بررسی اثر کاربنوکسولون در کاهش شدت التهاب ناشی از لیپو‏پلی‏ساکارید سالمونلا انتریکا در موش آزمایشگاهی

نویسندگان

1 دانشیار میکروب شناسی، دانشگاه علوم پزشکی ارومیه، ایران

2 کارشناس ارشد میکروب شناسی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد زنجان، ایران

3 دانشیار ایمنی شناسی، دانشگاه علوم پزشکی ارومیه،‏ ایران

4 دانشیار آسیب‏شناسی، دانشگاه علوم پزشکی ارومیه،‏ ایران

5 پزشک عمومی، دانشگاه علوم پزشکی ارومیه،‏ ایران

چکیده

مقدمه: پروتئین‏های شوک حرارتی تولید سایتوکاین‏های پیش برنده التهاب را مهار می‏کنند. کاربنوکسولون القا کننده پروتئین‏های شوک حرارتی به شمار می‏آید. هدف از این پژوهش، بررسی اثر تجویز این دارو در کاهش شدت التهاب ناشی از تجویز لیپو پلی ساکارید در موش است‏.
مواد و روش‏‏ها: ابتدا دوز کشنده 80 درصد‏ لیپو پلی ساکارید در موش تعیین و سپس دوز مناسب دارو به منظور کاهش میزان مرگ و میر مشخص شد. در نهایت دارو به همراه لیپو پلی ساکارید در گروه‏های متفاوت با زمان بندی متفاوت تزریق شد‏. پس‏‏ از 24 ساعت میزان مرگ و میر محاسبه و کلیه، کبد، طحال، ریه و روده ‏موش‏های زنده از نظر شدت نکروز بررسی شد‏. در هر گروه سه ساعت پس از تزریق، مقادیر عامل‏‏ نکروز توموری سرمی تعیین شد.
نتایج: تجویز دارو همزمان با لیپو پلی ساکارید میزان مرگ در موش‏ها را از 80 به 20 درصد‏ کاهش داد. شدت نکروز در کبد ‏وکلیه گروه‏های دریافت کننده دارو نسبت به کنترل مثبت، کمتر بود. همچنین در گروه دریافت کننده لیپوپلی ساکارید،‏ سطح سرمی عامل‏‏ نکروز توموری آلفا نسبت به گروه کنترل افزایش معنی دار یافت
(032/0P value =)؛ ولی در گروه‏های دریافت کننده دارونسبت به گروه کنترل معنی دار نبود.
بحث و نتیجهگیری: تزریق داروی کاربنوکسولون دی سدیم سالت باعث کاهش التهاب و آسیب ناشی از شوک آندوتوکسیک می‏شود‏.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Investigation of the effect of Carbenoxolone in reduction of inflammation severity induced by Salmonella enterica LPS in a mouse model

نویسندگان [English]

  • Nima Hosseini Jazani 1
  • Mina Mehdi Shishavan 2
  • Shahram Shahabi 3
  • Behrouz Ilkhanizadeh 4
  • Babak Mansourafshar 5
1 Associate Professor of Microbiology, Urmia University of Medical Sciences, Iran
2 M.Sc of Microbiology, Islamic Azad University, Zanjan, Iran
3 Associate Professor of Immunology, Urmia University of Medical Sciences, Iran
4 Associate Professor of Pathology, Urmia University of Medical Sciences, Iran
5 MD., Urmia University of Medical Sciences, Iran
چکیده [English]

Introduction: Heat shock proteins (HSPs) inhibit production of pro- inflammatory cytokines. Carbenoxolone is regarded to induce the production of HSPs. The aim of this study was the evaluation of the effect of Carbenoxolone in reduction of the severity of systemic inflammation induced by LPS in a murine model.
Materials and methods: %80 lethal dose of LPS was determined in balb/C mice, also appropriate dose of drug for efficient reduction in mortality was determined. LPS+D-GalN with drug were injected to different groups, in different times, after 24 hours the mortality rate was calculated and the severity of necrosis measured in the kidney and livers of the survived mice. After 3 hours serum samples were collected and the concentrations of TNF-α were measured in each group.
Results: Administration of Carbenoxolone with LPS reduced the lethality rate from 80 to %20. The severity of necrosis in the liver and kidney of drug administrated groups decreased significantly in comparison with the positive control group. The concentration of TNF-α in mice received LPS increased significantly in comparison with the control group (P=0.032), but in drug received groups no significant differences were seen with respect to the control.
Discussion and conclusion: Carbenoxolone significantly reduced the severity and damage due to endotoxic shock.

