جداسازی سویه‏های زانتوموناس لاکتوز مثبت از جمعیت باکتری بیماری‏زای شانکر مرکبات موجود در ایران

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد زیست شناسی سلولی و مولکولی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران،

2 استادیار زیست‏شناسی سلولی و مولکولی گیاه، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران،

3 دانشیار بیوتکنولوژی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران،

4 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران،

چکیده

  مقدمه: زانتان هتروپلی‏‏ساکاریدی است که توسط گروهی از باکتری‏های بیماری‏زای گیاهی از جنس زانتوموناس [i] تولید می‏شود. به طور معمول برای تهیه زانتان از منابع کربنی مثل گلوکز، سوکروز و نشاسته استفاده می‏شود. به علت هزینه‏های بالای فراوری و حمل این منابع کربنی، هزینه نهایی تولید زانتان از منابع اشاره شده بالا می‏رود. به دلیل میزان بیان پایین و در برخی موارد نقص آنزیم بتا گالاکتوزیداز در بسیاری گونه‏های زانتوموناس از جمله زانتوموناس کمپستریس [ii] ، نمی‏توان از محیط‏های ارزان قیمت سرشار از لاکتوز مثل آب پنیر برای تولید زانتان استفاده نمود. بنابراین، در صورت دسترسی به سویه‏های باکتریایی با قابلیت تجزیه لاکتوز، امکان بهره وری از یک منبع کربنی ارزان قیمت (آب پنیر) برای تولید یک فراورده تجاری ارزشمند (زانتان) فراهم خواهد آمد .   مواد و روش ‏‏ ها: در این پژوهش، بر روی کلکسیونی متشکل از 210 سویه ایرانی Xanthomonas citri subsp . Citri جمع آوری شده از باغات مرکبات جنوب ایران مطالعه شد. در ادامه کوشش شد که با استفاده از روش کار مولکولی و تعیین توالی ژن S rRNA 16 این سویه‏ها از جنسیت آن‏ها اطمینان حاصل شود. همچنین، رشد این باکتری‏ها در محیط لاکتوزی بررسی شد .   نتایج: از میان 210 سویه مورد مطالعه، 27 سویه قادر به رشد روی محیط غنی از لاکتوز بودند. سپس با تعیین توالی ژن S rRNA 16 این سویه‏ها و تطابق آن با دیگر توالی‏های S rRNA 16 باکتری‏های زانتوموناس موجود در بانک ژنی [iii] ، از جنسیت این باکتری‏ها اطمینان حاصل شد. همچنین، این باکتری‏ها، دارای رشد قابل قبولی در محیط‏ لاکتوزی بودند .   بحث و نتیجه ‏ گیری: در مجموع، می‏توان گفت که سویه‏های زانتوموناس لاکتوز مثبت جدا شده از باغات مرکبات جنوب ایران از قابلیت خوبی در مصرف لاکتوز برخوردار هستند و امید است که در آینده‏ای نزدیک، از این سویه‏های طبیعی در جهت تولید زانتان در محیط‏های ارزان قیمت لاکتوزی مثل آب پنیر بهره گرفت .   [i] . Xanthomonas   [ii] . Xanthomonas campestris   [iii] . Genbank

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

The screening of xanthomonas lactose – positive strains among bacterial populations of citrus canker disease isolated from Iran

نویسندگان [English]

  • aghdas ramezani 1
  • Seyed Mehdi alavi 2
  • ali hatef salmanian 3
  • mahyat jafari 4
1 M.Sc. of Cellular and molecular biology, National institute of genetic engineering and biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran
2 Assistant professor of Plant cellular and molecular biology, National institute of genetic engineering and biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran
3 Associate professor of Biotechnology, National institute of genetic engineering and biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran,
4 M.Sc. of Microbiology, National institute of genetic engineering and biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran
چکیده [English]

  Introduction: Xanthan is a heteropolysaccharide that is produced by the group of plant pathogen bacteria from Xanthomonas genus. Usually, the media containing glucose, sucrose and starch is used for xanthan production. Because their preparation and transferring is expensive, the final cost of xanthan production by these carbon sources is high. On the other hand, many Xanthomonas species such as X.campestris are not able to use cheap media rich of lactose such as whey to produce xanthan due to the low expression and sometimes the defect of their β-galactosidase enzyme. The access to bacterial strains capable of decomposing lactose will provide a possibility for producing a valuable commercial product (xanthan) from an inexpensive carbon source (whey) .   Materials and methods: In the present study, a collection containing 210 isolated Xanthomonas citri subsp. citri Iranian strains from citrus orchards in south Iran was studied. Then, the genus of these bacteria was determined by using molecular techniques and sequencing of 16S-rDNA gene. Also, their growth in lactose – based medium was investigated .   Results: Among 210 strains, 27 strains were able to grow on lactose rich medium. Then, the genus of these bacteria was proved by sequencing of 16S-rDNA gene and comparison with another 16S-rDNA gene sequences existing in NCBI. Also, these bacteria had considerable growth in lactose-based medium . Discussion and conclusion : At last, we can say that separated lactose-positive Xanthomonas strains from southern citrus orchards have good ability to utilize lactose and in the near future, it would be possible to apply these native strains for xanthan production in cheaper lactose media such as whey .

