنماز از کلبسیلا پنومنیه در سال 2008 میلادی بر روی 122 نمونه کلبسیلا پنومونیه جدا شده از مدفوع انجام شد، ‏نتایج چنین گزارش شده بود که 43 مورد(2/35 درصد‏) بر روی محیط کروم آگار رشد کلونی داشته و از این تعداد 38 مورد (1/31 درصد‏) آن‏‏ها‏‏‏ آزمون‏ هوچ مثبت گزارش شده است. ‏از این رو حساسیت آزمون هوچ‏ را می‏توان‏‏ در مطالعه یاد شده حدود 3/88 درصد ‏محاسبه کرد. با توجه به میزان به‏دست‏ آمده در مطالعه حاضر که 3/83 درصد است، می‏توان حساسیت این دو آزمون را تقریبا مشابه دانست (11).‏ ‏

در مقایسه ای که بین کروم آگار KPC و محیط مکانکی آگار حاوی ایمی پنم انجام شد‏، ‏اختصاصیت و حساسیت برای کروم آگار به ترتیب 100 ‏و ‏8/98 درصد ‏و برای محیط مکانکی آگار حاوی ایمی پنم 7/94 درصد، ‏6/88 درصد ‏محاسبه شد‏ (12).‏ ‏

امروزه بررسی مولکولی ژن‏ها‏ی مقاومت باکتری به دلیل وجود MIC‏‏ ها‏‏ی پایین در برخی ازآن‏‏ها‏‏‏، ‏مورد توجه بسیاری قرار گرفته است. ‏حساسیت و اختصاصیت بالای این روش، ‏صرف زمان کمتر در انجام آزمون‏‏‏ها‏‏ی مورد نظر در مقایسه با روش‏‏ها‏‏ی فنوتیپی ذکر شده، از دیگر دلایلی است که اهمیت آزمون‏‏ها‏ی مولکولی را نسبت به روش‏ها‏ی تشخیصی از جمله تعیین ژن‏ها‏ی مقاومت در باکتری‏ها بیشتر می‏کند. مهم‏ترین ژن های کارباپنماز ‏در باکتری کلبسیلا پنومونیه که در آزمون‏های مولکولی بررسی می‏شوند ژن های blaKPC, blaIMP, blaNDM هستند (13- 15).‏ ‏

با توجه به افزایش و تغییرات میزان مقاومت‏ها‏ی آنتی‏بیوتیکی در گذشت زمان و از سوی دیگر، ‏اهمیت بسیار در سرعت و صحت تشخیص آنتی بیوتیک‏‏ها‏‏ی درمانی، ‏باید روش‏‏ها‏‏یی استفاده شود که از اطمینان بیشتری برخوردار باشند. همچنین ‏از آن‏جایی که عفونت‏ها‏ی کلبسیلایی ازجمله عفونت‏ها‏ی شایع بیمارستانی هستند و مقاومت‏ها‏ی چندگانه آنتی بیوتیکی در آن نیز رو به افزایش است، ‏بنابراین‏ روشی با ضریب اطمینان بالا و همچنین، درجه حساسیت و اختصاصیت مطلوب می‏تواند‏‏ کارساز باشد. ‏

در پایان می‏توان‏ چنین نتیجه‏گیری کرد که استفاده از آزمون هوج می‏تواند‏‏ در بررسی‏ها‏ی اولیه سنجش کارباپنماز ‏‏موثر باشد. این در شرایطی است که هزینه‏ها‏ی ناشی از تهیه محیط‏ها‏ی اختصاصی کروموژنیک و همچنین، استفاده از روش‏ها‏ی مولکولی محدودیت‏ها‏ی دارد‏. ‏ولی لازم است هنگام استفاده از این آزمون نسبت به درصد احتمال موارد منفی کاذب آن هوشیار بود.