کلیدواژه‌ها [English]

  • LPS
  • Carbenoxolone disodium salt
  • TNF-α
  • Inflammation

مقدمه

سالمونلا تیفی موریوم باسیل گرم منفی است که در جنس سالمونلا و خانواده انتروباکتریاسه قرار می‏گیرد. این باکتری عامل ایجاد کننده عفونت‏های روده ای یا خارج روده ای در انسان، دام‏ها و پرندگان است (1). انتقال عفونت‏های ناشی از سالمونلا تیفی موریوم بیشتر به دنبال مصرف مواد غذایی و آشامیدنی اتفاق می‏افتد. ‏مهم‏ترین عامل بیماری زایی این باکتری، لیپو‏پلی‏ساکارید آن است (‏‏2). حضور لیپوپلی ساکارید باکتری‏های گرم منفی در جریان خون، ‏ترشح سیتوکین‏های پیش برنده التهاب از جمله عامل‏‏ نکروز توموری آلفا را به دنبال دارد. ترشح سیستمیک عامل‏‏ نکروز توموری آلفا موجب اتساع عروق و کاهش حجم پلاسما، افزایش نفوذپذیری عروقی، شوک و انعقاد منتشر داخل عروقی می‏شود. شوک آندوتوکسیک، نیز توسط عامل‏‏ نکروز توموری آلفا آغاز شده و موجب نارسایی اندام‏های حیاتی مانند کلیه‏ها، کبد، قلب و ریه‏ها می‏شود. بنا به دلایل ذکر شده، شوک آندوتوکسیک دارای میزان مرگ و میر بالایی است (‏‏3- 5).

مطالعات مختلف نشان داده است که در صورت القا‏‏ سنتز پروتئین‏های شوک حرارتی در درون سلول‏ها، این سلول‏ها به مواجه بعدی با لیپو پلی ساکارید مقاوم می‏شوند. به عبارت دیگر، این نوع سلول‏ها مقادیر بسیار کمتری از عامل‏‏ نکروز توموری آلفا و سایر سیتوکین‏های پیش برنده التهاب را آزاد خواهند کرد. بنابراین، کشف ترکیباتی که از نظر بالینی بدون خطر بوده و قادر به تحریک تولید پروتئین‏های شوک حرارتی هستند، می‏تواند از نظر درمان شوک آندوتوکسیک مفید باشد. از طرف دیگر، پروتئین‏های شوک حرارتی واسطه‏های تعدیل کننده ‏پاسخ‏های ایمنی و التهابی‏اند. افزایش میزان پروتئین‏های شوک حرارتی در داخل سلول‏ها، تحمل سلول‏ها را نسبت به سایتوکاین‏های پیش برنده التهاب مانند عامل‏‏ نکروز توموری آلفا و اینترلوکین یک بهبود می‏بخشد. انباشته شدن پروتئین‏های شوک حرارتی در درون سلول، مهار رونویسی و کاهش ترشح ‏عامل‏‏ نکروز توموری آلفا و ‏اینترلوکین یک را موجب می‏شود (‏‏6).

