جداسازی و شناسایی باکتری تولید کننده بیوسورفکتانت از جنس سودوموناس آئروژینوزا و بررسی اثرات ضد باکتریایی بیوسورفکتانت تولیدی در شرایط آزمایشگاهی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه ایلام، ایران

2 استادیار میکروبیولوژی صنعتی، دانشگاه ایلام، ایران

چکیده

  مقدمه: بیوسورفکتانت­ها ترکیبات زیستی آمفی­فیلیک به شکل خارج سلولی یا بخشی از غشاء­های سلولی تولید شده به‏وسیله‏‏ انواع میکروارگانیسم‏ها هستند که به علت استفاده از آن‏ها‏ در صنایع مختلف از اهمیت ویژه­ای برخوردارند. بنابراین، هدف از این پژوهش شناسایی یک سویه باکتری از جنس سودوموناس آئروژینوزا ‏‏ تولید کننده بیوسورفکتانت بود .   مواد و روش ‏‏ ها: در این پژوهش، نمونه­های مختلف از نفت، آب و خاک آلوده به نفت تهیه شدند. فعالیت همولیتیک، فعالیت امولسیفیه کنندگی و اندازه­گیری کشش سطحی استفاده و سویه انتخابی به‏وسیله‏‏ آزمایش‏‏­های بیوشیمیایی شناسایی شدند. همچنین، ماهیت بیوسورفکتانت و اثرات ضد باکتریایی نیز برای سویه­ انتخابی بررسی شد .   نتایج: در این پژوهش، 88 سویه باکتریایی جداسازی شدند. از میان آن‏ها‏ 24 سویه دارای فعالیت همولیتیک بودند که از میان آن‏ها‏ 14 سویه فعالیت امولسیفیه کنندگی بالای70 درصد داشتند و در نهایت، از میان آن‏ها‏ 4 سویه قادر به رساندن کشش سطحی به کمتر از 40 میلی‏‏نیوتن بر متر بودند. براساس آزمایش‏‏­های بیوشیمیایی، یک سویه انتخابی در این پژوهش، به عنوان سودوموناس آئروژینوزا 83، شناسایی و انتخاب شد. نتایج بررسی ماهیت بیوسورفکتانت با کروماتوگرافی لایه نازک [i] مشخص شد که از نوع گلیکولیپیدی بود. همچنین، بیوسورفکتانت­ تولیدی سویه­ انتخابی دارای فعالیت ضد باکتریایی بر علیه 6 باکتری عفونت­زا بودند. حساس­ترین باکتری نسبت به تاثیر عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس­آئروژینوزا 83 و استافیلوکوکوس اورئوس و مقاوم­ترین باکتری نسبت به این عصاره، پروتئوس میرابیلیس است. همچنین، نتایج حداقل غلظت مهارکنندگی [ii] و حداقل غلظت کشندگی [iii] نشان داد که حداقل غلظت مهارکنندگی عصاره دررقت 63 و 125 میلی‏‏گرم بر میلی‏‏لیتر به ترتیب بر روی باکتری اشریشیا کلی ، استافیلوکوکوس اپیدرمیس و استافیلوکوکوس اورئوس موثر بود. همچنین، حداقل غلظت کشندگی عصاره در رقت 63 و 125 میلی‏‏گرم بر میلی‏‏لیتر به ترتیب بر روی استافیلوکوکوس اپیدرمیس و استافیلوکوکوس اورئوس اثر داشت . بحث و نتیجه ‏ گیری: سودوموناس آئروژینوزا قابلیت بالایی در کاهش کشش سطحی و بیوسورفکتانت استخراج شده از آن دارای اثرات ضدباکتریایی بالایی­ است. بنابراین،‏‏ می­توان گفت که این باکتری­ دارای پتانسیل فراوانی برای کاربرد­های بیوتکنولوژی و زیست محیطی است‏ .   [i] . TLC   [ii] . Minimal Inhibitory Concentration ( ‏‏ MIC) ‏‏   [iii] . Minimal Bacteriocidal Concentration ( ‏‏ MBC) ‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and identification of biosurfactant-producing strains from the genus Pseudomonas aeruginosa and antibacterial effects of biosurfactant production in vitro

نویسندگان [English]

  • Mohammad javad Mostafapour-Rami 1
  • Salman Ahmadi-Asbchin 2
1 M.Sc of Microbiology, University of Ilam, Iran
2 Assistant Professor of Industrial Microbiology, University of Ilam, Iran
چکیده [English]

  Introduction: Biosurfactants are amphiphilic biological compounds produced extracellularly or as part of the cell membranes by a variety of microorganisms . Because of their use in various industries, they are of a particular importance. The aim of this study was to identify a strain of bacteria of the genus Pseudomonas aeruginosa biosurfactant producers .   Materials and methods: In this study, different samples of oil, water and soil contaminated with oil were prepared. Hemolytic activity, emulsification activity and measurement of surface tension were used and selected strains were identified by biochemical tests. The nature and effect of antibacterial biosurfactant was evaluated for strain selection .   Results: In this study, eighty eight bacterial strains were isolated. Twenty four strains were isolated from the isolated strains with hemolytic activity . Among which, 14 strains have emulsification activity more than 70% and at last four strains reached surface tension to be less than 40 mN/m. Selected strain based on biochemical tests was recognized as a Pseudomonas aeruginosa. The nature of biosurfactant was determined by TLC, and proved to be of glycolipid kind. Therefore, the produced biosurfactant of the selected strain had antibacterial activity against six bacterial infectious. Sensitive bacteria to the effects of biosurfactant extract of Pseudomonas aeruginosa83 , was Staphylococcus aureus and the most resistant bacteria to these extract, was the Proteus mirabilis. The results of MIC, MBC showed that MIC of the extract in concentration of 63 and 125 mg/ml on Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus respectively. Also, the MBC were extract in concentration of 63 and 125mg/ml on Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus respectively . Discussion and conclusion : Pseudomonas aeruginosa had high potential in reducing the surface tension and biosurfactant extracted had high antibacterial effects. Therefore, it could be said that this bacterium had a great potential for applications of biotechnology and the environment .

کلیدواژه‌ها [English]

  • Pseudomonas aeruginosa
  • Biosurfactant
  • Surface tension
  • Emulsification
  • Glycolipid
  • Antibacterial

مقدمه

بیوسورفکتانت­ها ترکیبات زیستی آمفی­فیلیکی تولید شده ‏‏به شکل خارج سلولی یا بخشی از غشاء­های سلول به‏وسیله‏‏ انواع میگروارگانیسم­ها هستند. بیوسورفکتانت­ها از لحاظ تجاری به علت استفاده در صنایع مختلف از جمله صنعت نفت، پتروشیمی، غذایی، داروسازی پزشکی، آرایشی، کشاورزی، نساجی، کاغذ‏سازی، چرم‏سازی و غیره از اهمیت ویژه­ای برخوردارند. به همین جهت میکروارگانیسم­های تولید کننده این ترکیبات به علت دارا بودن نسبت بالای سطح به حجم و ظرفیت متنوع بیوسنتتیک، کاندیدای مناسبی برای‏‏ گسترش تولید بیوسورفکتانت هستند ‏‏(‏‏1 و 2) ‏‏. در پزشکی حرکت سوارمینگ و تشکیل بیوفیلم اعمال مهم در کلونیزاسیون سطح به وسیله باکتری­ها هستند و احتمال بروز عفونت­ها را افزایش می­دهد. بیوسورفاکتانت­ها برای جلوگیری از چسبندگی ارگانیسم­های بیماری­زا به سطوح جامد یا به محل‏های عفونت، تولید شده­اند.سورفاکتین باعث کاهش میزان تشکیل بیوفیلم به‏وسیله‏‏ سالمونلا تیفی­موریوم، سالمونلا انتریکا، اشریشیا­کلی و پروتئوس­میرابیلیس در پلی‏وینیل‏کلراید و همچنین، در سوندهای مجرا­ی وینیل می­شود. به تازگی، از بیوسورفکتانت ال-فرمنتوم به منظور مهار عفونت استافیلوکوکوساورئوس و چسبندگی برای ایمپلنت­های جراحی گزارش شده است ‏‏(‏‏3) ‏‏. بیوسورفاکتانت‌ها کاربردهای بسیار گسترده‌ای در صنایع غذایی هم دارند. در حال حاضر، گروهی از این ترکیبات به‌عنوان افزودنی‌های مجاز مواد غذایی به‏کار می‌روند. برای مثال، لسیتین و مشتقات آن، استرهای اسیدهای چرب حاوی گلیسرول، سوربیتان[1] یا اتیلن‏گلیکول و مشتقات اتیوکسیلات منوگلیسریدهای حاوی یک الیگوپپتید، در تمام دنیا به ‌عنوان عوامل امولسیونه­کننده در مواد­ غذایی استفاده می‏شوند ‏‏(‏‏4 و 5)‏‏. بیوفیلم به عنوان گروهی از باکتری­هایی است که در یک سطح کلونیزه می­شوند. بیوفیلم نه تنها شامل باکتری­ها، بلکه توصیف همه مواد خارج­سلولی تولید شده در سطح و هر نوع مواد به دام افتاده در داخل ماتریکس است‏. مرحله اول در ایجاد بیوفیلم چسبندگی باکتریایی است که تحت­تاثیر عامل‏‏هایی از جمله گونه‏های میکروارگانیسم، آب‏گریزی سطح و بارهای الکتریکی درگیر، شرایط محیطی و توانایی میکروارگانیسم­ها برای تولید پلیمرهای خارج­سلولی که در اتصال سلول­ها به سطوح کمک می‏کند، است ‏‏(‏‏6)‏‏. بیوفیلم در حال حاضر در سطوح صنایع­غذایی منبع مهم آلودگی است، که ممکن است به فساد مواد غذایی و انتقال بیماری منجر شود. با توجه به این واقعیت که نگه دارنده­های مواد غذایی دارای سطح تحمل صفر برای پاتوژن مانند سالمونلا و همچنین، در بسیاری از کشورها برای باکتری لیستریا مونوسیتوژنز هستند، سلول­های چسبنده منفرد ممکن است به طور در خور توجهی به شکل بیوفیلم به خوبی گسترش یابند. در نتیجه کنترل چسبندگی میکروارگانیسم­ها به سطوح در تماس با مواد غذایی یک مرحله اساسی در فراهم آوردن ایمنی و محصولات با کیفیت به مصرف­کنندگان است. از این رو، دخالت بیوسورفکتانت­ها در چسبندگی میکروبی و جدا­شدن از سطوح بررسی شده است ‏‏(‏‏6). سورفاکتانت منتشرشده به‏وسیله‏‏ استرپتوکوکوس ترموفیلوس برای کنترل زنگ زدگی صفحات مبدل حرارتی در پاستوریزه کردن استفاده می­شود که کلونیزاسیون گونه­های دیگر گرما دوست استرپتوکوک­ها که مسئول زنگ زدگی هستند را به تاخیرمی­اندازد ‏‏(‏‏6). در این پژوهش، جداسازی و شناسایی سویه تولید کننده بیوسورفکتانت از جنس سودوموناس آئروژینوزا و بررسیاثراتضد باکتریایی بیوسورفکتانت تولید شده از آن بر رویرشد6 باکتری گرم مثبت و گرم منفی ‏‏بااستفادهازروشانتشار در آگار به کمک دیسکبررسیومقایسهشد.

