بررسی ژن‌های stx1، stx2 و eaeA به روش Multiplex PCR در اشریشیاکلی‌های جداسازی شده از گوشت گوسفندان استان چهارمحال و بختیاری

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری دامپزشکی، دانشگاه شهرکرد، ایران

2 دکتری دامپزشکی، دانشگاه شهرکرد، ایران،

3 دانشیار میکروبیولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، ایران

4 عضو دپارتمان بیماریهای عفونی وگرمسیری ، دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد، ایران،

5 دانشجوی دکتری دامپزشکی، دانشگاه شهرکرد، ایران،

چکیده

  مقدمه : عوامل بیماری‌زا ممکن است از طریق مصرف گوشت آلوده به انسان منتقل شوند و ایجاد بیماری کنن د. اشریشیاکلی ‌های تولید کننده‌ شیگاتوکسین می‌توانند ایجاد اسهال آبکی خفیف تا کمپلکس‌های جدی از قبیل کولیت هموراجیک و سندروم اورمی همولیتیک تا حتی مرگ نمایند . این مطالعه، به منظور ردیابی اشریشیاکلی ‌های تولید کننده‌ی شیگاتوکسین در گوشت گوسفندان استان چهارمحال و بختیاری انجام شد.   مواد و روش ‏‏ ها: 90 جدایه‌ی اشریشیاکلی از گوشت گوسفندان استان چهارمحال و بختیاری از نظر ژن‌های stx1 ، stx2 و eaeA به وسیله آزمون واکنش زنجیره ای پلی مراز چندگانه ( Multiplex PCR ) ارزیابی شدند .   نتایج: میزان ژن ‌های stx1 و eaeA در جدایه‌های اشریشیاکلی به ترتیب 1/11 درصد (10 از 90) و 8/8 درصد (8 از 90) بود. ژن stx2 در هیچ کدام از جدایه‌ها یافت نشد .   بحث و نتیجه ‏ گیری: گوشت گوسفندان در این منطقه اشریشیاکلی ‌های تولید کننده شیگاتوکسین را در خود جای داده بودند و می‌توانند عاملی در انتقال اشریشیاکلی‌های تولید کننده شیگاتوکسین از گوشت گوسفند به انسان تلقی شوند و برای سلامت انسان خطرناک باشند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Multiplex PCR detection of stx1, stx2 and eaeA genes in Escherichia coli isolated from lambs in ChaharmahalvaBakhtiari, Iran

نویسندگان [English]

  • Samaneh Mehrabiyan 1
  • Hossein Tahmasby 2
  • Hassan Momtaz 3
  • Naser Khosravi 4
  • Hossein Kaboli Boroujeni 1
  • Vida Najafzadeh 5
  • Marzieh Tadi Beni 1
  • Farnoush Ansari 5
1 DVM Student, University of Shahrekord, Iran
2 DVM, University of Shahrekord, Iran,
3 Associate Professor of Microbiology, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Iran
4 Member of Infectious Diseases & Tropical Medicine Department, Shahrekord University of Medical Sciences, Iran,
5 DVM Student, University of Shahrekord, Shahrekord, Iran,
چکیده [English]

  Introduction: Pathogens can be transmitted to the humans through the consumption of contaminated meat and thus causing disease. Shiga-toxin-producing Escherichia coli can cause mild watery diarrhea to more serious complications of hemorrhagic colitis, and hemolytic uremic syndrome to even death. Present study was conducted to detect Shiga toxin-producing Escherichia coli from sheep meat (lamb) in ChaharmahalvaBakhtiari, Iran .   Materials and methods: 90 Escherichia coli isolates from sheep meat in ChaharmahalvaBakhtiari were evaluated to investigate stx1, stx2 and eaeA genes by multiplex PCR .   Results: The rate of stx1 and eaeA-positive Escherichia coli isolates were 11.11% (10/90) and 8.88% (8/90), respectively. Stx2 gene was not found in any isolate .   Discussion and conclusion : Lamb harbored Shiga-toxin-producing E. coli and could be a component of Shiga-toxin-producing E. coli transmission from lambs to the humans and can pose a risk to human health in the region .