کاربنوکسولون دی سدیم سالت، ترکیب گلوکوکورتیکوئیدی دارویی و بخش اصلی و فعال ریشه شیرین بیان است. شیرین بیان، گیاه چند ساله بومی ناحیه مدیترانه ای، از مرکز تا جنوب روسیه و آسیای صغیر تا ایران است که امروزه به شکل گسترده ای در سراسر اروپا، خاورمیانه و آسیا کشت می‏شود (‏‏7).کاربنوکسولونامروزه در درمان زخم‏ها استفاده می‏شود (‏‏8) و دارای اثر ضد تشنج، آرام بخش و آرام کننده ماهیچه‏ها در موش است (9). این دارو دارای اثرات ضد التهابی (‏‏10و 11)، ‏‏آنتی اکسیدانی (‏‏12) و محافظت بخش کبدی[1] ‏است‏ (‏‏13). همچنین، این دارو بیان ژن و پروتئین شوک حرارتی 70 "[2]HSP70" را افزایش می‏دهد. القا‏‏ پروتئین‏های شوک حرارتی به دنبال تجویز کاربنوکسولون به غلظت دارو و رده سلولی مورد استفاده بستگی دارد. اگرچه هدف مستقیم کاربنوکسولون معلوم نیست ولی احتمال دارد القا‏‏ استرس اکسیداتیو در میتوکندری‏ها به‏وسیله‏‏ کاربنوکسولون، به افزایش بیان پروتئین‏های شوک حرارتی منجر شود (‏‏14). در حال حاضر، استراتژی‏های درمانی برای درمان شوک آندوتوکسیک شامل کمک به خنثی‏سازی‏‏ لیپو پلی ساکارید یا سایتوکاین‏های القا‏‏ شده به‏وسیله‏‏ آن است. مطالعات نشان می‏دهد که خنثی‏سازی‏‏ سایتوکاین‏های پیش برنده التهاب مانند ‏عامل‏‏ نکروز توموری آلفا و اینترلوکین یک،‏ مرگ و میر ناشی از عفونت خون با باکتری‏های گرم منفی را در مدل‏های حیوانی مختلف کاهش می‏دهد (‏‏15). همچنین نشان داده شده است که پروتئین‏های شوک حرارتی به طور معنی داری تولید سایتوکاین‏های القا‏‏ شده به وسیله لیپو پلی ساکارید را مهار می‏کنند (‏‏16). ‏هدف از این پژوهش، بررسی اثر تجویز داروی کاربنوکسولون دی سدیم سالت در کاهش شدت التهاب عمومی ناشی از لیپو پلی ساکارید سالمونلا تیفی موریوم در موش آزمایشگاهی است‏.

 

مواد و روش‏ها

روش تعیین دوز کشنده لیپوپلی ساکارید در تجویز همزمان با د-گالاکتوز آمین هیدروکلراید

 برای مشخص کردن دوز کشنده لیپو پلی ساکارید، به مظور حساس نمودن موش‏ها نسبت به این ماده، لیپو‏پلی‏ساکارید سالمونلا انتریکا، سروتایپ تیفی موریوم[3](LPS L6511) (Sigma Aldrich)در همراهی با د- گالاکتوزآمین هیدروکلراید (‏‏Merck) تجویز شد. برای این منظور 20 سر موش BALB/c جنس ماده، 6 الی 8 هفته ایی به وزن‏های 18 تا 25 گرم، در چهار گروه تقسیم شدند. گروه اول، دوم، ‏‏سوم وچهارم ‏به ترتیب با محلول رینگر لاکتات حاوی لیپوپلی ساکارید به میزان ‏50 و 5 میکروگرم به کیلوگرم وزن بدن و7 میکروگرم/ موش وبه ترتیب درهمراهی با
‏د- گالاکتوزآمین به میزان 400 ‏میلی‏‏گرم به کیلوگرم ویا ‏18، ‏‏18 و15 میلی‏‏گرم/ موش ازاین ماده به طریقه داخل وریدی از ورید دم موش تزریق شدند (‏‏17).

در همه گروه‏ها پس‏‏ از گذشت 24 ساعت، درصد مرگ و میر محاسبه و بهترین دوز کشنده برای انجام آزمایش‏های ‏‏بعدی مشخص شد (‏‏18).