 

مواد و روش­ها

نمونه برداری

برای جداسازی باکتری­های مولد بیوسورفکتانت، نمونه­ها از منابع مختلف از جمله نفت خام نفت­شهر کرمانشاه ‏‏(‏‏چاه 25)،‏‏ آب و خاک­های آلوده به نفت ‏‏نواحی اطراف مخازن نفتی جمع آوری شدند. برای نمونه­گیری از شیشه­های در پوش­دار استریل استفاده شد.

غنی­سازی و کشت میکروبی

پس از انجام نمونه­گیری و ارسال به آزمایشگاه 5 میلی­لیتر ازنمونه آب و 5 گرم ازنمونه خاک آلوده به نفت در 95 میلی­لیتر محیطنوترینت براث تقویت شده[2]در داخل ارلن مایر 250 میلی­لیتر تلقیح ودر دمای 30 درجه به مدت72 ساعت شیکر ‏‏(‏‏150 دور در دقیقه[3]) ‏‏و گرمخانه­گذاری شدند ‏‏(‏‏7 و 8). محیط نوترینت براث تقویت شده استفاده شده در این تحقیق، محتوای 500 میلی­لیتر نوترینت براث و 500 میلی­لیتر محلول نمک معدنی[4] است. محلول نمک معدنی استفاده شده در این تحقیق، در هر لیتر آب مقطر محتوای: 2 گرم KH2PO4، 5 گرم K2HPO4، 3 گرم ‏‏(‏‏NH4) ‏‏2SO4، 1/0 گرم Nacl، 01/0گرم FeSO4.7H2O، 01/0 گرم CaCl2.2H2O، 2گرم MgSO4.7H2O، 002/0 گرم MnSO4.7H2O، 25/0گرم CuSO4.5H2O، 24/0گرم ZnSO4.7H2O، 03/0 درصدگلوکز و 03/0 درصد عصاره مخمر[5]،‏‏ با اسیدیته 2/7 تنظیم شد. پس از آن از این محیط از1-10 تا6-10 در فسفات بافر سالین رقت‏های متوالی تهیه شد‏‏ و سپس هر رقت در محیط کشت نوترینت آگار تقویت شده[6] ‏‏(‏‏1.2 نوترینت براث تقویت شده همراه با 2 درصد آگار) ‏‏به شکل پورپلیت[7] کشت داده شد. به منظور افزایش دادن تعداد باکتری­های مولد بیوسورفکتانت برای نمونه نفت ابتدا یک میلی­لیتر نفت خام در99 میلی­لیتر محیط نوترینت براث تقویت شده در داخل ارلن مایر 250 کشت داده شد و همین‏طور یک میلی‏‏‏لیتر نفت فیلتر شده نیز به همراه 99 میلی­لیتر محیط نوترینت براث تقویت شده به عنوان شاهد قرار داده شد. هر دو ارلن در دمای 30 درجه به مدت 2 ساعت شیکر وگرمخانه­گذاری شدند ‏‏(‏‏‏‏rpm150). پس از 2 ساعت از کشت مورد نظر رقت­های متوالی تهیه شد. برای رقت‏سازی بجای بافر فسفات سالین از نوترینت براث تقویت شده استفاده شد و از هر رقت در محیط کشت نوترینت آگار تقویت شده به شکل پورپلیت کشت داده شد و از محیط­های گلوکز عصاره مخمر آگار[8] برای‏‏ جداسازی سایر باکتری­ها و از محیط مکانکی آگار، ائوزین متیل بلو آگار[9] و اندو آگار برای‏‏ جداسازی باکتری­های گرم منفی از گرم مثبت استفاده شد. تمام پلیت­ها در دمای 30 درجه سانتی‏گراد‏‏ به مدت 24 ساعت گرمخانه­گذاری شدند ‏‏(‏‏9 و 10).

غربال‏‏گری‏‏

آزمایش‏‏ همولیزخون

نخستین آزمایش‏‏ غربال­‏گری برای شناسایی و جداسازی باکتری­های تولید کننده بیوسورفکتانت آزمایش‏‏ همولیز است. تک کلونی‏‏­هایی که تازه از تمام کشت­های خالصی به‏دست آمده بودند بر روی آگار حاوی خون به‏طور خطی کشت داده شدند و به مدت 72 ساعت در دمای30 درجه سانتی‏گراد‏‏ گرمخانه­گذاری شدند ‏‏(‏‏7 و 11).

اندازه گیری فعالیت امولسیفیه کنندگی

در این مرحله هر کدام از کلونی‏‏ جدا شده از غربال‏‏گری اولیه در لوله آزمایش محتوای 3 میلی­لیتر محیط محلول نمک معدنی به مدت 48 ساعت کشت داده شد. پس از تلقیح دو کلونی‏‏ در هر محیط، به میزان 10 درصد هیدروکربن ‏‏(‏‏نفت خام) ‏‏به لوله اضافه و پس از مخلوط کردن با دستگاه ورتکس[10] به مدت یک دقیقه، در دمای 30 درجه به مدت 3 روز گرمخانه­گذاری شد‏‏. پس از گرمخانه گذاری لوله­ها خوب با ورتکس مخلوط و در ادامه ضخامت لایه نفت امولسیفیه شده به شکل زیر محاسبه شد ‏‏(‏‏9 و11).

EC  طول کل ستون مایع / طول لایه امولیسیفیه شده 100

 

تائید ترشح بیوسورفکتانت با اندازه‏گیری کشش سطحی

برای اندازه­گیری کشش سطحی از دستگاه کشش‏سنج کرواس کلات[11] استفاده شد. بدین منظور یک کلونی‏‏ از کشت خالص هر یک از سویه­های جدا شده از غربال­‏گری ثانویه به محیط کشت نوترینت براث تلقیح ‏‏شد‏‏، پس از آن‏که جذب نوری کشت مذکور در طول موج 620 نانومتر به 9/0-8/0 آنگسترم رسید، از آن به عنوان مایع تلقیح استفاده شد. یک میلی­لیتر از کشت مذکور به 100 میلی­لیتر محیط محلول نمک معدنی و یک درصد نفت فیلتر شده به عنوان منبع هیدروکربن اضافه شد. مخلوط همراه با نمونه شاهد در دمای 30 درجه در 150 دور در دقیقه به مدت 3روز گرمخانه‏گذاری شد ‏‏(‏‏9 و11).