کلیدواژه‌ها [English]

  • Xanthomonas
  • Lactose
  • Xanthan

مقدمه

باکتری Xanthomonas. citri subsp. citri یک باکتری کوکوباسیل گرم منفی از شاخه پروتئوباکترها بوده و عامل بروز بیماری شانکر مرکبات است. این باکتری، میله‏ای شکل بوده و توسط یک تاژه قطبی حرکت می‏کند. زانتوموناس‏ها رنگدانه زردی تولید می‏کنند که مشتق برومی آریل پلی‏ان[1] است و زانتومونادین نام دارد. این رنگدانه در آب نا‏محلول و در اتر، نفت، متانول و بنزن قابل حل است (1). همچنین، این باکتری‏ها یک اگزوپلی‏ساکارید خارج سلولی به نام زانتان تولید کرده که شامل: واحدهای پنتاساکاریدی گلوکز، مانوز و گلوکورونیک اسید با نسبت‏های 1:2:2 است. این پلی‏ساکارید به باکتری ظاهر موکوئیدی داده و علاوه بر این که باکتری را از شرایط نا‏مساعد محیطی (اثرات نور و حمله باکتریوفاژ‏ها) محافظت می‏کند، دارای مصارف دارویی، صنعتی، غذایی، شیمیایی و کشاورزی نیز هست (2 و3). برای تولید زانتان، باکتری‏های زانتوموناس نیازمند عناصر میکرو و ماکرو به عنوان منابع کربن و نیتروژن هستند. گلوکز و سوکروز، از رایج‏ترین منابع کربن مورد استفاده توسط این باکتری‏ها هستند (4). با وجود این، به دلیل میزان بیان پایین و در برخی از موارد نقص آنزیم بتا گالاکتوزیداز- آنزیمی که قادر است لاکتوز را به گلوکز و گالاکتوز بشکند- این باکتری قادر به رشد کافی و تولید میزان مناسبی زانتان در محیط‏های پایه‏ای لاکتوز نیستند (5 و 6). نخستین بار در سال 1979 ژن کد کننده آنزیم بتا‏گالاکتوزیداز از باکتری Xanthomonas campestris B-1459 استخراج و تعیین صفت شد (5) و سپس در سال 1995 از باکتری Xanthomonas axonopodis pv. manihotis همسانه‌سازی شد (7).

آب پنیر یک محصول فرعی صنایع لبنی است که حاوی 55 درصد از کل مواد شیر از جمله لاکتوز، پروتئین، نمک‏های معدنی و ویتامین‏هاست. دفع آب پنیر به علت سطح بالای نیازش به اکسیژن زیستی، نیاز به پالایش دارد که وقت گیر و پرهزینه است. به همین دلیل و همچنین، به علت محتوای لاکتوز زیاد آن، آب پنیر به عنوان سوبسترایی مناسب برای انواع تخمیر استفاده شده است (8). اسچوارتزو همکاران[2]  در سال 1985 کوشش کردند که از آب پنیر به عنوان منبع کربن برای تولید زانتان از باکتری X. campestris استفاده کنند ولی غلظت کمی از این صمغ به‏دست آمد (9). بنابراین، کوشش شد تا با همسانه‌سازی ژن بتا‏گالاکتوزیداز از باکتری‏های دیگر از جمله اشریشیا کلی[3] و انتقال آن به زانتوموناس و یا ایجاد انواع جهش‏ها در این باکتری‏ها، گونه‏هایی مستعد به استفاده از لاکتوز پیدا کنند. از جمله این آزمایش‌ها می‏توان به مطالعه والش و همکاران[4] اشاره کرد. والش و همکاران برای انتقال ژن lac z از E.coliبه X. campestris از ترانسپوزون Tn 951 استفاده کردند که در نهایت به بیان بالای ژن بتاگالاکتوزیداز در این سویه منجر شد (10). صعودی و همکاران[5] در سال 2008 یک سویه بومی زانتوموناس مزارع ایران را به کمک اسید نیترو و به روش جهش‏زایی- انتخاب[6] جدا‏سازی کردند. فعالیت آنزیم بتا‏گالاکتوزیداز در شرایط دمایی 38 درجه سانتی‏گراد و اسیدیته 5/5 حدود 5/9 برابر سویه وحشی بود (11).

با وجود این، به نظر می‏رسد هنوز غربال‏گری به منظور دستیابی به سویه‏های طبیعی مصرف کننده لاکتوز از مطلوب‏ترین و مقرون به صرفه‏ترین روش‏ها برای تولید این پلیمر طبیعی با ارزش است.

در پژوهش حاضر، کوشش شد که از بین سویه‏های بومی Xanthomonas citri subsp. citri موجود در کلکسیون پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست‌فناوری[7]، سویه‏هایی که به طور طبیعی قادر به مصرف لاکتوز باشند جدا شده و از جنسیت آن‏ها اطمینان حاصل شود. در ادامه، مطالعات تکمیلی روی این باکتری در خصوص رشد در محیط‏های لاکتوزی انجام شد.