روش تعیین دوز مناسب داروی کاربنوکسولون دی سدیم سالت

برای مشخص کردن دوز مناسب داروی کاربنوکسولون دی سدیم سالت، 15 سر موش BALB/c جنس ماده، 6 الی 8 هفته‏ایی در محدوده وزنی 18 تا 25 گرم به سه گروه تقسیم شدند. به تمام گروه‏ها محلول رینگر لاکتات حاوی لیپو پلی ساکارید به میزان 7 میکروگرم به هر موش و د- گالاکتوز آمین به میزان 18 میلی‏‏گرم به هر موش به عنوان بهترین دوز کشنده لیپوپلی ساکارید ود-گالاکتوز آمین به طور هم زمان، همراه با به ترتیب غلظت‏های 10 (‏‏گروه اول)، 20 (‏‏گروه دوم) و30 (‏‏گروه سوم) ‏میلی‏‏گرم به کیلوگرم وزن بدن از داروی کاربنوکسولون دی سدیم سالت از طریق ورید دم موش تزریق شد. درهمه گروه‏ها پس‏‏ از 24 ساعت درصد مرگ ومیر محاسبه شد و دوز مناسب دارو به عنوان دوزی که تجویز آن باعث بیش‏ترین کاهش در میزان مرگ و میر ناشی از تجویز لیپو پلی ساکارید و د- گالاکتوز آمین در موش‏ها می‏شود، انتخاب شد (‏‏19 و 20).

 زمان بندی تزریق دارو

‏برای تعیین زمان مناسب مصرف دارو، 60 سر موش BALB/c جنس ماده، 6 الی 8 هفته ای به وزن 18 تا 25 گرم به 6 گروه ده تایی تقسیم و طبق برنامه زمانی ارائه شده در جدول 1 تزریق شدند.

 

 

 

 

جدول 1- زمان بندی تزریق لیپوپلی ساکارید- د-گالاکتوزآمین وکاربنوکسولون دی سدیم سالت در گروه‏های مختلف

 

زمان بندی تزریق

مقدار لیپوپلی‏ساکارید دریافتی

µg/mouse

مقدار

د-‏گالاکتوز آمین دریافتیmg/mouse

مقدار کاربنوکسولون دی سدیم سالت دریافتی mg/Kg

نام‏گزاری گروه

1

تجویز لیپوپلی ساکارید ودگالاکتوز آمین در بافر رینگر لاکتات و به شکل‏‏ همزمان به طریقه داخل وریدی انجام شد.

7

18

-

LPS

2

تجویز لیپوپلی ساکارید، د-گالاکتوز آمین وکاربنوکسولون در بافر رینگر لاکتات به طور همزمان به طریقه داخل وریدی انجام شد.

7

18

20

LPSCarb

3

ابتدا داروی کاربنوکسولون وپس از 6 ساعت لیپوپلی ساکارید همراه با د-گالاکتوز آمین دربافر رینگر لاکتات به طریقه داخل وریدی تجویز شد.

7

18

20

Carb6LPS

4

ابتدا لیپوپلی ساکارید ود- گالاکتوز آمین وپس از 1 ساعت داروی کاربنوکسولون در بافر رینگر لاکتات به طریقه داخل وریدی تجویز شد.

7

18

20

LPS1Carb

5

ابتدا لیپوپلی ساکارید ود- گالاکتوز آمین به طریقه داخل وریدی وپس از یک ساعت داروی کاربنوکسولون در بافر رینگر لاکتات به طریقه داخل صفاقی تجویز شد.

7

18

20

LPS1Carbi.p.

6

فقط محلول رینگر لاکتات به طریقه داخل وریدی تجویز شد.

-

-

-

Control

 

 

در موارد تزریق داخل وریدی کلیه تزریق‏ها از طریق ورید دم انجام شد. حجم بافر رینگر لاکتات تزریق شده درتمام موش‏ها 200 میکرولیتر است.

پس‏‏از گذشت 24 ساعت، درصد مرگ ومیر در گروه‏ها محاسبه و کبد،‏ طحال، کلیه، ریه و روده موش‏های زنده استخراج شد‏ (‏‏19). به منظور بررسی شدت آسیب بافتی، از محل ضایعه همراه با قسمت سالم بافت‏های ذکر شده ، برش‏های بافتی تهیه و با روش هماتوکسیلین وائوزین رنگ آمیزی شد. برای درجه بندی شدت نکروز بافتی در کبد از اعداد صفر تا 4 استفاده شد. عدد صفر نشان دهنده فقدان آسیب بافتی یا نکروز[4] ، عدد یک نشانگر نکروز خفیف در برخی نقاط[5]، عدد دو نکروز ضعیف[6] ، عدد سه بیانگر شدت نکروز متوسط[7] و عدد چهار نشانگر نکروز شدید[8] است (‏‏21). در مورد سایر بافت‏ها درجه بندی استاندارد وجود ندارد.