ویژگی‏های سویه­ انتخابی سودوموناس آئروژینوزا تولید کننده بیوسورفکتانت

ویژگی‏های سویه­ انتخابی تولید کننده بیوسورفکتانت بواسطه آزمایش‏‏­های مختلف تعیین شده بود. این آزمایش‏‏­ها شامل: ویژگی‏های ظاهری کلونی‏‏­ها، رنگ آمیزی گرم، رنگ­آمیزی اسپور، آزمایش‏‏ کاتالاز، اکسیداز، سیترات، تریپل شوگر آیرون آگار[12]، سولفید تحرک اندول[13]، متیل رد- وجس پروسکوآر[14]، اوره­آز، احیا نیترات و همچنین، الگوی مقاومت سویه­های انتخابی به 16 آنتی­بیوتیک جنتامایسین (‏‏‏‏10 میکروگرم بر میلی‏‏لیتر)،‏‏ کلیندامایسین (‏‏‏‏2 میکروگرم بر میلی‏‏لیتر)،‏‏ متی­سیلین ‏‏(‏‏‏‏5 میکروگرم بر میلی‏‏لیتر)،‏‏ آمپی­سیلین ‏‏(‏‏‏‏10 میکروگرم بر میلی‏‏لیتر)،‏‏ استرپتومایسین ‏‏(‏‏‏‏10 میکروگرم بر میلی‏‏لیتر)،‏‏ اکسی­تتراسایکلین ‏‏(‏‏‏‏30 میکروگرم بر میلی‏‏لیتر)،‏‏ سیپروفلوکساسین ‏‏(‏‏5 میکروگرم بر میلی‏‏لیتر)،‏‏ ونکومایسین ‏‏(‏‏­3 میکروگرم بر میلی‏‏لیتر)،‏‏ اپی پنم (‏‏‏‏10 میکروگرم بر میلی‏‏لیتر)،‏‏ اریترومایسین) ‏‏15 میکروگرم بر میلی‏‏لیتر)،‏‏ باسیتراسین (‏‏‏‏04/0 میکروگرم بر میلی‏‏لیتر)،‏‏ اگزاسیلین ‏‏(‏‏‏‏1 میکروگرم بر میلی‏‏لیتر)،‏‏ نالیدیکسیک­اسید (‏‏‏‏30 میکروگرم بر میلی‏‏لیتر)،‏‏ سفی­پیم ‏‏(‏‏‏‏30 میکروگرم بر میلی‏‏لیتر)،‏‏ کلرامفنیکل (‏‏‏‏30 میکروگرم بر میلی‏‏لیتر) و‏‏ پنی‏سیلین (‏‏10 میکروگرم بر میلی‏‏لیتر) ‏‏بررسی شد.

استخراج بیوسورفکتانت

به این شکل که کلونی‏‏ سویه انتخابی به ارلن 1000 میلی­لیتری محتوای 500 میلی­لیتر محیط کشت نوترینت براث تلقیح، سپس با اضافه کردن 10 میلی­لیتر n-­هگزان به عنوان منبع هیدروکربن، مخلوط در دمای 30 درجه سانتی‏گراد‏‏ به مدت 7 روز با شیکر 150 دور در دقیقه گرمخانه­گذاری شد. پس از آن سلول­های باکتری به‏وسیله‏‏ سانتریفیوژ در 5000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد‏‏ به مدت20 دقیقه حذف و مایع­رویی جمع­آوری شد. اسیدیته مایع با استفاده از سولفوریک اسید 1 مولار به 2 تنظیم شد و پس از آن به حجم برابر کلروفرم و متانول ‏‏(‏‏1:2) ‏‏اضافه شد. سپس فاز آلی مجزا شده و حلال در آون و در دمای 60 درجه تبخیر شد‏‏. فراورده نهایی به رنگ قهوه­ای تیره و قوام چرب به عنوان بیوسورفکتانت خام به‏دست آمد ‏‏(‏‏شکل 1). بیوسورفکتانت خشک بدست آمده از هر سویه وزن شد و از آن‏ها‏ رقت­های متوالی شامل: 1000، 500، 250، 125 و63 میلی­گرم بر میلی­لیتر در 1 میلی­لیترحلال دی متیل سولفوکساید[15] تهیه شد رقت‏های هر بیوسورفکتات برای‏‏ بررسی­های ضد باکتریایی استفاده شد ‏‏(‏‏7).

 

 

شکل 1- ‏‏عصاره بیوسورفکتانت خام به‏دست آمده از سودوموناس آئروژینوزا 83 انتخابی

 

در این مرحله پلیت­ استریل را گرفته و وزن پلیت­ها اندازه­گیری شد. رسوب حاصل از استخراج بر روی پلیت­ها ریخته شد، سپس پلیت­ها در آون در دمای 100 درجه سانتی‏گراد‏‏ به مدت 30 دقیقه قرار داده شد پس از خشک­کردن، پلیت­ها وزن شد. وزن خشک بیوسورفکتانت­ها به‏وسیله‏‏ فرمول زیر محاسبه شد ‏‏(‏‏7).

وزن پلیت خالی -وزن پلیت پس از خشک کردن ‏‏= وزن خشک بیوسورفکتانت

 

کروماتوگرافی لایه نازک

یکی از روش­های اطمینان از حضور بیوسورفکتانت در محیط، کروماتوگرافی لایه نازک است. پس از استخراج بیوسورفکتانت، 500 میلی­گرم از بیوسورفکتانت خام را در 1000 میلی­لیترآب دیونیزه شده مخلوط و سپس 10 میکرولیتر از آن بر روی صفحه کروماتوگرافی لایه نازک بارگذاری شد. سیستم حلال مورد استفاده شامل: کلروفرم/ متانول/ ­استیک اسید/ آب ‏‏(‏‏V/V/V/V 25:15:4:1) ‏‏بود. صفحه کروماتوگرافی لایه نازک آماده، در داخل تانک حاوی حلال قرار گرفت سپس صفحه کروماتوگرافی لایه نازک پس از خشک شدن زیر UV قرار داده شد تا مشاهده شود واکنش انجام شده است یا نه، اگر واکنش انجام شده کروماتوگرام را با معرف­های نین هیدرین[16] ‏‏(‏‏5/0 گرم در 100 میلی­لیتر استون بدون آب) ‏‏برای کشف بخش‏های لیپیدی به عنوان نقاط قهوه­ای و معرف آنترون[17] ‏‏(‏‏1گرم در 5 میلی­لیتر سولفوریک اسید ترکیب شده با 95 میلی­لیتر اتانول) ‏‏برای کشف بخش­های کربوهیدراتی به عنوان نقاط زرد اسپری می­نماییم ‏‏(‏‏7، 9 و12).

سویه‏های میکروبی

سویه­های استانداردباکتری­هایموردآزمایش در این تحقیق، ازگروه میکروب­شناسی موسسه سرم­‏سازی رازی کرج و کلکسیون میکروب­شناسی تهران به نام­های استافیلوکوکوس اورئوس 1112 PTCC، اشریشیا­کلی 1330 PTCC، سودوموناس آئروژینوزا 1074 PTCC، استافیلوکوکوس اپیدرمیس 2405 ATCC، پروتئوس میرابیلیس 2601 ATCC و سالمونلا تیفی موریوم1679 ATCC تهیه شد.

تهیه سوسپانسیون میکروبی

 ازتمامسویه­هادرسرم فیزیولوژی ­سدیم کلراید 9/0 درصد سوسپانسیون میکروبی تهیه شد، به این شکل که برایهرسریآزمایشکشتتازه24 ساعتهتهیهشد.برایاینکاریکلوپازهرمیکروبدر 5 سی­سی سرم فیزیولوژی فوق تلقیح شد. جذب نوری سوسپانسیون میکروبیبا دستگاه اسپکترفتومتری در طول موج 620 به 08/0 تا 0/1آنگسترم تنظیم شد، سپس از این سوسپانسیونمیکروبیبرایتلقیحدرمحیط کشتمولر‏هینتون ­آگاراستفادهشد.