 

مواد و روش‏ها

سویه‏های باکتریایی

سویه‏های بومی Xanthomonas citri subsp. citri از مناطق آلوده به بیماری شانکر باکتریایی مرکبات در استان‏های جنوبی کشور شامل: کرمان، هرمزگان، فارس و سیستان و بلوچستان جدا‏سازی شدند (12).

سویه باکتریایی Xanthomonas campestris pv. campestris DSM1706 به عنوان باکتری شاهد در مقایسه با سویه‏های بومی Xanthomonas citri subsp. Citri استفاده شد (13).

از باکتری E. coli سویه BL21 به علت دارا بودن اپران کامل لاکتوز به عنوان کنترل مثبت در آزمون‌های غربال‏گری استفاده شد. به منظور انجام نوترکیبی، از سویه DH5αE.coli و همچنین، پلاسمید pTZ57R/T تهیه شده از شرکت فرمنتاز[8] برای همسانه‌سازی و تعیین توالی قطعات تکثیر شده در این باکتری استفاده شد.

کشت باکتری E. coli در محیط کشت لوریا برتانی (LB)حاوی 5 گرم عصاره مخمر، 5 گرم سدیم کلرید، 10 گرم تریپتون و 13 گرم آگار در لیتر انجام شد. برای غربال‏گری سویه‏ها در محیط پایه‏ای لاکتوز از محیط رنگی (C-dye) Cحاوی 1 گرم عصاره مخمر، 1/0 گرم منیزیم سولفات 7 آبه، 5/0 گرم آمونیوم دی هیدروژن فسفات، 5/0 گرم دی پتاسیم فسفات، 5 گرم سدیم کلرید، 5 گرم لاکتوز، 12 گرم آگار، 7/0 میلی‏لیتر معرف اسیدیته بروموکروزول پرپل[9] (5/1 درصد در اتانول) در لیتر استفاده شد. همچنین، محیط کشت مک کانگی آگار (50 گرم پودر خشک در 1 لیتر آب مقطر) به علت دارا بودن معرف اسیدیته، به منظور تأیید قابلیت مصرف کنندگی لاکتوز در سویه‏های مورد مطالعه، استفاده شد. برای اندازه‏گیری سرعت رشد سلولی از محیط XOLN (محیط XOL+ 0625/0 درصد عصاره مخمر و 0625/0 درصد تریپتون) دارای 4/0 درصد لاکتوز یا گلوکز استفاده شد (14).

استخراج DNA ژنومی

 DNA ژنومی باکتری به روش[10]CTAB استخراج شد (15). به منظور تخلیص پلاسمید در حجم کم[11] از روش لیز قلیایی مطابق سمبروک و همکاران[12]، استفاده شد (16). دو جفت آغازگر با استفاده از نرم افزار ClustalW، برای ژن‏های S rRNA16 از سویه‏های مختلف X. campestris و از طرفی مقایسه آن با
 S rRNA16 باکتری E. coli، از نواحی کاملاً اختصاصی این ژن در X.campestris طراحی شد (13). بررسی مولکولی کلونی‏های نوترکیب با استفاده از واکنش PCR و هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب انجام شد.

 

نتایج

به منظور غربال‏گری سویه‏های بومی
 X. citri subsp. Citri موجود در کلکسیون NIGEB، کشت روی محیط جامد حداقل لاکتوزی و محیط‏های کشت مک کانگی آگار و C-dye (که دارای معرف اسیدیته برای تشخیص باکتری‏های تولید کننده اسید از تخمیر لاکتوز است) انجام شد. تا زمان ظهور کلونی‏ها، کشت‏ باکتریایی در دمای 28 درجه سانتی‏گراد قرار گرفت. چنانچه باکتری‏ها بتوانند از لاکتوز به عنوان تنها منبع کربن موجود در محیط کشت استفاده کنند، باید در محیط حداقل لاکتوزی قادر به رشد باشند، در محیط مک کانگی آگار، در نتیجه استفاده از لاکتوز و تغییر اسیدیته محیط (به علت تولید لاکتیک اسید) به شکل کلونی‏های ارغوانی ظاهر شوند ودر محیط C-dye نیز رنگ محیط را از بنفش به زرد تغییر دهند. نتایج این آزمونها نشان می‏دهد که از میان 210 سویه بومی
 X. citri subsp. Citri جمعآوری شده از مناطق جنوبی کشور که در این تحقیق ارزیابی و مطالعه شدند (12)، تعداد 27 سویه قادر به مصرف لاکتوز بوده و شاخص‏های فنوتیپی و بیو‏شیمیایی فوق را دارند (جدول 1).