تهیه سرم برای‏‏ سنجش عامل‏‏ نکروز توموری آلفا

‏30 سر موش BALB/c جنس ماده، 6 الی 8 هفته ای به وزن 18 تا 25 گرم به 6 گروه پنج تایی تقسیم شده و طبق زمان‏بندی ذکر شده، دوباره تزریق شدند. درهرگروه ‏سه ساعت پس ازتزریق، نمونه‏های سرم جمع‏آوری شده و مقادیر عامل‏‏ نکروز توموری آلفا بااستفاده ازکیتELISA طبق دستورالعمل شرکت سازنده (R&D System) سنجش شد. به منظور مقایسه نتایج بین گروه‏ها از آزمون تحلیل واریانسANOVA،‏ ‏نرم افزار SPSS ‏و آزمون مقایسه چند گانه Tukey ‏استفاده شد.

نتایج

نتایج تعیین دوز کشنده لیپو پلی ساکارید و
د- گالاکتوزآمین
هیدروکلراید

‏نتایج مربوط به تعیین بالاترین دوز کشنده لیپوپلی‏ساکارید همراه با د- گالاکتوز آمین با تجویز چهاردوز مختلف در چهار گروه پنج تایی از موش‏های Balb/c ‏تحت تزریق مشخص شد‏. ‏همچنان که شکل 1 نشان می‏هد، بالاترین میزان مرگ ومیر در گروهی از موش‏ها که 7 میکروگرم لیپو پلی ساکارید همراه با 18 میلی‏‏گرم د- گالاکتوز آمین را دریافت نموده بودند، مشاهده شد. بنابراین، این دوز به عنوان بهترین دوز تجویز لیپو پلی ساکارید / د- گالاکتوزآمین تعیین و برای بررسی اثر تجویز داروی کاربنوکسولون متعاقب تجویز لیپو پلی ساکارید / د- گالاکتوز آمین استفاده شد.

شکل ا- نمودارتعیین دوز کشنده لیپو پلی ساکارید و
 د- گالاکتوزآمینهیدروکلراید

 

حداکثر میزان مرگ ومیر در گروه سوم (‏‏‏‏گروهی که 7 میکروگرم لیپو پلی ساکارید و18 میلی‏‏گرم/موش
 د-گالاکتوز آمین دریافت نمود)‏‏ ایجاد شد. درگروه اول، دوم و چهارم میزان مرگ ومیر به ترتیب صفر، 50 و66 درصد بود.

نتایج تعیین دوز مناسب داروی کاربنوکسولون
 دی سدیم سالت

نتایج مربوط به تعیین دوز مناسب داروی کاربنوکسولون با تجویز سه دوز مختلف از داروی کاربنوکسولون در سه گروه پنج تایی نشان داد که در گروه دوم میزان مرگ و میر از80 به 20 درصد کاهش یافت (60 درصد کاهش). این گروه تزریق سه ماده لیپو پلی ساکارید به میزان ‏7 میکروگرم و د- گالاکتوز آمین به میزان 18 میلی‏‏گرم به هر موش و کاربنوکسولون به مقدار 20 میلی‏‏گرم به کیلو گرم را دریافت نمود. بنابراین، دوز مناسب داروی کاربنوکسولون برای انجام آزمایش‏های بعدی 20 میلی‏‏گرم/کیلوگرم مشخص شد (شکل 2).

 

شکل 2- نمودار نتایج تعیین دوز مناسب داروی کاربنوکسولون دی سدیم سالت.

 

گروه اول ‏دوز کشنده 80 درصد ‏لیپوپلی ساکارید- دگالاکتوز آمین دارو را دریافت نموده است. گروه‏های دوم و سوم و چهارم ‏به ترتیب 10، 20 و30 میلی‏‏گرم/ کیلوگرم از داروی کاربنوکسولون دی سدیم سالت را متعاقب تجویز دوز 80 درصد کشنده لیپوپلی ساکارید- دگالاکتوز آمین دریافت نمودند. ‏حداکثر میزان افزایش بقاء در گروه سوم (‏‏گروهی که 20 میلی‏‏گرم/ کیلوگرم از داروی کاربنوکسولون دی سدیم سالت را متعاقب تجویز دوز 80 درصد ‏ کشنده لیپوپلی ساکارید- دگالاکتوز آمین دریافت نمود) مشاهده شد.