بررسی خاصیت ضد باکتری بیوسورفکتانت

برای تعیین حساسیت کیفی و کمی از سوسپانسیون تهیه شده استفاده شد. در روش کیفی از انتشار در آگار[18] به شیوه کربی بائر[19] استفاده شد که طی آن از سوسپانسیونمیکروبیاستانداردشدهبهروش چمنیدرسطحمحیطکشتمولرهینتون­آگار[20] کشتانجامشد.سپس برایبررسیخواصیضد­باکتریایی، دیسک­هایکاغذیبلانک (‏‏ساخت پادتن طب) ‏‏با فاصله معین از یکدیگر و از لبه پلیت روی آگار قرار داده شد و حدود 20 میکرولیتر از غلظت­های حاوی 1000، 500، 250، 125 و63 میلی­گرم بر میلی­لیتر در محلول دی متیل سولفوکساید، روی دیسک­ها اضافه شد. از دیسک آنتی­بیوتیک جنتامایسین با غلظت10 میکروگرم بر میلی­لیتر به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. سپسمحیط‏هایکشتحاوی باکتری­هابهمدت24ساعتدردمای۳۷درجهسانتیگراد قرار داده شد. سپس با اندازه­گیری قطر هاله­های تشکیل شده در اطراف صفحه­ها، نتایج بررسی و نتایجحاصلازآنتیبیوتیک باجداول، موسسه استاندارد بالینی و آزمایشگاهی[21]مقایسهشده است برای‏‏ حصول اطمینان از هر یک از غلظت­های مختلف بیوسورفکتانت و آنتی بیوتیک این آزمایش­ها برای هر سویه باکتریایی سه بار تکرار شد. همچنین، آزمایش­هایکمیبرایتعیینحداقلغلظت مهارکننده و حداقلغلظت کشنده بیوسورفکتانت­ها انجام شد. به این ترتیب آزمایش حداقل غلظت مهارکننده درپلیت٩٦خانهاستریلوباروشبراث میکرودایلوشن انجام شد. ابتدا ازمولر هینتون براث ‏‏(‏‏مرک­آلمان) ‏‏100 میکرولیتر داخل چاهک­های مربوط به رقت­های مورد نظر میکروپلیت­ ریخته شد. سپس به نخستین چاهک 100 میکرولیتر عصاره بیوسورفکتانت اضافه شد‏‏ و از خانه دوم وسوم به همین ترتیب تا خانه ششم رقیق شدند. در پایان به همه چاهک­ها 100 میکرولیتر سوسپانسیون رقیق شده ‏‏(‏‏نوترینت براث) ‏‏معادل لوله نیم ­مک فارلند اضافه شد. ‏‏پس از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی‏گراد،‏‏کف پلیت زیر نور در آینه مشاهده شد. خانه کنترل اسانس، محیط کشت و میکروب نیز جداگانه منظور و وجود کدورت را که نشان دهنده رشد یا عدم رشد باکتری است، درجدول مخصوص یادداشت شد. طبق تعریف اولین چاهک بدون کدورت ‏‏(‏‏رقیق‏ترین)، به عنوان حداقل غلظت مهارکننده قرار داده شده است. همچنین، آزمایش حداقل غلظت کشندگی با توجه به نتایج حداقل غلظت مهارکنندگی تعیین شد. از چاهک‏هایی که رشد باکتری در آن‏ها به طور کامل متوقف شده بود با سوآپ استریل نمونه برداری، روی محیط کشت نوترینت آگارکشت داده و در دمای 37 درجه سانتی‏گراد گرمخانه گذاری شدند. پس از 24 ساعت کم‏ترین غلظتی از عصاره بیوسورفکتانت که باکتری در آن رشد نکرده به عنوان حداقل غلظت­کشندگی گزارش شدند‏‏(‏‏13).

تجزیه تحلیل آماری

بررسی خواص ضدباکتریایی در سه تکرار و در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام شد. برای تجزیه واریانس داده­ها از نرم افزار SAS در سطح 1 درصد و برای مقایسه میانگین داده­هااز آزمونچنددامنهدانکن در سطح 5 درصد استفاده شد.

نتایج

جدا‏سازی، خالص‏‏سازی

در این مطالعه، از نمونه­ها پس از سپری شدن مراحل غنی­سازی، رقت تهیه شده و بر روی محیط­کشت­های اختصاصی کشت داده شدند. نمونه­ها از نفت خام، خاک و آب آلوده به نفت تهیه شده بودند، که بر اساس مشخصات ظاهری و صفات کلونی‏‏­ها، 88 سویه باکتریایی مختلف جداسازی شد‏‏ند. در این روش به علت خالص بودن کشت­ها، میزان آلودگی­های قارچی تا حد زیادی کاهش پیدا می­کند، چون تنها سویه­هایی که بر روی محیط کشت اختصاصی خالص­سازی شده‏اند، استفاده شدند.

انتخاب مناسب­ترین سویه­ها

آزمایش‏‏ همولیزخون

تمام سویه­های جدا شده در مرحله قبل، برای بررسی فعالیت همولیتیک بر روی محیط کشت بلادآگار کشت داده شدند. از بین 88 سویه جداسازی شده، تنها 24 سویه دارای فعالیت همولیز بتا بودند ‏‏(‏‏شکل 2). ‏‏در نتیجه سویه­هایی که دارای همولیز بتا بودند به عنوان فعالیت همولیتیک مثبت در نظرگرفته و برای مطالعات بعدی انتخاب شدند.

اندازه­گیری فعالیت امولسیفیه­کنندگی

نتایج حاصل از فعالیت امولسیفیه­کنندگی کشت سویه­های غربال شده از مرحله قبل با هیدروکربن نفت نشان داد که از میان 24 سویه حاصل از غربال­‏گری اولیه، 14 سویه، 70 درصد یا بیشتر توانایی امولسیفیه­کنندگی را داشتند. این سویه­ها برای ‏‏مطالعات بیشتر انتخاب شدند.

اندازه‏گیری کشش سطحی

کشش سطحی یکی از معیار­های نشان دهنده تولید مواد فعال سطحی در محیط است. جدول 1 کشش سطحی کشت سویه­های انتخابی همراه با یک درصد نفت را نشان می­دهد. کشش سطحی شاهد ‏‏(‏‏محیط­کشت فاقد باکتری) ‏‏72­ میلی­نیوتن برمتر بود. در این مرحله با توجه به نتایج غربال­‏گری اول و دوم 14 سویه برای اندازه­گیری کشش سطحی انتخاب شدند. همان‏طور که در این جدول نشان داده شده از بین 14 سویه آزمایش‏‏ شده تنها سویه­های 43، 47، 83 و 88 قادر به کم کردن کشش سطحی تا کمتر از40 میلی­نیوتن برمتر هستند ‏‏(‏‏10 و19) ‏‏البته هر 4 سویه به نمونه نفت متعلق بودند.

 

 

شکل 2- فعالیت همولیز بتا توسط سودوموناس آئروژینوزا 83 انتخابی

 

جدول 1- کشش سطحی حاصل از 14 سویه انتخابی پس از 72 ساعت ‏‏(‏‏mN/m) ‏‏

شماره سویه

کشش سطحی [میلی­نیوتن برمتر]

1

43

5

42

40

48

41

47

43

6/38

47

38

53

40

56

55

77

53

78

58

80

62

83

39

87

57

88

36

 

جدول 2- ویژگی‏های بیوشیمیایی سویه انتخابی تولیدکننده بیوسورفکتانت

ویژگی‏ها

سودوموناس83

الگوی مقاومت

سودوموناس83

ریخت‏شناسی سلول

کوکوباسیل

جنتامایسین

-

واکنش گرم

-

کلیندامایسین

+

تشکیل اسپور

-

متی­سیلین

+

کاتالاز

+

آمپی­سیلین

+

اکسیداز

+

استرپتومایسین

+

حرکت

-

اکسی­تتراسایکلین

-

اندول

-

سیپروفلو­کساسین

-

H2S

-

ونکومایسین

+

متیل رد

-

اریترومایسین

+

وجس- پروسکوآر

-

باسیتراسین

+

گلوکز

+

اگزاسیلین

+

لاکتوز

+

نالیدیکسیک اسید

+

اوره­آز

+

سفی­پنم

-

سیترات

+

کلرامفنیکل

+

احیای نیترات

+

پنی­سیلین

+

پیگمان

+

اپی­پنم

-

- : ‏‏نتیجه منفی، + : نتیجه مثبت

 


ویژگی‏ها وشناسایی سویه­های باکتری

در این مطالعه، یکی از باکتری­های تولیدکننده بیوسورفکتانت به نام سویه 83  دارای کاهش کشش سطحی زیر 40 میلی‏‏نیوتن برمتر بود. براساس آزمایش‏‏‏های بیوشیمیایی مطابق با جدول 2 و طبقه­بندی ارائه شده در چاب هشتم کتاب برگی، سویه جدا شده تا حد امکان تعیین هویت شد. به این ترتیب سویه
83؛Pseudomonas.aeruginosa  ‏‏c.f.‏‏نام گذاری و برای استخراج بیوسورفکتانت انتخاب شد.

وزن خشک بیوسورفکتانت

وزن خشک بیوسورفکتانت ‏‏مطابق با جدول 3 اندازه‏گیری و تعیین شد.

 

 

جدول 3- وزن خشک بیوسورفکتانت سویه­های انتخابی ‏‏(‏‏برحسب گرم) ‏‏

سویه

وزن پلیت

وزن پلیت پس از خشک کردن بیوسورفکتانت

وزن خشک بیوسورفکتانت

سودوموناس آئروژینوزا83

98/48

254/49

274/0

 

 


کروماتوگرافی لایه نازک

با قرار دادن صفحه کروماتوگرام در سیستم حلال، جابجایی لکه­ها زیر UV بررسی شد که نمونه لکه بزرگ و مشخصی بر روی صفحه کروماتوگرام تشکیل داد و زیر UV به شکل لکه صورتی رنگ مشاهده شد. همچنین، با اسپری معرف نین­هیدرین بر روی صفحه کروماتوگرام لکه لیپیدی به رنگ قهوه­ای در سویه انتخابی مشاهده شد. همچنین، با اسپری معرف آنترون لکه زرد در سویه سودوموناس آئروژینوزا83 دیده شد که وجود بخش کربوهیدراتی را در این سویه نشان می‏دهد ‏‏(‏‏شکل 4).