کلیدواژه‌ها [English]

  • Escherichia coli
  • Meat
  • PCR

مقدمه

حیواناتی که گوشت آن‏ها‏‏ برای مصارف غذایی استفاده می‏شوند، مهم‏‏ترین مخازن بسیاری از عوامل بیماری‌زا از قبیل کمپیلوباکتر، سالمونلا انتریکا، اشریشیاکلی‌های تولید کننده‌ی شیگاتوکسین و یرسینیا انتروهمولیتیکا هستند (1). رعایت نکردن بهداشت در هنگام ذبح و حمل و نقل گوشت این حیوانات می‌تواند به آلودگی آن‏ها‏‏ به عوامل بیماری‌زا منجر شود. این عوامل بیماری‌زا از طریق زنجیره‌ی غذایی ممکن است به انسان انتقال یابند و به ایجاد بیماری‌های ناشی از مواد غذایی در انسان منجر شوند (2).

اشریشیاکلی‌های تولیدکننده شیگاتوکسین در اواخر دهه 1970 درکانادا به عنوان یک عامل اتیولوژیک اسهال شناسایی شدند (3). سویه‌های اشریشیا کلی، وروتوکسیژنیک توکسینی ترشحمی‏کنندکهبهدلیلتواناییآندرکشتنسلول‌های ورو[1] وروتوکسینوبهدلیلشباهتشبهنوروتوکسینشیگایمترشحه ازشیگلا‏دیسانتریتیپ یک، توکسینشبهشیگا نامیدهمی‏شودو سویه‌های تولید کننده آن به اشریشیاکلی‌های تولید کننده‌ی شیگاتوکسین نیز معروفند (4). توکسین‌های ورو به دو گروه stx1 و stx2 تقسیم بندی می‏شوند. وروتوکسین با اثر بر RNA ریبوزومی سبب ممانعت از سنتز پروتئین‌ها می‌شود. انواعی از اشریشیا‏کلی که این سم را تولید می‏کنند موجب سندروم‌های خطرناکی از جمله کولیت هموراژیک و به دنبال آن نارسایی کلیوی به ویژه در کودکان و پورپورای ترمبوتیک ترمبوسایتوپنیک در انسان می‏شوند (5- 7).

ازدیگرعواملبیماریزایاینسویه‌ها،پروتئینیبهناماینتیمین[2] استکهمسئولاتصالباکتریبهرودهوایجادآسیب‌های خاصیبهناماتصالومحوشدن درسلول‌هایاپیتلیالروده است. بههمیندلیلبهژنکدکنندهاینپروتئین eae[3] می‌گویند (8).

تحقیقات نشان می‌دهد سویه‌های تولیدکننده شیگاتوکسین در چهارپایان نیز وجود داشته که 40 درصد آن‏ها‏‏ برای انسان بیماری‌زا شناخته شده اند. این مسئله چهارپایان را به عنوان مخزن مهم برای سویه‌ها مطرح می‌سازد (9).

بروز کلینیکی عفونت با اشریشیاکلی‌های شیگاتوکسین‌زا می‌تواند از اسهال آبکی خفیف تا کمپلکس‌های جدی از قبیل کولیت هموراجیک و سندروم اورمی همولیتیک تا حتی مرگ باشد (10 و 11). اگرچه سروتیپ O157 اشریشیاکلی معمول‏ترین سروتیپ تولید کننده‌ شیگاتوکسین است اما نشان داده شده که بیش از 250 سروتیپ مختلف از آنتی ژن O، شیگاتوکسین تولید می‌کنند و بیش از 100 عدد از آن‏ها‏‏ با بیماری‌های انسانی مرتبط اند (12). سایر سروتیپ‌های شیگاتوکسین‌زای اشریشیاکلی (غیر از O157) عامل ایجاد 60 درصد از عفونت‌های اشریشیاکلی شیگاتوکسین‌زا هستند و در بسیاری از نقاط دنیا از قبیل آرژانتین، استرالیا، اسپانیا، دانمارک، شیلی و آلمان شایع هستند (12).

بیشتر مطالعاتی که در زمینه بررسی آلودگی گوشت‌های مختلف از نظر آلودگی به ژن‌های حدت اشریشیاکلی در نقاط مختلف انجام شده است نشان دهنده‌ وضعیت متفاوت آلودگی به این ژن‌ها از مقادیر پایین تا بالا در مناطق مختلف بوده است. برای مثال طی مطالعاتی که در سال‌های اخیر در کره، ایتالیا و آرژانتین انجام شده، میزان آلودگی به اشریشیاکلی شیگاتوکسین‌زا به ترتیب 6/2، 4/43 و 87 گزارش شده است (13- 15). متاسفانه در کشور ما تنها در یک مطالعه به بررسی سایر سروتیپ‌های تولید کننده‌ شیگاتوکسین (غیر از O157) که عامل ایجاد 60 درصد از عفونت‌های اشریشیاکلی شیگاتوکسین‌زا هستند پرداخته شده است (16) و بیشتر مطالعات انجام شده روی ردیابی ژن‌های تولید کننده شیگاتوکسین در اشریشیاکلی O157:H7 محدود بوده است (17- 21).