نتایج تزریق دوز مناسب داروی کاربنوکسولون دی سدیم سالت در زمان‏های مختلف

همچنان که با مراجعه به جدول 2 مشخص می‏شود، تجویز داروی کاربنوکسولون دی سدیم سالت بهترین اثر را هنگامی داشته است که هم زمان با لیپو پلی ساکارید و د- گالاکتوز آمین تزریق شود. همچنین هنگامی که داروی کاربنوکسولون با دوز 20 میلی‏‏گرم/کیلوگرم یک ساعت پس‏‏ از تجویز 7 میکروگرم لیپو پلی ساکارید و 18 میلی‏‏گرم/موش
د- گالاکتوز آمین به طریقه داخل صفاقی تجویز شود، نتیجه مطلوبی می‏دهد.

 

 

جدول 2- نتایج تزریق دوز مناسب داروی کاربنوکسولون دی سدیم سالت در زمان‏های مختلف

 

زمان بندی تزریق

نام‏گزاری گروه

درصد مرگ ومیر پس‏‏ از 24 ساعت

1

تجویز لیپوپلی ساکارید ودگالاکتوز آمین در بافر رینگر لاکتات وبه شکل‏‏ همزمان به طریقه داخل وریدی انجام شد.

LPS

80

2

تجویز لیپوپلی ساکارید، د-گالاکتوز آمین وکاربنوکسولون در بافر رینگر لاکتات به طور همزمان به طریقه داخل وریدی انجام شد.

LPSCarb

20

3

ابتدا داروی کاربنوکسولون وپس از 6 ساعت لیپوپلی ساکارید همراه با د-گالاکتوز آمین دربافر رینگر لاکتات به طریقه داخل وریدی تجویز شد.

Carb6LPS

70

4

ابتدا لیپوپلی ساکارید ود- گالاکتوز آمین وپس از 1 ساعت داروی کاربنوکسولون در بافر رینگر لاکتات به طریقه داخل وریدی تجویز شد.

LPS1Carb

90

5

ابتدا لیپوپلی ساکارید ود- گالاکتوز آمین به طریقه داخل وریدی وپس از یک ساعت داروی کاربنوکسولون در بافر رینگر لاکتات به طریقه داخل صفاقی تجویز شد.

LPS1Carbi.p.

50

6

فقط با محلول رینگر لاکتات به طریقه داخل وریدی تجویز شد.

Control

صفر

 

 

در گروه‏های دریافت کننده لیپوپلی ساکارید
د-گالاکتوز آمین، دوز تزریقی به ترتیب 7 میکروگرم و18 میلی‏‏گرم/ موش ودر کلیه گروه‏های دریافت کننده کاربنوکسولون دوز تزریقی 20 میلی‏‏گرم/کیلوگرم بوده است.

نتایج تحلیل‏‏ بافتی کبد، طحال، کلیه، ریه و روده

گروه دریافت کننده لیپو پلی ساکارید و
 د- گالاکتوز آمین (‏‏گروه LPS)‏‏در مقایسه با دیگر گروه‏ها، بیش ترین شدت نکروز کبدی را نشان داد. در گروه کنترل (بافر رینگر لاکتات) آسیب کبدی مشاهده نشد. در سه گروهی که داروی کاربنوکسولون را در زمان‏های مختلف دریافت کرده اند (گروه‏های LPSCarb،‏ Carb6LPS و LPS1Carbi.p.)‏‏ شدت نکروز کبدی کاهش یافت و از سه گروه تحت درمان با کاربنوکسولون، گروه ‏LPSCarb (‏‏دریافت هم زمان لیپو پلی ساکارید، د- گالاکتوز آمین و کاربنوکسولون)، کم‏ترین شدت نکروز دربافت کبدی (‏‏نکروز خفیف در برخی نقاط)‏‏ رانشان داد. در گروه LPS1Carb به علت‏‏ آن‏که تنها یک موش از آزمایش قبلی زنده مانده بود، نتایج قابل اعتماد نبوده و درشکل 3 ذکرنشد.