 



[1]. Hodge Test

[2]. Clinical and Laboratory Standards Institute

 

 References

(1) Tato M, Morosini M, García L, Albert S, Coque MT, Canton R. Carbapenem Heteroresistance in VIM-1-Producing Klebsiella pneumoniae Isolates Belonging to the Same Clone: Consequences for Routine Susceptibility Testing. J Clin Microbiol.2010; 48(11): 4089–93.

(2) Bratu S, Tolaney P, Karumudi U, Quale J, Mooty M, Nichani S, et al. Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY: molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents. J Antimicrob Chemoth. 2005; 56(1): 128–32.

(3) Lolans K, Calvert K, Won S, Clark J, Hayden MK. Direct Ertapenem Disk Screening Method for Identification of KPC-Producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coliin Surveillance Swab Specimens. J Clin Microbiol.2010; 48(3): 836–41.

 

(4) Doi Y, Potoski BA, Adams-Haduch JM, Sidjabat HE, Pasculle AW, Paterson DL. Simple Disk-Based Method for Detection of Klebsiella pneumoniae Carbapenemase-Type β-Lactamase by Use of a BoronicAcid Compound. J Clin Microbiol.2008; 46(12): 4083–6.

(5) Giakoupi P, Maltezou H, Polemis M, Pappa O, Saroglou G, Vatopoulos A, et al. KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae infections in Greek hospitals are mainly due to a hyper epidemic clone. EuroSurveill. 2009; 14(21): 19218.

(6) Amirmozafari N, Tehrani HF, Langeroodi Z, Abdullahi A. Survey of drug resistance due to extended spectrum β-lactamases in Klebsiella pneumoniae strains isolated from hospitalized patients. Journal of the faculty of medicine. 2007; 31(3): 241-5

(7) Shahcheraghi F, Moezi H. ESBLs in K. pneumoniae isolates from Tehran’s hospitals clinical samples. J of infectious diseases and tropical Medicine , 2007; 12(39): 57-60 (article in Persian)

(8) Aktas Z, Bal C, Midilli K, Poirel L, Nordmann P. First IMP-1 producing Klebsiella pneumoniae isolate in Turkey. Clin Microbiol Infect. 2006; 12(7):695-6.

(9) Carrër A, Poirel L, Yilmaz M, Akan OA, Feriha C, Cuzon G, et al. Spread of OXA-48–encoding plasmid in Turkey and beyond. Antimicrob Agents Chemother. 2010; 54(3):1369–73.

(10)            Guerin F, C.Henegar, G.Spiridon, O.Launay, D.Salmon-Ceron, C.Poyart. Bacterial prostatitis due to P.aeruginosa harboring the blaVIM-2 metallo b-lactamase gene from Saudi Arabia. J.Antimicrob. Chemother. 2005; 56(3):601-2

(11)            Samra Z, Bahar J, Madar-Shapiro L, Aziz N, Israel S, Bishara J. Evaluation of CHROMagar KPC for Rapid Detection of Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 2008; 46(9): 3110–11.

 

(12)            Panagea Th, Galani I, Souli M, Adamou P, Antoniadou A, Giamarellou H. Evaluation of CHROMagar KPC for the detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in rectal surveillance cultures. Int J Antimicrob Ag. 2011; 37(2): 124-8.

(13)            Cole JM, Schuetz AN, Hill CE, Nolte FS. Development and Evaluation of a Real-Time PCR Assay for Detection of Klebsiella pneumoniae Carbapenemase Genes. J Clin Microbiol. 2009; 47(2): 322–6.

(14)            Poirel L, Walsh TR, Cuvillier V, Nordmann P. Multiplex PCR for detection of acquired carbapenemase genes. Diagn Micr Infec Dis. 2011; 70(1): 119–23.

(15)            Hindiyeh M, Smollen G, Grossman Z, Ram D, Davidson Y, Mileguir F, et al. Rapid Detection of blaKPC Carbapenemase Genes by Real-Time PCR. J Clin Microbiol. 2008; 46(9): 2879–83.