در مطالعه‌ حاضر، با توجه به توانایی بالقوه‌ گوشت در انتقال عوامل بیماری‌زا به انسان و با در نظر گرفتن اهمیت بیماری‌زایی ژن‌های stx1، stx2 و eaeA، به جست و جوی این ژن‌ها در اشریشیاکلی‌های جداسازی شده از نمونه‌های گوشت گوسفندان استان چهارمحال و بختیاری به روش MultiplexPCR پرداخته شد.

 

مواد و روش‏ها‏

در این مطالعه، از 270 نمونه گوشت گوسفند در پاییز و زمستان سال 1389 در شرایط استریل نمونه گیری انجام شد. برای جستجوی اشریشیاکلی 25 گرم از هر نمونه به شکل هموژن شده به 225 میلی‏‏لیتر آبگوشت تریپتون سوی[4] (مرک، ساخت آلمان) اضافه شد و به مدت 18 تا 24 ساعت در 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند. سپس، 100 میکرولیتر از نمونه غنی شده بر روی محیط مکانیکی آگار (مرک، ساخت آلمان) به منظور ردیابی اشریشیاکلی کشت داده شد و به مدت 18 تا 24 ساعت در 37 درجه سانتی‏گراد گرم خانه گذاری شد. پرگنه‌های مشکوک روی محیط آبگوشت تریپتون سوی کشت داده شدند و آزمون‏های اندول، متیل رد، وگس پروسکوئر و سیترات (IMViC) بر روی نمونه‌های مشکوک انجام شد. جدایه‌های اشریشیاکلی تا زمان انجام PCR در محیط آبگوشت تریپتون سوی به شکل گلیسیرینه در دمای منفی 20 درجه سانتی‏گراد نگه داری شدند.

جدایه‌های اشریشیاکلی پس از استخراج DNA، به وسیله‌ PCR با استفاده از پرایمرهای توصیف شده توسط ویدال[5] و همکاران (22) آزمایش شدند. (جدول 1). مواد PCR از شرکت سیناژن ساخت ایران تهیه شد و واکنش در حجم 25 میکرولیتر (5/2 میکرولیتر بافر10XPCR، 5/1 میکرولیتر MgCl2 50 میلی‏مولار، 5/0 میکرولیتر dNTP 10 میلی‏مولار، 5/1 واحد آنزیم Taq پلی مراز، 5/0 میکرولیتر با غلظت 10 میکرومولار از هر پرایمر، 1 میکرولیتر DNA الگو) انجام شد. برنامه دمایی مورد استفاده به ترتیب واسرشت ابتدایی در 94 درجه سانتی‏گراد به مدت 5 دقیقه و 40 سیکل از قرار 94 درجه به مدت 45 ثانیه، 64 درجه به مدت 45 ثانیه، 72 درجه به مدت 60 ثانیه و گسترش نهایی در 72 درجه به مدت 5 دقیقه در دستگاه ترموسایکلر (بایورد، ساخت آمریکا) انجام شد. در پایان، محصولات PCR روی ژل آگاروز (ساخت سیناژن، ایران) 5/1 درصد الکتروفورز (بایورد، ساخت آمریکا) شد.

 

 

جدول 1- مشخصات پرایمرهای مورد استفاده

نام پرایمرها

توالی پرایمرها

اندازه محصول

stx1

F: 5´ CAG TTA ATG TGG TGG CGA AGG 3´

R: 5´ CAC CAG ACA ATG TAA CCG CTG 3´

348 bp

stx2

F: 5´ ATC CTA TTC CCG GGA GTT TAC G 3´

R: 5´ GCG TCA TCG TAT ACA CAG GAG C 3´

584 bp

eaeA

F: 5´ TCA ATG CAG TTC CGT TAT CAG TT 3´

R: 5´ GTA AAG TCC GTT ACC CCA ACC TG 3´

482 bp

 


 

 

نتایج

میزان آلودگی نمونه‌های مورد مطالعه به اشریشیاکلی در کل 3/33 درصد (90 از 270) بود. میزان ژن‌های stx1 و eaeA در جدایه‌های اشریشیاکلی به به ترتیب 1/11 (10 از 90) و 8/8 درصد (8 از 90) بود. ژن stx2 در هیچ کدام از جدایه‌ها یافت نشد. جدایه‌های اشریشیاکلی که واجد ژن stx1 بودند هیچ کدام حامل ژن eaeA نبودند (شکل1)

اگرچه میزان آلودگی به اشریشیاکلی در فصل زمستان از فصل پاییز بیشتر بود اما هیچ‌کدام از آن‏ها‏‏ واجد ژن‌های کد کننده‌ی شیگاتوکسین (stx1وstx2) نبودند (جدول2).