 

شکل 3- صفحه کروماتوگرام

 

 

شکل 4- مشاهده ‏‏لکه‏های عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 انتخابی

 

بررسی اثرات ضد باکتریایی بیوسورفکتانت

تجزیه تحلیل آماری داده‏های حاصل از بیوسورفکتانت­

نتایج حاصلازتجزیهواریانسداده­هایمربوط ‏‏(‏‏جدول 4) ‏‏نشان دادند که اثر باکتری و رقت­های مختلف و همچنین، اثر متقابل بین باکتری و رقت بیوسورفکتانت­ مورد آزمایش در سطح یک درصد معنادار هستند‏.

تاًثیر رقت­های مختلف بیوسورفکتانت­­ بر هر یک از باکتری­ها

تحلیل‏ آماری داده­ها نشان داد که تفاوت بین میانگین­های قطر هاله ممانعت از رشد حاصل از تاثیر رقت­های مختلف بیوسورفکتانت برای 6  باکتری مختلف در سطح پنج درصد معنادار است ‏‏(‏‏جدول 4). همچنین، بررسی قطر هاله ممانعت از رشد حاصل از تاًثیر رقت­های مختلف بیوسورفکتانت بر روی هر باکتری و سپس مقایسه باکتری­ها با هم نشان داد که حساس­ترین باکتری نسبت به تاثیر عصاره بیوسورفکتانتسودوموناس­آئروژینوزا 83؛ استافیلوکوکوس اورئوس  و مقاوم­ترین باکتری در برابر عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83؛ پروتئوس میرابیلیس است ‏‏(‏‏جدول 5).

جدول 4- نتایج تجزیه واریانس بیوسورفکتانت بدست آمده از سودوموناس آئروژینوزا83

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات

باکتری

5

**16/287

رقت

5

**74/521

باکتری*رقت

25

**35 /22

خطا

72

22/0

کل

107

 

CV درصد ‏‏(‏‏ضریب تغییرات) ‏‏

87/2

 

** ‏‏معنی دار

 

جدول 5- مقایسه میانگین بین باکتری‏ها متاثر از بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83

سویه باکتری

میانگین

انحراف معیار

اشریشیا کلی

27/16 ‏‏C

57/0±

استاف اورئوس

A83/21

57/0±

استاف اپیدرمیس

B05/20

57/0±

پروتئوس میرابیلیس

F88/10

سالمونلا تیفی­موریوم

E38/14

57/0±

سودوموناس آئروژینوزا

D83/14

57/0±

 

اثر بیوسورفکتانت­ در رقت ‏‏1000 میلی­گرم بر میلی­لیتر بر مهار رشد 6 باکتری مختلف با یکدیگر

مقایسه میانگین­های قطر هاله ممانعت از رشد وتجزیه و تحلیل داده­ها مشخص کرد که رقت1000 میلی­گرم بر میلی­لیتر از عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس‏آئروژینوزا 83بیش‏ترین اثر بازدارندگی را بر استافیلوکوکوس اورئوس داشته که تفاوت آن با دیگر باکتری­ها معنی­دار بود. پس از آن بیش‏ترین اثر بازدارندگی عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 به ترتیب بر استافیلوکوکوس اپیدرمیس، اشریشیا کلی، سودوموناس آئروژینوزا، سالمونلا تیفی‏موریوم و پروتئوس میرابیلیس وجود داشت که تفاوت آن‏ها‏ با هم معنی­دار بود ‏‏(‏‏جدول 6).

اثر بیوسورفکتانت­ در رقت500 میلی­گرم بر میلی­لیتر بر مهار رشد 6 باکتری مختلف با یکدیگر

تحلیل‏ داده­ها نشان داد که رقت 500 میلی­گرم بر میلی­لیتر از عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 بیش‏ترین اثر بازدارندگی را بر استافیلوکوکوس اپیدرمیس و استافیلوکوکوس اورئوس داشته که تفاوت آن‏ها‏ با هم معنی­دار نبود، ولی تفاوت آن‏ها‏ با دیگر باکتری­ها معنی­دار بود. پس از آن بیش‏ترین اثربازدارندگی عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا83 به­ترتیب بر اشریشیا­کلی، سالمونلا تیفیموریوم، سودوموناس آئروژینوزا و پروتئوسمیرابیلیس داشت که تفاوت آن‏ها‏ نیز با هم معنی­دار بود ‏‏(‏‏جدول 6).

اثر بیوسورفکتانت­ دررقت 250 میلی­گرم بر میلی­لیتر برمهار رشد 6 ­باکتری مختلف با یکدیگر

تجزیه و تحلیل آماری داده­ها نشان داد اثر بازدارندگی رقت 250 میلی­گرم بر میلی­لیتر از عصاره بیوسورفکتانت­ سودوموناس آئروژینوزا 83 در مورد استافیلوکوکوس اورئوس بیشتراز سایر باکتری­هاست که تفاوت آن با دیگر باکتری­ها معنی­دار بود. پس از آن بیش‏ترین اثر بازدارندگی عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا83 بر استافیلوکوکوس اپیدرمیس و اشریشیاکلی مشاهده شد که تفاوت آن‏ها‏ با هم و با سودوموناس آئروژینوزا و سالمونلا تیفی­موریوم که اختلاف معنا­داری با هم نداشتند و همچنین بر پروتئوس میرابیلیس معنی­دار بود ‏‏(‏‏جدول 6).

اثر بیوسورفکتانت­ در رقت125 میلی­گرم بر میلی­لیتر بر مهار رشد 6 باکتری مختلف ‏‏با یکدیگر

تجزیه وتحلیل آماری داده­ها نشان داد اثر بازدارندگی رقت 125 میلی­گرم بر میلی­لیتر از عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا83 در مورد استافیلوکوکوس اورئوس بیشتر از سایر باکتری­هاست که تفاوت آن‏ها‏ با دیگر باکتری­ها معنی­دار بود. پس از آن بیش‏ترین اثر بازدارندگی عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس­آئروژینوزا 83 بر استافیلوکوکوس اپیدرمیس و اشریشیا­کلی مشاهده شد که تفاوت آن‏ها‏ با پروتئوس میرابیلیس، سودوموناس­آئروژینوزاو سالمونلا تیفی­موریوم که تفاوت معنی­داری با هم نداشتند، معنی‏دار بودند ‏‏(‏‏جدول 6).

اثر بیوسورفکتانت­ در رقت63 میلی­گرم بر میلی­لیتر بر مهار رشد 6 باکتری مختلف ‏‏با یکدیگر

تجزیه و تحلیل آماری داده­ها نشان داد اثر بازدارندگی رقت 63 میلی­گرم بر میلی­لیتر از عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 در مورد استافیلوکوکوس اپیدرمیس بیشتر از سایر باکتری­هاست که تفاوت آن‏ها‏ با باکتری­های دیگر معنی­دار بود. پس از آن بیش‏ترین اثر بازدارندگی بر استافیلوکوکوس اورئوس و اشریشیا­کلیوجود داشت که تفاوت آن‏ها‏ با هم و با سودوموناس­آئروژینوزا و سالمونلا تیفی­موریوم که با هم اختلاف معنی­داری نداشتند و همچنین، پروتئوس میرابیلیس که کم‏ترین اثر بازدارندگی را داشت معنی­دار بود ‏‏(‏‏جدول 6).

 

 

جدول 6- مقایسه میانگین قطر هاله ممانعت از رشد 6 باکتری مختلف تحت تأثیر رقت‏های مختلف بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا83 وآنتی بوتیک (‏‏میلی­متر) ‏‏

باکتری

رقت

میانگین

انحراف معیار

باکتری

رقت

میانگین

انحراف معیار

اشریشیاکلی

1000

de 66/23

57/0±

پروتئوس میرابیلیس

1000

n ‏‏12

500

h 33/18

500

p 66/9

57/0±

250

jk ‏‏15

57/0±

250

p 66/9

57/0±

125

o 66/10

57/0±

125

q 66/8

57/0±

63

o 66/10

57/0±

63

r 6

جنتامایسین

g 33/19

57/0±

جنتامایسین

g 33/19

57/0±

استاف ­اورئوس

1000

a 33/31

57/0±

سالمونلا تیفی­موریوم

1000

hi ‏‏18

57/0±

500

d 24

500

j66/15

250

d ‏‏24

250

mn 33/12

125

kl 33/14

57/0±

125

q 66/8

63

n ‏‏12

63

q 66/8

جنتامایسین

c 33/25

57/0±

جنتامایسین

e ‏‏23

57/0±

استاف اپیدرمیس

1000

b 66/29

57/0±

سودوموناس آئروژینوزا

1000

f 33/20

57/0±

500

d 24

500

k66/14

57/0±

250

f 33/20

57/0±

250

m ‏‏13

125

m 13

125

q66/8

57/0±

63

m13

63

q66/8

جنتامایسین

f 33/20

57/0±

جنتامایسین

de66/23

57/0±

حروفمشابهبیانکنندهعدموجوداختلافمعنیداراست

 


مقایسه تاًثیر ضد باکتریایی بیوسورفکتانت در رقت­های مختلف با تاثیر بازدارنده آنتی­بوتیک­ها

تجزیه تحلیل آماری داده­ها طبق جدول 7 نشان داد که در مورد باکتری اشریشیا کلی اثر بازدارنده رقت 1000 میلی­گرم بر میلی­لیتر عصاره­ بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83، از تمام آنتی بیوتیک­های موثر بر این باکتری کمتر ولی از آنتی بیوتیک اریترومایسین موثر بر این باکتری بیشتر است.