 

 

جدول 1- اطلاعات مربوط به سویه‏های Xanthomonas citri subsp. citri مصرف کننده لاکتوز موجود در NIGEB

طول زمان تخمیر

مدت زمان واکنش پس از کشت روی محیط C.dye (ساعت)

منشا جغرافیایی

منشا بیولوژیک و میزبان

سال جمع‏آوری

سویه باکتریایی

 

سیستان و بلوچستان

فارس

هرمزگان

کرمان

 

پایان

شروع

 

48

72

24

 

 

 

رضا آباد

برگ16.C. a

خرداد 1387

NIGEB-041

 

48

72

24

 

 

رودان

 

برگ.C. a

خرداد 1387

NIGEB-056

 

48

72

24

 

 

رودان

 

برگ.C. a

خرداد 1387

NIGEB-068

 

48

72

24

 

 

سرکهنان

 

برگ.C. a

خرداد 1387

NIGEB-072

 

48

72

24

 

 

هشتبندی

 

برگ.C. a

خرداد 1387

NIGEB-095

 

48

72

24

 

افزر

 

 

برگ.C. a

خرداد 1387

NIGEB-120

 

48

72

24

 

جهرم

 

 

برگ.C. a

خرداد 1387

NIGEB-133

 

48

72

24

 

جهرم

 

 

برگ.C. a

خرداد 1387

NIGEB-140

 

48

96

48

 

جهرم

 

 

برگ.C. a

خرداد 1387

NIGEB-152

 

48

96

48

 

جهرم

 

 

برگ.C. a

خرداد 1387

NIGEB-156

 

48

72

24

سرباز

 

 

 

برگ.C. a

دی 1388

NIGEB-196

 

48

72

24

سرباز

 

 

 

برگ.C. a

دی 1388

NIGEB-197

 

72

96

24

سرباز

 

 

 

برگ.C. a

دی 1388

NIGEB-198

 

48

72

24

سرباز

 

 

 

برگ.C. a

دی 1388

NIGEB-199

 

24

48

24

سرباز

 

 

 

برگ.C. a

دی 1388

NIGEB-200

 

24

48

24

سرباز

 

 

 

برگ.C. a

دی 1388

NIGEB-201

 

48

72

24

سرباز

 

 

 

برگ.C. a

دی 1388

NIGEB-203

 

48

72

24

سرباز

 

 

 

برگ.C. a

اردیبهشت 1389

NIGEB-204

 

24

48

24

سرباز

 

 

 

برگ.C. a

اردیبهشت 1389

NIGEB-205

 

24

48

24

 

 

چاه زیارت

 

برگ.C. a

فروردین 1389

NIGEB-206

 

48

72

24

نیک شهر

 

 

 

برگ.C. a

اردیبهشت 1389

NIGEB-207

 

ادامه جدول 1:

طول زمان تخمیر

مدت زمان واکنش پس از کشت روی محیط C.dye (ساعت)

منشا جغرافیایی

منشا بیولوژیک و میزبان

سال جمع‏آوری

سویه باکتریایی

 

سیستان و بلوچستان

فارس

هرمزگان

کرمان

 

پایان

شروع

 

48

72

24

 

 

رودان (بند ملا)

 

برگ.C. a

اردیبهشت 1389

NIGEB-208

 

24

48

24

 

 

رودان (بند ملا)

 

برگ.C. a

اردیبهشت 1389

NIGEB-209

 

48

72

24

 

 

رودان (بند ملا)

 

برگ.C. a

آبان 1379

NIGEB-K32

 

24

48

24

 

 

میناب

 

برگ.C. a

آبان 1379

NIGEB-K37

 

48

72

24

ایرانشهر

 

 

 

برگ.C. a

آبان 1379

NIGEB-K48

 

48

72

24

ایرانشهر

 

 

 

برگ.C. a

آبان 1379

NIGEB-K56

 

 

 

از میان 27 سویه‏ مصرف کننده لاکتوز، 3 سویه NIGEB-K37، NIGEB-200 (سریع رشد) و
NIGEB-196 (متوسط رشد) به شکل کاملا اتفاقی برای ادامه کار و انجام آزمایش‌های بیشتر انتخاب شدند. نتایج این غربال‏گری برای این 3 سویه در شکل‏های 1 تا 3 آمده است.

 

 

 

شکل 1- کشت سویه‏های باکتریایی در محیط C-dye پس از 24 ساعت. A: سویه E. coli BL21 به عنوان کنترل لاکتوز مثبت، B: سویه ایرانی NIGEB-K37، C: سویه ایرانی NIGEB-200، D: سویه ایرانی NIGEB-029، E: سویه ایرانی NIGEB-196، F: سویه DSM1706 به عنوان کنترل لاکتوز منفی

 

شکل 2- کشت سویه‏های باکتریایی در محیط C-dye پس از 48 ساعت. A: سویه E. coli BL21 به عنوان کنترل لاکتوز مثبت، B: سویه ایرانی NIGEB-K37، C: سویه ایرانی NIGEB-200، D: سویه ایرانی NIGEB-029، E: سویه ایرانی NIGEB-196، F: سویه DSM1706 به عنوان کنترل لاکتوز منفی

 

 

شکل 3- کشت سویه‏های باکتریایی در محیط حداقل لاکتوزی و مک کانگی آگار پس از 24 ساعت. A: سویه E. coliBL21به عنوان کنترل لاکتوز مثبت روی محیط حداقل لاکتوزی، B: سویه‏های ایرانی NIGEB-K37، NIGEB-200، NIGEB-029، NIGEB-196 و سویه DSM1706 به عنوان کنترل لاکتوز منفی روی محیط حداقل لاکتوزی، C: سویه‏های ایرانی NIGEB-K37، NIGEB-200، NIGEB-029، NIGEB-196 و سویه DSM1706 به عنوان کنترل لاکتوز منفی روی محیط مک کانگی آگار، D: سویه E. coli BL21 به عنوان کنترل لاکتوز مثبت روی مک کانگی آگار

 

 

همان‏طور در شکل‏های 1 تا 3 ملاحظه می‏شود، سویه‏های ایرانی NIGEB-K37، NIGEB-200 و NIGEB-196به علت قابلیت مصرف لاکتوز توانسته‏اند رنگ محیط C-dye و مک کانگی آگار را تغییر داده و در محیط حداقل لاکتوزی رشد کنند.