 

 

 

.

شکل 1- تصویر الکتروفورز ژل آگاروز. M: نشانگر‏‏100 جفت بازی پلاس، NC: کنترل منفی، PC: کنترل مثبت، 1 تا 3: نمونه‌های مثبت از نظر آلودگی به ژن stx1، 4 تا 6: نمونه‌های مثبت از نظر آلودگی به ژن eaeA

 

 

جدول2- مشخصات نمونه‌های آزمایش شده

فصل نمونه‏گیری

تعداد نمونه‌ها

آلودگی به اشریشیاکلی

stx1

درصد

stx2

درصد

Eae

درصد

eae و stx1

پاییز

206

65  (5/31 درصد)

10 (4/15 درصد)

صفر

8 (3/12 درصد)

صفر

زمستان

64

25 (39 درصد)

صفر

صفر

صفر

صفر

کل

270

90 (3/33 درصد)

10 (1/11 درصد)

صفر

8 (8/8 درصد)

صفر

 


بحث و نتیجه گیری

هرچند اشریشیاکلی‌های تولید کننده‌ شیگاتوکسین در روده‌ بسیاری از گونه‌های حیوانی یافت می‌شوند، اما نشخوارکنندگان به عنوان مخزن اصلی آن‏ها‏‏ محسوب می‌شوند و ممکن است از طریق این حیوانات به انسان منتقل شوند. شنا کردن در آب‌های آلوده به مدفوع این حیوانات، نوشیدن آب از منابعی از قبیل: چشمه‌ها و چاه‌های آلوده که بیشتر در روستاها استفاده می‌شوند، از عوامل بسیار مهم آلودگی تلقی می‌شوند. منبع عفونت می‏‏تواند آغشته شدن به گل و لای آلوده به مدفوع گاو و تماس مستقیم با حیوان باشد. البته راه انتقال این عوامل به انسان فقط محدود به تماس با حیوانات آلوده به اشریشیاکلی‌های تولید کننده‌ شیگاتوکسین و همچنین محیطی که حیوانات آلوده در آن زندگی می‌کنند نمی‌شود، بلکه استفاده از غذاهای آلوده به مدفوع این حیوانات در آلوده شدن به اشریشیاکلی‌های تولید کننده‌ شیگاتوکسین می‌تواند بسیار موثر باشد. عادت‏های غذایی از قبیل مصرف گوشت‌های نیم‌پز و خام و لبنیات غیرپاستوزیره که با زندگی روستایی ارتباط نزدیکی دارند را نیز به عنوان عوامل موثر در ابتلای به این عوامل می‌توان ذکر کرد (23-25). رعایت نکردن بهداشت کافی در هنگام ذبح و حمل و نقل گوشت می‌تواند به آلودگی آن‏ها‏‏ به عوامل بیماری‌زا  منجر شود. این عوامل بیماری‌زا از طریق زنجیره‌ی غذایی ممکن است به انسان انتقال یابند و به ایجاد بیماری‌های ناشی از مواد غذایی در انسان منجر شوند (2).

غیر از سروتیپ اشریشیاکلی O157، سایر سروتیپ‌های تولید کننده‌ی شیگاتوکسین عامل ایجاد 60 درصد از عفونت‌های اشریشیاکلی شیگاتوکسین‌زا و در بسیاری از نقاط دنیا از قبیل آرژانتین، استرالیا، اسپانیا، دانمارک، شیلی و آلمان شایع هستند (12).