 در مورد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس تاثیر بازدارنده رقت 1000 میلی­گرم بر میلی­لیتر عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس­آئروژینوزا 83، در برابرجنتامایسین، کلیندامایسین، آمپی­سیلین، وانکومایسین، اگزاسیلین و نالیدیکسیک اسید زیاد ولی نسبت به سفی­پیم که یک نوع آنتی­بیوتیک حاوی حلقه بتالاکتامی و از دسته سفالوسپورین­هاست اثری مشابه ‏‏و نسبت به سیپروفلوکساسین، اکسی­تتراسایکلین و اپی­پنم کمتر موثر بودند.

در مورد باکتری استافیلوکوکوس اپیدرمیس، اثر بازدارندگی عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 ‏‏نسبت به آنتی بیوتیک سیپروفلوکساسین موثر بر این باکتری بیشتر و نسبت به آنتی بیوتیک
اپی پنم و سفی­پیم اثر مشابه ولی نسبت به اریترومایسین، کلرامفنیکل پنی­سیلین موثر بر این باکتری کمتر بود ‏‏(‏‏جدول6 و 7).

در مورد باکتری پروتئوس میرابیلیس اثر بازدارندگی عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 ‏‏نسبت به آنتی بیوتیک سیپروفلوکساسین موثر بر این باکتری بیشتر و نسبت به آنتی بیوتیک اپی پنم و سفی­پیم اثر مشابه ولی نسبت به اریترومایسین، کلرامفنیکل پنی­سیلین موثر بر این باکتری کمتر بود.

برای باکتری سالمونلا تیفی­موریوم، اثر باز دارندگی رقت 1000 میلی­گرم بر میلی­لیتر عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 از تمام آنتی­بیوتیک­های موثر به جز کلیندامایسین که با رقت 1000 میلی­گرم بر میلی­لیتر عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 اثر مشابه داشت کمتر و معنی­دار بود.

در مورد باکتری سودوموناس آئروژینوزا تاثیر بازدارنده رقت 1000 میلی­گرم بر میلی­لیتر عصاره سودوموناس آئروژینوزا 83 نسبت به تمام آنتی­بیوتیک­ها به جز اکسی­تتراسایکلین که اثرات مشابه­ای داشت کمتر بود ‏‏(‏‏جدول6 و7).

همان‏گونه که نتایج این پژوهش نشان داد، عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 دارای خاصیت ضد باکتریایی است که این ویژگی‏ بسته به رقت بیوسورفکتانت و جنس باکتری متفاوت است. مطابق با جداول 5 و6 بیش‏ترین اثر بازدارندگی رقت‏های مختلف عصاره بیوسورفکتانت­ سودوموناس آئروژینوزا 83 بر روی باکتری استافیلوکوکوس اپیدرمیس وکمترین اثر برروی سالمونلا تیفی­موریوم باکتری مشاهده شد.

همچنین، عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا83، برای باکتری اشریشیاکلی دررقت 63 میلی­گرم بر میلی­لیتر اثر باکتریواستاتیکی و در رقت 250 میلی­گرم بر میلی­لیتر اثر باکتریوسیدالی داشت. همچنین، برای باکتری­های سالمونلا تیفی­موریوم و سودوموناس‏آئروژینوزا رقت 250 میلی­گرم بر میلی­لیتر اثر باکتریواستاتیکی و دررقت 500 میلی­گرم بر میلی­لیتر اثر باکتریوسیدالی مشاهده شد. با این حال برای باکتری‏های استافیلوکوکوس اپیدرمیس دررقت 63 میلی­گرم بر میلی­لیتر، استافیلوکوکوس اورئوس در رقت 125 میلی­گرم بر میلی­لیتر و برای پروتئوس میرابیلیس دررقت1000 میلی­گرم بر میلی­لیتر هم اثر باکتریواستاتیکی و هم اثر باکتریوسیدالی مشاهده شد‏‏ ‏‏(‏‏جدول 8).

 

 

جدول 7- اثرات ضد ­باکتری­ آنتی­بیوتیک­ها بر روی 6 باکتری مختلف (‏‏میلی­متر) ‏‏

سویه ‏‏باکتری

آنتی­بیوتیک

اشریشیاکلی

استاف اورئوس

استاف اپیدرمیس

پروتئوس میرابیلیس

سالمونلا تیفی­موریوم

سودوموناس آئروژینوزا

کلیندامایسین

R 33/12

S 23

R 6

R 6

S 66/17

R 6

متی­سیلین

R 6

R 66/15

R 6

R 6

R 6

R 6

آمپی­سیلین

R 6

S 33/30

R 6

R 6

R 33/9

R 6

استرپتومایسین

R 66/12

R 66/12

R 6

R11

R 33/9

R 33/10

اکسی­تتراسایکلین

S 25

S 33/32

R 6

R 6

S66/22

S 20

سیپروفلوکساسین

S 33/35

S 33/35

S 33/28

S 25

S 33/26

S 33/35

 ادامه جدول 7

سویه ‏‏باکتری

آنتی­بیوتیک

اشریشیاکلی

استاف اورئوس

استاف اپیدرمیس

پروتئوس میرابیلیس

سالمونلا تیفی­موریوم

سودوموناس آئروژینوزا

وا نکومایسین

R 6

S 33/20

R 6

R 6

R 6

R 6

اپی­پنم

S 35

S 66/33

S 30

S31

S 33/38

S 66/33

اریترومایسین

I 15

R 6

S 66/33

R 6

R 66/12

R 6

باسیتراسین

R 6

R 33/16

R 6

R 6

R 6

R 6

اگزاسیلین

R 6

S 66/22

R 6

R 6

R 6

R 6

نالیدیکسیک اسید

R 33/10

I 33/14

R 33/10

R 6

S 28

R 33/12

سفی­پیم

S 33/28

S 33/31

S 30

S 30

S 33/34

S 33/29

کلرامفنیکل

R 13

R 13

S 33/31

R 12

S31

R 6

پنی­سیلین

R 6

R 6

S 33/34

S 66/25

I33/21

R 10

R: Resistant, I: Intermediate/moderatelysusceptible, S: Susceptible

 

جدول 8- تعیین میزان حداقل غلظت مهارکننده رشد حداقل غلظت کشنده رشد ‏‏بیوسورفکتانت­ بر روی 6 باکتری مختلف ‏‏(‏‏میلی­گرم بر میلی‏لیتر) ‏‏

بیوسورفکتانت­

سویه باکتری

غلظت مهارکننده رشد

غلظت کشنده رشد

سودوموناس آئروژینوزا83

اشریشیا کلی

63

250

استاف اورئوس

125

125

استاف اپیدرمیس

63

63

پروتئوس میرابیلیس

1000

1000

سالمونلا تیفی­موریوم

250

500

سودوموناس آئروژینوزا

250

500

 


بحث و نتیجه‏گیری

تعداد زیادی از باکتری­ و قارچ­ها قادر به تجزیه زیستی آلاینده­های نفتی هستند. این ارگانیسم­ها به طور گسترده­ای در مخازن نفتی و اکوسیستم­های آبی و خاکی پراکنده می­باشند ‏‏(‏‏14). بررسی­ها نشان داده است اگر چه امکان وجود باکتری با توان تجزیه­کنندگی بالا در آب­ها و خاک­های بدون سابقه آلودگی قبلی با ترکیبات نفتی وجود دارد، ولی در اکثر پژوهش­های مشابه، به آب، خاک­ها و مناطق­آلوده به نفت توجه می‏شود. چون که امکان یافتن میکروارگانیسمی با توان تجزیه­کنندگی بالا در این مناطق بیشتر از مناطق غیرآلوده به ترکیبات نفتی است. در مطالعه ای که در بلغارستان توسط کانکووا و گالابووا [xxii] در سال 2002 انجام شد نیز جداسازی میکروارگانیسم­ها از مناطق آلوده ‏‏(‏‏آب­های آلوده به پساب­های نفتی) ‏‏گزارش شد‏‏ه است ‏‏(‏‏15). اوکرنتوگبا و ازرونی[xxiii] باکتری­های تجزیه­کننده نفت ازآب­های آلوده به نفت در اطراف پالایشگاه را جداسازی نمودند. ‏‏(‏‏16). بولا[xxiv] در سال 2006 در نیجریه از ترکیبات ماسه­ای همراه با نفت سنگین که به شکل کلوخ درآمده بودند باکتری­هایی جداسازی کرد که در تجزیه نفت خام بسیار موثر عمل می­کردند. این باکتری‏ها بیشتر از جنس سودوموناس بودند. از آن‏جایی که باکتری­های مولد بیوسورفکتانت در تجزیه نفت موثرتر عمل می­کنند، از بین باکتری­های جدا شده سویه­های مولد بیوسورفکتانت انتخاب شدند ‏‏(‏‏17).