تأیید مولکولی باکتری‏های انتخاب شده بر مبنای
S rRNA16

به منظور کسب اطمینان از تعلق سویه‏های لاکتوز مثبت به جنس زانتوموناس، به تکثیر، همسانه‏سازی و ردیف‏یابی بخشی از ژن S rRNA16یکی از سویه‏های مورد مطالعه اقدام شد. پس از استخراج DNA و تعیین کیفیت DNA سویه NIGEB-K37 (شکل A4)، به تکثیر ژن S rRNA16 به کمک جفت آغازگر‏های اختصاصی Xcc16SF1/R1 و  Xcc16SF2/R2اقدام شد (13). در این واکنش، از DNA باکتری E. coli به عنوان الگوی واکنش کنترل منفی PCR استفاده شد (شکل B4). چنانچه از شکل B4 بر‏می‏آید، هر دو جفت آغازگر‏های اختصاصی قادر به تکثیر ناحیه هدف از ژنوم سویه NIGEB-K37بوده‏اند. تکثیر ژنوم مذکور با آغازگر‏های Xcc16SF1/R1، تولید قطعه‏ای به طول 611 جفت باز و با استفاده از آغازگر‏های Xcc16SF2/R2 تولید قطعه‏ای به طول 1290 جفت باز نموده است. سپس، با استفاده از آغازگر‏های استاندارد M13 به تعیین ترادف نواحی تکثیر شده ژن
 S rRNA16سویه مذکور اقدام شد.

M            1              3              1                M            2              4

 

 

 


750

 

1000

 

1290

 

611

 

1290

.

شکل 4- A: سنجش کیفی DNA استخراج شده از سویه NIGEB-K37 با استفاده از الکتروفورز ژل آگاروز 8/0درصد ؛ نشانگر اندازه 1kb (خط M) و ژنوم سویه باکتریایی (خط 1)؛

B: سنجش فراورده PCR ژن S rRNA16 روی ژل آگاروز 1درصد؛ با استفاده از آغازگر‏های Xcc16SF1/R1 (خط 1)، Xcc16SF2/R2 (خط 2)، فراورده PCR ژنوم سویه باکتریایی E.coli DH5α (کنترل‏های منفی) به کمک آغازگر‏هایXcc16SF1/R1 و Xcc16SF2/R2 (خط‏های 3 و 4) و نشانگر اندازه 1kb (خط M). اندازه چند نوار DNA در حاشیه شکل نشان داده شده است

همچنین، به منظور تعیین ترادف بخشی از ژن
 S rRNA16در سویه NIGEB-K37 به نمایندگی از جمعیت بومی سویه‏های باکتریایی عامل بیماریزای شانکر مرکبات، آمپلیکون‏های حاصل از جفت آغازگر‏های Xcc16SF1/R1 (به طول 611 جفت باز) و Xcc16SF2/R2 (به طول 1290 جفت باز) در pTZ57R/Tهمسانه‌سازی شدند.

هضم آنزیمی پلاسمید‏های نوترکیب

1000

به منظور اطمینان از انجام عمل نو‏ترکیبی، به تکثیر پلاسمید‏های نو‏ترکیب درون میزبان باکتریایی
E. coli DH5α (شکل A, B5) (5) اقدام شد. همچنین، به منظوراطمینان بیشتر از ورود قطعات هدف به داخل پلاسمید pTZ57R/T و جایگیری مناسب آن‏ها در این ناقل ژنی، به هضم آنزیمی نو‏ترکیب‏ها با استفاده از دو آنزیم برشی SacI و BamHI اقدام شد. جایگاه برش آنزیم SacI در فرا‏‏دست و جایگاه برش آنزیم BamHI در فرودست جایگاه ورود قطعه S rRNA16است. در صورت همسانه‌سازی قطعه مورد نظر، انتظار می‏رود که پس از هضم آنزیمی، قطعاتی در حدود 1290 و 611 جفت باز از پلاسمید خارج شود (شکل C5).

 

 

500

 

750

 

1290

 

1000

 

M

 

1

 

2

 

M

شکل A, B5- قطعات حاصل از پلاسمید‏های نوترکیب. A وB: قطعات حاصل از PCR با آغازگر‏هایXcc16SF1/R1 (خط 1) و آغازگر‏های Xcc16SF2/R2 (خط 2)

 

 

 

1290

 

611

 

M

 

1

 

2

 

3

 

4

1

شکل A, B5- قطعات حاصل از هضم آنزیمی پلاسمیدهای حاوی قطعه 611 جفت باز (خط 1، 2 و 3)، و پلاسمید حاوی قطعه 1290 جفت باز (خط 4) خط M در هر سه شکل A، B وC بیانگر نشانگر اندازه یک کیلوباز است.