 

 

شکل 3- نمودار مقایسه ای میانگین شدت نکروز در سلول‏های کبدی در گروه‏های مورد مطالعه

 

همان‏طور که در شکل 3 مشاهده می‏شود بیشترین میزان نکروز درگروه LPS ایجاد شد، گروه‏های دریافت کننده داروی کاربنوکسولون درمقایسه با گروه LPS کاهش درشدت نکروز کبدی رانشان دادند. درگروه کنترل منفی هیچگونه نکروزی مشاهده نشد.مقادیر به شکل‏‏ میانگین (Mean±SE)نشان داده شده است.

همچنین، در کلیه موش‏های گروه کنترل با حفظ هسته سلولی هیچگونه نکروزی در سلول‏های توبولار مشاهده نشد. در صورتی‏که در گروه LPS در مقایسه با سایر گروه‏ها بیشترین میزان نکروز حاد توبولار مشاهده شد و بیشتر سلول‏ها هسته‏های خود را از دست دادند. در گروه‏های گیرنده دارو ‏کاهش درخور توجهی در میزان نکروز توبولی مشاهده شد. به طوری‏که با بررسی لام پاتولوژی تهیه شده از کلیه موش‏های گروه ‏LPS1Carbi.p.،‏ هیچگونه تغییری در سلول‏های کلیه مشاهده نشد وهمچنین شدت نکروز در سایر گروه‏های دریافت کننده کاربنوکسولون نیز به شدت کاهش یافت به طوری‏که در گروهCarb6LPS،‏ در برخی از نقاط از دست رفتن هسته‏ها به چشم می‏خورد و نکروز توبولی مشاهده شد ولی شدت نکروز در مقایسه با گروه‏LPSکمتر بود. تاثیر داروی کاربنوکسولون در گروهی که کاربنوکسولون، لیپوپلی ساکارید ود گالاکتوز آمین را به طور همزمان دریافت کرده است، در کاهش شدت نکروز بیشتر به چشم می‏خورد. در این گروه نکروز توبولی بسیار خفیفی در کلیه موش‏های تحت بررسی در مقایسه با گروه LPS و گروهCarb6LPS مشاهده شد.

در بررسی بافتی نمونه‏های به دست آمده از طحال، ریه وروده نتایج معنی داری بین گروه‏ها به دست نیامد.

 

نتایج سنجش غلظت عامل‏‏ نکروز توموری آلفا موجود در سرم موش‏ها با استفاده از کیت الایزا

 برای بررسی اختلاف میانگین غلظت عامل‏‏ نکروز توموری آلفا با سایر گروه‏ها از آزمون تحلیل واریانس استفاده شد. این آزمون با (P value <0.05) اختلاف معنی‏داری را در میانگین بین برخی گروه‏ها نشان می‏دهد. آزمون مقایسه چند گانه Tukey نشان می‏دهد که اختلاف در میانگین غلظت عامل‏‏ نکروز توموری آلفا مشاهده شده بین گروه LPS با گروه کنترل معنی دار است(P value <0.05). بنابراین، تزریق لیپو پلی ساکارید و د- گالاکتوز آمین باعث افزایش تولید عامل‏‏ نکروز توموری آلفا شده است. همچنین گروه کنترل با گروه LPS1Carb تفاوت معنی دار دارد
(P value <0.05). ولی گروه کنترل از لحاظ میانگین غلظت عامل‏‏ نکروز توموری آلفا با گروه‏های LPSCarb و Carb6LPS و LPS1Carbi.p. تفاوت معنی دار ندارد و این نتایج نشان می‏دهد که دارو اثر درمانی مطلوبی در موش‏های مورد مطالعه داشته است (شکل 4).

 

 

شکل 4- میانگین (Mean±SE) غلظت عامل‏‏ نکروز توموری آلفا درگروه‏های مختلف

 

 

همان‏‏طور که در شکل 4 مشاهده می‏شود، گروه LPSCarb از نظر میانگین غلظت عامل‏‏ نکروز توموری آلفا با دیگر گروه‏ها تفاوت معنی دار ندارد. گروه LPS1Carb به جز گروه کنترل با دیگر گروه‏ها تفاوت معنی دار ندارد. گروه Carb6LPS و LPS1Carbi.p. با هیچ کدام از گروه‏ها تفاوت معنی دار نشان نداد. گروه LPS به جز گروه کنترل با دیگر گروه‏ها از اختلاف معنی‏داری نشان نمی‏دهد.