مطالعاتی که در مناطق مختلف دنیا در مورد بررسی آلودگی به ژن‌های حدت اشریشیاکلی در نقاط مختلف انجام شده است نشان دهنده‌ وضعیت متفاوت آلودگی به این ژن‌ها از مقادیر پایین تا بالا بوده است. برای مثال طی مطالعاتی که در کره (2012)، ایتالیا (2012) و آرژانتین (2011) انجام شده، میزان آلودگی به اشریشیاکلی شیگاتوکسین‌زا به ترتیب 6/2، 4/43 و 87 گزارش شده است (13-15). گزارشات متعددی نیز وجود دارند که از نظر آلودگی به اشریشیاکلی‌های تولید کننده‌ شیگاتوکسین از جهاتی تشابه زیادی با مطالعه‌ی حاضر دارند. در مطالعه اوجو[vi] و همکاران در نیجریه میزان آلودگی به اشریشیاکلی‌های واجد ژن stx1، 11 درصد گزارش شد که از این نظر با مطالعه‌ حاضر تشابه داشت. اما خلاف این مطالعه‌ی که ژن stx2 در هیچ کدام از جدایه‌ها یافت نشد، 3/25 درصد از جدایه‌ها واجد ژن‌های stx2 بودند و درصد بالایی نیز (5/56 درصد) دارای ژن eaeA بودند (26). در مطالعه بروک[vii] و همکاران در نیوزیلند میزان آلودگی به اشریشیاکلی‌های تولید کننده‌ی شیگاتوکسین در گوشت گاو 12 درصد گزارش شد که با نتایج مطالعه‌ی حاضر تشابه زیادی داشت، اما خلاف مطالعه‌ی حاضر که 88/8 درصد از جدایه‌ها واجد ژن eaeA بودند، در هیچ کدام از جدایه‌ها این ژن یافت نشد (27). در مطالعه اتچوریا[viii] و همکاران در آرژانتین روی گوشت گاو، اشریشیاکلی‌های تولید کننده‌ی شیگاتوکسین در 34/12 درصد از موارد یافت شدند که با نتایج مطالعه‌ی حاضر مشابهت زیادی داشت، اما خلاف مطالعه‌ی حاضر که ژن stx2 در هیچ کدام از جدایه‌ها یافت نشد، ژن stx2 ژن به عنوان ژن غالب در جدایه‌ها یافت شد (28).

همان‏طور که ذکر شد در کشورمان به وضعیت آلودگی گوشت به اشریشیاکلی‌های تولید کننده‌ شیگاتوکسین و نقش آن‏ها‏‏ در انتقال این عامل بیماری‌زا به انسان چندان توجهی نشده است و وضعیت آلودگی به این عوامل بیماری‌زا چندان واضح نیست و بیشتر مطالعات انجام شده در کشور محدود به بررسی ژن‌های مولد شیگاتوکسین در جدایه‌های اشریشیاکلی O157:H7 بوده است (17-21) و تنها در یک مطالعه روی نمونه‌های گوشت جمع آوری شده از تهران به بررسی اشریشیاکلی‌های مولد شیگاتوکسین (غیر از O157) که عامل ایجاد 60 درصد از عفونت‌های اشریشیاکلی شیگاتوکسین‌زا هستند پرداخته شده است. در این مطالعه، درصد آلودگی به اشریشیاکلی‌های تولید کننده شیگاتوگسین به میزان چشمگیری بالا بوده به نحوی که 24 (80 درصد) جدایه دارای ژن stx2، دو جدایه (7/6 درصد) هم ژن stx2 و هم stx1 را داشته و 4 (3/13 درصد) جدایه دارای stx2 و eae مثبت بودند (16).

نتایج این مطالعه نشان داد که گوشت گوسفندان این منطقه با اشریشیاکلی‌های تولید کننده‌ شیگاتوکسین می‌توانند آلوده شوند و می‌توانند حامل و عاملی در انتقال اشریشیاکلی‌های تولید کننده شیگاتوکسین از گوشت گوسفند به انسان تلقی شوند و برای سلامت انسان ایجاد خطر نمایند.

همچنین با توجه به نتایج به نظر می‌رسد ژن stx2در این منطقه چندان شایع نیست که ممکن است بیانگر این مسئله باشد که ژن stx2 در ایجاد اسهال‌های با منشا مواد غذایی به ویژه گوشت گوسفند در این منطقه چندان نقشی ندارد.

ممکن است گوشت گوسفندان این منطقه، حامل عوامل بیماری‌زای دیگری نیز باشند که در این مطالعه بررسی نشده است بنابراین، بررسی‌های بیشتر در این زمینه توصیه می‏شود.

 

 

 

 

 



[1]. vero

[2]. intimin

[3]. E. coli attaching and effacing (eae)

[4]. Tryptic Soy Broth (TSB)

[5]. Vidal

[vi]. Ojo

[vii]. Brook

[viii]. Etcheverría