 

ردیف یابی ناقص ژن S rRNA16

ناقل pTZ57R/T به دلیل داشتن دو جایگاه اتصال برای آغازگرهای استاندارد رفتی و برگشتی M13 به ترتیب در دو سمت فرا‏دست و فرو‏دست ژن‏های همسانه‌سازی شده درمحل‏های چند گانه همسانهسازی (Multiplecloning site, MCS)، امکان تعیین توالی ژن مربوطه را فراهم می‏سازد.

شکل - استخراج پلاسمیدهای PTZ57R/T.

خط 1 نشانگر 100 bp و خطوط 2و3 پلاسمیدهای فاقد قطعه و خط 4 پلاسمید دارای قطعه می باشند.

 بنابراین، برای آگاهی از ترادف ژنی کلون‏های نو‏ترکیب، از این جفت آغازگر استفاده شد. به منظور آگاهی از تشابهات احتمالی توالی ذکر شده با داده‏های موجود در بانک‏های ژنی، تحلیل Blastn انجام شد. نتایج به دست آمده گویای در صد بالای تشابه 97 درصد ژنS rRNA16سویه بومی
NIGEB-K37 با توالی‏های مشابه در جنس زانتوموناس است. این توالی نوکلئوتیدی تحت شماره JN039034 در NCBI به ثبت رسیده است.

 

مقایسه منحنی رشد باکتری‏های X. citri subsp. Citri و
X. campestris pv. campestrisDSM1706 در محیط‏های حاوی قند گلوکز و لاکتوز

به منظور بررسی میزان رشد سویه‏های غربال شده
 X. citri subsp. Citri روی محیط‏های حاوی لاکتوز و گلوکز در قیاس با سویه شاهد استاندارد
X. campestris pv. campestris DSM1706، در محیط XOLN+ 4/0 درصد لاکتوز وXOLN+ 4/0 درصد گلوکزو تحت شرایط دمای 28درجه سانتی‏گراد و 180 دور در دقیقه رشد داده شد. سپس، میزان جذب نوری نمونه‏ها در طول موج 600 نانومتر (OD600) در بازه‏های زمانی 2 ساعته از زمان صفر تا 26 ساعت قرائت شد. همان طورکه از نتایج شکل 6 بر می‏آید، سویه‏هایNIGEB-K37 و NIGEB-200 در محیط حاوی لاکتوز (A) دارای منحنی رشد مطلوبی هستند. بر این اساس، هر دو سویه پس از حدود 2 ساعت وارد فاز لگاریتمی شده و پس از گذشت زمان تقریبی 22 (در موردNIGEB-K37) و 20 ساعت (در مورد NIGEB-200) وارد فاز ثابت رشد می‏شوند (به ترتیب با جذب نوری 917/1 و 681/1). در همین حال، از نتایج شکل (A) چنین استنباط می‏شود که سویه‏های
NIGEB-196 وDSM1706 از رشد مطلوبی در محیط‏های حاوی لاکتوز برخوردار نبوده است به طوری که پس از حدود 14 ساعت به حداکثر رشد (به ترتیب با جذب نوری 7/0 و 61/0) رسیده و پس از آن در فاز ثابت رشد باقی می‏مانند. بر اساس نتایج این تحقیق، رفتار سویه‏های مذکور در محیط حاوی گلوکز کاملا متفاوت بوده به طوری که در مقایسه با محیط حاوی لاکتوز، می‏توان یک روند معکوس را در خصوص این سویه‏ها مشاهده نمود. در این حالت سویه‏های NIGEB-K37 و NIGEB-200 پس از شروع فاز لگاریتمی رشد در زمان 14 ساعت، به سرعت حداکثر فاز رشدی نزدیک شده و منحنی رشد آن‏ها در جذب نوری OD600 در 9/0 و 1 ثابت می‏شود. بر خلاف این دو سویه لاکتوز مثبت، سویه بومیNIGEB-196 و سویه شاهد DSM1706 در محیط گلوکزی از روند رشد مطلوبی برخوردار هستند. این دو سویه پس از استقرار در محیط کشت (کمتر از یک ساعت) وارد فاز لگاریتمی شده و در زمان 14 ساعت به حداکثر رشد خود (به ترتیب با جذب نوری 1/3 و 3/3) می‏رسند.

 

 

 

A

 

 

B

شکل 6- مقایسه منحنی رشد سویه‏های بومی NIGEB-K37، NIGEB-200 و NIGEB-196 و سویه شاهد DSM1706. A: محیط XOLN+ 4/0 درصد لاکتوز B: محیط XOLN+ 4/0 درصد گلوکز