در مطالعاتی که با هدف جداسازی باکتری­های مولد بیوسورفکتانت از منابع محیطی انجام شده به طور معمول از بررسی فعالیت همولیتیک به عنوان معیاری برای جداسازی اولیه سویه­های مولد بیوسورفکتانت استفاده شده است ‏‏(‏‏11). به طوری که در مطالعاتی مشابه که طباطبایی در سال 2005 ‏‏و آناندارج[xxv] در سال 2010 برای جداسازی باکتری­های مولد بیوسورفکتانت انجام دادند از فعالیت همولیتیک برای جداسازی اولیه استفاده شد ‏‏(‏‏7 و10).

با توجه به بررسی­های انجام شده، راه دیگر غربال‏گری فعالیت امولسیون­سازی است. فعالیت امولسیفیه‏کنندگی یک امولسیفایر به تمایل آن نسبت به سوبسترای هیدروکربنی استفاده شده برای اندازه­گیری EC بستگی دارد. نتایج آزمایش‏‏ امولسیون‏سازی (‏‏E24) ‏‏به دست آمده برای سویه­های غربال شده از مرحله قبل مطابق جدول 1 بود. نتایج به دست آمده در این تحقیق، از نتایج گزارش شده در مطالعات مشابه توسط بودوئر[xxvi] و همکاران در سال 2004 ‏‏(‏‏4)،‏‏ فرنسی[xxvii] و همکاران در سال 1991 ‏‏(‏‏9) ‏‏و بیکا[xxviii] وهمکارانش در سال 1999 ‏‏(‏‏18)،‏‏ بهتر و چشمگیر­تر است. اما یکی دیگر از فعالیت‏های غربال‏گری کشش سطحی­ست. از آنجایی که کاهش کشش­سطحی محیط رشد، مهم­ترین و اصلی­ترین معیار برای اثبات تولید بیوسورفکتانت محسوب می­شود به همین دلیل در این تحقیق، پس از غربال‏گری اول و دوم و کاهش تعداد سویه­های باکتری انتخاب شده، از این آزمایش برای بررسی و تائید توان این سویه­ها در تولید بیوسورفکتانت استفاده شد. مطالعات مشابهی در این زمینه توسط بنت[xxix] در سال 1991 و طباطبایی در سال 2005 برای جداسازی باکتری­های مولد بیوسورفکتانت انجام شد ‏‏(‏‏10 و 19). اما یکی از قابلیت­های جالب توجه باکتری­های مولد بیوسورفکتانت، توانایی آن‏ها‏ در ازدیاد برداشت میکروبی نفت از مخازن نفتی است. ازدیاد برداشت میکروبی نفت یک روش سوم ازدیاد برداشت است که با وجود برخوردار بودن از قدمت وسابقه تاریخی طولانی، به تازگی مورد توجه فراوان قرار گرفته است. مکانیسم­هایی که برای ازدیاد برداشت نفت به‏وسیله‏‏ میکروارگانیسم­ها پیشنهاد شده­اند بسیار پیچیده، متنوع و فراوان هستند اما بدون شک تولید بیوسورفکتانت و کم‏کردن کشش­سطحی و کاهش قدرت مویینگی یکی از دلایل اصلی افزایش تولید نفت توسط میکروارگانیسم­ها به شمار می­رود ‏‏(‏‏1 و 20).

علاوه بر این، در تحلیل‏ عصاره حاصل از کشت سویه سودوموناس آئروژینوزا83، لکه به دست آمده بر روی صفحه کروماتوگرافی لایه نازک در اثر اسپری با معرف نانیهیدرین، تولید رنگ قهوه­ای، و با اسپری با معرف آنترون تولید رنگ زرد می­کرد که نشان می­دهد که عصاره بیوسورفکتانت سویه حاوی ترکیبات لیپیدی و کربوهیدراتی است. در مطالعه­ای که توسط طباطبایی و همکاران در سال 2005، آناندارج و همکاران و روسا و همکاران[xxx] در سال 2010 انجام شده، ماهیت بیوسورفکتانت که به‏وسیله‏‏ آن‏ها‏ جداسازی شده بود نیز کاملاً مشابه با نتایج حاصل از سویه­ سودوموناس آئروژینوزا83، گزارش شده است ‏‏(‏‏7، 10 و20).

اما یکی دیگر از کاربرد­های بیوسورفکتانت­ها فعالیت ضد­میکروبی آن‏هاست. هر روزه مقاومت باکتری­ها در برابر آنتی بیوتیک­ها بیشتر می­شود. تحقیق در مورد کشف مواد جدید با خواص ضدمیکروبی قوی­تر همپای افزایش مقاومت در باکتری­ها رو به گسترش است و از این رو بیوسورفاکتانت یک جایگزین مناسب برای داروهای ترکیبی هستند و عوامل ضد میکروبی و عوامل موثر درمانی یا پروبیوتیک به عنوان ایمنی (‏‏بی­خطر) ‏‏بویژه در زمانی که مقاومت در برابر داروها در میان ارگانیسم­ها برای بسیاری از بیماری‏های تهدیدکننده زندگی رو به افزایش است می‏تواند استفاده شود؛ که به عنوان یک انتخاب مناسب برای این نوع تحقیقات به شمار می­روند. بیوسورفکتانت­ها با اثرات ضدمیکروبی بر روی طیف گسترده­ای از ارگانیسم­ها و همچنین، قابلیت مصارف غذایی آن‏ها‏ در برخی موارد وکمتر بودن اثرات جانبی آن‏ها‏ نسبت به آنتی بوتیک‏های رایج می‏توانند در برخی موارد جایگزین آنتی بیوتیک­ها شوند ‏‏(‏‏21).

در راستای بررسی اثرات ضدمیکروبی بیوسورفکتانت­ها، اثرات ضدباکتریایی بیوسورفکتانت­که در مصارف غذایی و آرایشی و بهداشتی نیز استفاده می‏شود، بر روی 6 باکتری مختلف عفونت­زا به ویژه باکتری استافیلوکوکوس اورئوس که هم ایجاد کننده مسمومیت­های غذایی و هم یکی از باکتری‏های مهم در ایجاد عفونت­هاست ‏‏همچنین، بر روی سودوموناس آئروژینوزا که از مقاوم­ترین باکتری­ها و بیماریزاست ارزیابی شدند. به این شکل که بیوسورفکتانت­ سودوموناس آئروژینوزا83در رقت‏های بالا بر رشد پروتئوس میرابیلیس، سالمونلا تیفی­موریوم، سودوموناس آئروژینوزا و اشریشیا کلی اثر مهارکنندگی و کشندگی داشت که نشان دهنده اثر آنتی­باکتریال قوی این بیوسورفکتانت­ بر روی این باکتری­هاست. همچنین، عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا83 بر روی استافیلوکوکوس اورئوس و استافیلوکوکوس اپیدرمیس هم اثر باکتریوسیدال و هم باکتریواستاتیک داشت که اعداد نزدیک به هم حداقل غلظت مهار کننده وحداقل غلظت کشنده نیز نشان دهنده اثر قوی باکتریوسیدال بیوسورفکتانت­ بر این باکتری­هاست. در بررسی مطالعات مشابه، تحقیقات کمی به‏ویژه‏‏ در ایران در مورد خواص ضد میکروبی بیوسورفکتانت­ها انجام شده و یا دراین مطالعات ‏‏در مورد جزئیات ویژگی‏های آنتی باکتریالی از جمله به نتایج هاله­های عدم رشد اشاره نشده است با این حال برخی از بیوسورفکتانت­های دکاپپتید­ی حلقوی جدید از گونه­های سودوموناس جدا شدند، که در شرایطآزمایشگاهی فعالیت ضدمیکروبی بر علیه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم آویوم داخل سلولی یافت شد ‏‏(‏‏22). وتسا و همکاران[xxxi] در سال 2010 گزارش دادند که رامنولیپید­ها جدا شده از سودوموناس دارای فعالیت ضد باکتریایی بر علیه باکتری­ گرم منفی؛ سودوموناس آئروژینوزا و باکتری گرم مثبت؛ استافیلوکوکوس بودند ‏‏(‏‏23). همچنین، فعالیت ضدمیکروبی بر اساس مقادیر حداقل غلظت مهارکنندگی بیوسورفکتانت رامنولیپید­ از سودوموناس AT10 بر روی باکتری­های گرم مثبت و گرم منفی، مخمر، و سویه­های قارچ به دست آمده است. که با نتایج  این پژوهش مشابه است ‏‏(‏‏24). با این حال وجودبرخیتفاوت‏هادر میزاناثراتضدمیکروبیمشاهدهشدهدراینمطالعهو تحقیقاتمشابهمیتواندبهدلیلتفاوتسوبسترا­هایمختلف برای رشد باکتری­تولیدکنندهبیوسورفکتانت­،استفادهازروش‏های مختلفبرایاستخراجوسایر... باشد.تفاوتدراثراتضد میکروبینشاندهنده تفاوت­های موجود در ترکیبات بیوسورفکتانت­هاست.