بحث و نتیجه‏گیری

باکتری‏های جنس زانتوموناس به دلیل تولید اگزو‏پلی‏ساکاریدی به نام زانتان، در بسیاری از صنایع بالا دستی مثل نفت و دارو و همچنین، صنایع پایین دستی مثل صنایع غذایی کاربرد دارد. این پلی‏ساکارید ظاهری موکوئیدی به باکتری داده و باکتری را از شرایط نا‏مساعد محیطی محافظت می‏کند. همچنین، به علت خاصیت رئولوژیکی و پایداری آن در محدوده وسیعی از حرارت و اسیدیته، به عنوان عامل معلق‏کننده، غلیظ ‏کننده و پایدار‏کننده در غذا‏ها به کار رفته و ویسکوزیته نهایی غذا را تحت تاثیر خود قرار می‏دهد. علاوه بر این، در صنایع شیمیایی به عنوان پایدار‏کننده رنگ‏ها، در صنایع سرامیک به عنوان معلق‏کننده ذرات سنگین، اصلاح‏کننده جریان در لوازم آرایشی و خمیر دندان‏ها و همچنین، در صنایع نفت، در مایعات حفاری چاه و پاکسازی خطوط لوله کاربرد دارد (3). در تهیه زانتان، از کشت این باکتری‏ها در محیط‏هایی با منابع کربنی سوکروز، گلوکز و نشاسته استفاده می‏شود (4) ولی تولید آن در مقیاس صنعتی با استفاده از منابع کربن ارزان قیمتی مثل ملاس چغندر و آب پنیر نیز امکان پذیر است. از دیگر سو، به دلیل میزان بیان پایین و در برخی از موارد نقص آنزیم بتا‏گالاکتوزیداز در باکتری‏های جنس زانتوموناس، استفاده از لاکتوز به عنوان منبع کربن در محیط‏های کشت امکان پذیر نیست (5). با این اوصاف، بدیهی است که دستیابی به سویه‏های لاکتوز مثبت طبیعی یا دست ورزی ژنتیکی سویه‏های تجاری برای کسب قابلیت رشد در محیط‏های لاکتوزی و بهره‏مندی از ضایعات صنایع غذایی (مثل آب پنیر) در تولید زانتان می‏تواند از نظر اقتصادی دارای مزیت نسبی مطلوبی باشد. آب پنیر به علت سطح بالای نیاز زیستی به اکسیژن مشکلات زیادی را برای محیط زیست به وجود می‏آورد. بهترین شیوه برای خارج کردن آب پنیر از چرخه تولید محصولات لبنی، استفاده از آن به عنوان سوبسترا در تولید محصولات با ارزش صنعتی مانند زانتان است. تحقق این امر در گرو برخورداری سویه‏های زانتوموناس از قابلیت (طبیعی یا مصنوعی) مصرف لاکتوز است.

برای تولید مصنوعی چنین سویه‏هایی می‏توان از روش‏های مهندسی ژنتیک استفاده نمود (17). با وجود این، موانع متعددی ممکن است سودمندی چنین فرآیندی را تحت تاثیر قرار دهد. به طور مثال ممکن است پایداری ژن خارجی در سلول میزبان با مشکل مواجه شده و یا سویه مهندسی شده از نظر زیست محیطی و قوانین ایمنی زیستی با خطر مواجه شود (18). اما، دستیابی به سویه‏ها‏یی که قادر باشند به طور طبیعی و با استفاده از منابع کربنی ارزان قیمت به تولید زانتان بپردازند می‏تواند به ایجاد مزیت نسبی در تولیدات صنعتی وابسته به مصرف زانتان منجر شود؛ به طوری که با اختصاص منابع اولیه ارزان بتوان به تولید محصولات با ارزش اقتصادی بالا اقدام کد. نتایج این پژوهش نشان می‏دهد که سویه‏های غربال شده از جمعیت بومی باکتری‏ها‏ی بیماری زای شانکر مرکبات، توانایی خوبی در استفاده از منبع کربنی لاکتوز دارند.

در این پژوهش، کوشش شد تا از میان 210 سویه ایرانی باکتری X. citri subsp. Citriموجود در کلکسیون پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری (NIGEB)که از استان‏های کرمان، هرمزگان، فارس و سیستان و بلوچستان جمع‏آوری شده بودند، سویه‏هایی که به طور طبیعی قادر به مصزف لاکتوز باشند جداسازی شده و از رشد آن‏ها در محیط‏های غنی از لاکتوز اطمینان حاصل شود. به منظور غربال‏گری، سویه‏های مورد مطالعه ابتدا روی محیط لاکتوزی دارای معرف اسیدیته C-dye))کشت شد. داده‏ها‏ی به دست آمده (نتایج نشان داده نشده اند) گویای وجود تنوع در سرعت تغییر رنگ محیط در میان این سویه‏هاست. این امر، شاید در اثر تفاوت‏هایی است که در بیان و فعالیت آنزیم بتا گالاکتوزیداز سویه‏ها‏ی مورد مطالعه در شرایط مورد آزمون رخ می‏دهد. شاید بتوان چنین استنباط کرد که سویه‏هایی که در مدت زمان کمتری رنگ محیط را تغییر داده‏اند دارای فعالیت بالاتری از آنزیم بتا گالاکتوزیداز بوده و یا بیان بالاتری از این آنزیم دارند و در نتیجه، قابلیت بهتری در استفاده از لاکتوز به عنوان منبع کربنی داشته باشند. این ادعا از آن‏جا‏ نشات می‏گیرد که سویه شاهد DSM1706 فعالیت مطلوبی از نقطه نظر آنزیم بتا گالاکتوزیداز از خود بروز نمی‏دهد و همان‏طور که نشان داده شده است، این موضوع به نقص ژنتیکی این سویه در تولید آنزیم مذکور مربوط می‏شود.

نتایج تکمیلی حاصل از رشد سویه‏های هدف روی محیط لاکتوزی دارای معرف اسیدیته مک کانگی آگار و نیز رشد روی محیط حداقل لاکتوز بار دیگر تأییدی است بر قابلیت سویه‏های بومی باکتری بیماری‏زای شانکر مرکبات در مصرف لاکتوز به عنوان منبع کربن (شکل 3). این موضوع، همچنین، بیانگر ضعف سویه شاهد در بکار‏گیری این منبع کربنی است. البته، نباید از نظر دور داشت که برخی سویه‏های انتخابی از کلکسیون NIGEB، مثل NIGEB-196 نیز همانند سویه شاهد از قابلیت کمی در مصرف لاکتوز برخوردار هستند (شکل 6). برای فهم دقیق از میزان فعالیت آنزیم
بتاگالاکتوزیداز در سویه‏های بومی، نیاز به روشهای سنجش آنزیمی و نیز مطالعه میزان بیان ژن‏های اپران لاکتوز با روش‏ها‏ی کمی مثل -PCRReal Time و یا وسترن بلاتینگ است.

نتایج این تحقیق، همچنین، نشان می‏دهد که در محیط گلوکزی، دو سویه NIGEB-196 و DSM1706 دارای رشد بیشتری نسبت به سویه‏هایNIGEB-K37 و NIGEB-200 هستند که نشان دهنده قابلیت بهتر آن‏ها در استفاده ازگلوکز است. این امر نشان می‏دهد که اگرچه NIGEB-196 می‏تواند از منبع کربن لاکتوز استفاده کند (هرچند خیلی ضعیف) ولی برای استفاده از گلوکز بسیار توانمندتر است. در مورد سویه شاهد DSM1706 همان‏طور که انتظار می‏رفت، گلوکز به عنوان منبع کربن بسیار خوب برای این باکتری محسوب شده و در این محیط رشد مطلوبی نشان می‏دهد. در محیط لاکتوزی مشخص شد که دو سویه
 NIGEB-K37 و NIGEB-200 قابلیت خوبی در استفاده از لاکتوز دارند.

 



[1]. Brominated aryl-polyene

[2]. Schwartz et al.

[3]. Escherichia coli (E. coli)

[4]. Walsh et al.

[5]. Soudi et al.

[6]. mutation-selection

[7]. National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB)

[8]. Fermentase

[9]. Bromocresol purple (1.5% Et.OH)

[10]. hexadecyl trimethyl ammonium bromide

[11]. Mini- Preparation

[12]. Sambrook et al.

 

References

(1) Poplawsky A, Urban S, Chun W. Biological role of Xanthomonadin pigments in Xanthomonas campestris pv. campestris. Appl Environ Microbiol 2000; 66 (12): 5123–7.

(2) Garcia-Ochoa F, Santos VE, Casas JA, Gomez E. Xanthan gum: production, recovery, and properties. Biotechnol Adv 2000; 18 (7): 549–79.

(3) Lachke A. Xanthan—a versatile gum. Resonance 2004; 9 (10): 25–33.

(4) Kennedy JF, Bradshaw IJ. Production, properties and applications of xanthan. Prog Ind Microbil1984; 19: 319-71.

 

 

(5) Frank JF, Somkuti GA. General properties of beta-galactosidase of Xanthomonas campestris. Appl Environ Microbiol 1979; 38 (3): 554-6.

(6) Yang TC, Wu GH, Tseng YH. Isolation of a Xanthomonascampestris strain with elevated beta-galactosidase activity for direct use of lactose in xanthan gum production. Lett appl microbiol 2002; 35 (5): 375–9.

(7) Taron CH, Benner JS, Hornstra LJ, Guthrie EP. A novel beta-galactosidase gene isolated from the bacterium Xanthomonas manihotis exhibits strong homology to several eukaryotic beta-galactosidases. Glycobiol 1995; 5 (6): 603-10.

(8) Pesta G, Meyer-Pittroff R, Russ W. Utilization of whey. In: Oreopoulou V, Russ W, volume editors. Utilization of by-products and treatment of waste in the food industry. 3th vol. New York: Springer US; 2007.

(9) Schwartz RD, Bodie EA. Production of high-viscosity whey broths by lactoseutilizing Xanthomonas campestris strain. Appl Environ Microbiol 1985; 50 (6): 1483-5.

(10)            Walsh PM, Haas MJ, Somkuti GA. Genetic construction of lactose-utilizing Xanthomonascampestris. Appl Environ Microbiol 1984; 47 (2): 253-7.

(11)            Ashraf S, Soudi MR, Sadeghizadeh M. Isolation of a novel mutated strain of Xanthomonas campestris for xanthan production using whey as the sole substrate. Pakistan journal of biological sciences 2008; 3 (11): 438 –42.

(12)            Soltaninejad H.The detecting of genetic variation among Iranian strains of Xanthomonas citri subsp. Citri, casual agent of bacterial citrus canker [Dissertation]. Tehran: science and research branch of Islamic univ.; 2010.

Jafari M. Transformation of Lactose Operon to Xanthomonas campestris DSM1706 with a Mini-Mu Derivative and Study Beta-Galatosidase Activity in