با توجه به نتایج این تحقیق می­توان گفت که این باکتری­ دارای پتانسیل فراوانی برای کاربرد­های بیوتکنولوژی و زیست محیطی است. بنابراین،‏‏ ما می‏توانیم در مورد استفاده از آن­ در آینده به عنوان اجزا تشکیل­دهنده چند­منظوره فکرکنیم. بنابراین، با وجود پتانسیل بسیار زیاد بیوسورفاکتانت­ها در این زمینه، استفاده از آن‏ها‏ هنوز محدود است. شاید دلیل آن هزینه­های تولید کمابیش بالا و همچنین، اطلاعات اندکی درمورد سمیت آن‏ها‏ نسبت به سیستم­های انسانی است با وجود این، تقاضای استفاده از آن‏ها‏ به شکل مکمل­های غذایی، موادآرایشی و محصولات دارویی نشان­دادن علاقه زیاد به استفاده از این محصولات میکروبی به دست­آمده است.



[1]. Sorbitan

[2]. Strenghted Nutrient Broth

[3]. rpm

[4]. Mineral Salt Solution

[5]. Yeast extract

[6]. Strenghted Nutrient Agar

[7]. Pour Plate

[8]. Glucose Yeast extract Agar

[9]. EMB

[10]. Vortex

[11]. Tensiometer-Kruess Klot

[12]. Triple Sugar Iron Agar

[13]. Sulfide Indole Motility

[14]. Methyl Red- Voges Proskauer

[15]. DMSO

[16]. Ninhydrin

[17]. Anthrone

[18]. Disk diffusion

[19]. Kirby Bauer

[20]. Muller hinton agar

[21]. Clinical and Laboratory Standards Institute

[xxii]. Tonkova & Galabova

[xxiii]. Okerentugba and Ezeronye

[xxiv]. Bola

[xxv]. Anandaraj

[xxvi]. Bodour

[xxvii]. Francy

[xxviii]. Bicca

[xxix]. Banat

[xxx]. Rosa  et al

[xxxi]. Vatsa et al

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

References

(‏‏1) ‏‏Banat I, Franzetti A, Gandolfi I, Bestetti G, Martinotti M, Fracchia L. et al. Microbial biosurfactants production, applications and future potential. Appl Microbiolol and Biotechnol. 2010; 87 (‏‏2): 427-44.

(‏‏2) ‏‏Cameotra SS, Makkar RS, Kaur J, Mehta SK. Synthesis of biosurfactants and their advantages to microorganisms and mankind. In: Ramkrishna Sen, editor. Biosurfactants. 20rd ed. NewYork:Springer 2010; 261-80.

(‏‏3) ‏‏Mireles JP, Toguchi A, Harshey RM. Salmonella enterica serovar typhimurium swarming mutants with altered biofilm-forming abilities: surfactin inhibits biofilm formation. J Bacteriol.2001;183 (‏‏20): 5848-54.

 

 

(‏‏4) ‏‏Bodour AA, Gerrero-Barajas C, Maier M. Structure and characterization of Flavolipids, a novel class of Biosurfactants produced by Flavolipid sp. Strain MTN11. Appl and Env Microbiol. 2004; 10 (‏‏6): 14-20.

(‏‏5) ‏‏Kosaric N. Biosurfactants and their application for soil bioremediation. Food Technol and Biotechnol.2001;39 (‏‏4): 295-304.

(‏‏6) ‏‏Hood SK, Zottola EA. Biofilms in food processing. Food Control.1995;6 (‏‏1): 9-18.

(‏‏7) ‏‏Anandaraj B, Thivakaran P. Isolation and production of biosurfactant producing organism from oil spilled soil. J Biosci Technol.2010; 1 (‏‏3): 120-6.

(‏‏8) ‏‏Namir I, Haddad Wang J, Bozhong M. Identification of a biosurfactant producing strain: Bacillus subtilis HOB2. Pro and Pep Lett.2009; 16: 7-13.

(‏‏9) Francy DS, Thomas JM, Raymond RL, Ward CH. Emulsification of hydrocarbons by subsurface bacteria. J Ind Microbiol.1991;8, 237-46.

(‏‏10)Tabatabaee, A, Mazaheri Assadi, M, Noohi, A.A. and V.A. Sajadian, Isolation of biosurfactant producing Bacteria from oil reservoirs. Iranian J Env Health Sci Eng.2005; 2 (‏‏1): 6-12.

(‏‏11) Walter V, Syldatk C, Hausmann R. ‏‏Screening concepts for the isolation of Biosurfactant producing Microorganisms. In: Ramkrishna Sen, editor.Biosurfactants. 29th ed. ‏‏Germany:Landes Bioscience and Springer Science; 2010

(‏‏12) ‏‏ Abdel-Mawgoud AM, Hausmann R, Lepine F, Muller MM, Deziel E. Rhamnolipid: Detection, Analysis, Biosynthesis, Genetic Regalation and Bioengineering of production. In: Gloria Soberón-Chávez, editor, Biosurfactants. 20th ed. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag; 2011.

 

(‏‏13) ‏‏AndrowJM. BSAC Standardized disc susceptibility testing method. J Antimicrob Chemother. 2001; 7 (‏‏5): 48 – 57.

(‏‏14) ‏‏Kasai Y, Kishira H, Sasaki T, Syutsubo K, Watanabe K, Harayama S. Predominant growth of Alcanivorax strains in oil-contaminated and nutrientsupplemented sea water. Env Microbiol.2002; 4 (‏‏3): 141-7.

(‏‏15) ‏‏Tonkova EV, Galabova D. Hydrolytic Enzymes and Surfactants of Bacterial Isolates from Lubricant-Contaminated Wastewater. Z Naturforsch. 2003;58 (‏‏c): 87-92.

(‏‏16) ‏‏Okerentugba PO, Ezeronye OU. Petroleum degrading potentials of single and mixed microbial cultures isolated from rivers and refinery effluents in Nigeria. Afr J Biotechnol. 2003; 2 (‏‏9): 288-92.

(‏‏17) ‏‏Bola O. Hydrocarbon Degrading Potentials Of Bacteria Isolated From a Nigerian Bitumen ‏‏(‏‏Transand) ‏‏Deposit. Nature sci. 2006; 4 (‏‏3): 51-57.

(‏‏18) ‏‏Bicca FC, Fleck LC, Zachio MA. Production of biosurfactant by hydrocarbon degrading Rhodococcus rubber and Rhodococcus erythropolis. Rev Microbiol. 1999;30: ‏‏(‏‏3): 231-6.

(‏‏19) ‏‏Banat IM, Makkar RS, Cameotra SS. Potential commercial applications of microbial surfactants. App and Env Microbiol. 2000; 53 (‏‏5): 495-508.

(‏‏20) ‏‏Rosa CFC, Michelon M, Burkert JFM, Kalil SJ, Burkert CAV. production of a rhamnolipid-type biosurfactant by Pseudomonas aeruginosa LBM 10 grown on glycerol. Afr J Biotechnol.2010; 9 (‏‏53): 9012-17.

(‏‏21) ‏‏Singh P, Cameotra SS. Potential applications of microbial surfactants in biomedical sciences. Tre Biotechnol. 2004;22 (‏‏3): 142-6.

(‏‏22) ‏‏Joachim V. Matrix assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry of lipopeptide biosurfactants in whole cells and culture filtrates of B. subtilis C1 isolated from petroleum sludge. App Env Microbiol.2002; 68 (‏‏12): 6210-19. ‏‏

(‏‏23) ‏‏Vatsa p, Sanchez L, Clement C, Baillieul F, Dorey S. Rhamnolipid Biosurfactants as new players in Animal and plant defens aginst microbes. Int J Mol Sci. 2010; 11 (‏‏12): 5095-8.

(‏‏24) ‏‏Abalos A, Pinazo A, Infante MR, Casals M, Garcı´a F, Manresa A. Physicochemical and Antimicrobial Properties of New Rhamnolipids Produced by Pseudomonas aeruginosa AT10 from Soybean Oil Refinery Wastes. Langmuir.2001; 17 (‏‏5): 1367-71.