 

بحث و نتیجه گیری

در این بررسی، نتیجه گرفته شد که تجویز لیپو‏پلی‏ساکارید سالمونلا تیفی موریوم به میزان 7 میکروگرم و د- گالاکتوزآمین هیدروکلراید به مقدار 18 میلی‏‏گرم باعث مرگ 80 درصد موش‏ها می‏شود. می‏ون داین[ix]و همکاران وی نیز برای‏‏ ایجاد مدل آزمایشگاهی شوک اندوتوکسیک، لیپو پلی ساکاریدرا با دوز 5 میکروگرم و د- گالاکتوز آمین را با دوز 20 میلی‏‏گرم به هر موش به شکل‏‏ داخل صفاقی تزریق کردند که موجب مرگ 80 درصد‏ موش‏ها شد (‏‏22). این مقادیر با مقادیر استفاده شده در مطالعه ما کمابیش مطابقت دارد.

به دنبال تزریق20 میلی‏‏گرم (‏‏‏‏به کیلو گرم وزن بدن) از داروی کاربنوکسولون در موش‏های دریافت کننده لیپوپلی ساکارید ود-گالاکتوز آمین با دوز ذکر شده، ‏پس‏‏ از 24 ساعت میزان مرگ و میر موش‏ها ‏از 80 درصد ‏به 20 درصد ‏کاهش یافت (شکل 2).

‏در این مطالعه، تجویز داروی کاربنوکسولون به میزان 30 میلی‏‏گرم (به کیلوگرم وزن بدن) همراه با لیپو‏پلی ساکارید و د- گالاکتوز آمین باعث مرگ کلیه موش‏های تحت آزمایش شد. پیش از این نیز نشان داده شده است که تجویز داروی کاربنوکسولون به مقدار زیاد اثر کشندگی دارد. کاربنوکسولون در فعالیت‏های بیوانرژیتیک میتوکندری دخالت دارد که به نوبه خود موجب تغییرات متابولیکی سمی در کبد می‏شود (‏‏23). کاربنوکسولون یکی از ترکیبات عمده گیاه شیرین بیان محسوب شده و نشان داده شده است که مصرف بیش ازحد شیرین بیان اثرات سمی بر روی کبد و سیستم قلبی– عروقی دارد و افزایش فشار خون و ادم را موجب می‏شود (‏‏24).

‏نتایج به دست آمده نشان داد، مصرف داروی کاربنوکسولون در زمان‏های مختلف در موش‏های تحت تیمار با لیپو پلی ساکارید و د – گالاکتوز آمین، میزان مرگ و میر را کاهش می‏دهد. به طوری‏که تزریق هم‏زمان داروی کاربنوکسولون با غلظت 20 میلی‏‏گرم/کیلوگرم، همراه با لیپوپلی ساکارید و
د- گالاکتوز آمین میزان مرگ و میر را به 20 درصد رساند و کم‏ترین درصد مرگ و میر در این گروه در مقایسه با سایر گروه‏های دریافت کننده دارو مشاهده شد (‏‏جدول 2) .

در گروه LPS1Carb درصد مرگ و میر (90 درصد‏) بیش‏تری در مقایسه با گروه کنترل مثبت یعنی گروه LPS (80 درصد) مشاهده شد و این امر به احتمال زیاد به علت استرس ایجاد شده هنگام تزریق داخل وریدی در موش‏های مبتلا به شوک آندوتوکسیک است‏. به همین دلیل گروه اضافی دیگری در آزمایش‏ها‏‏ تعریف شد و به منظور کاهش استرس، تزریق دارو به شکل‏‏ داخل صفاقی انجام شد. در این گروه میزان مرگ ومیرکاهش یافته و از 80 به 50 ‏درصد ‏رسید.

‏در گروه LPS بررسی لام‏های آسیب‏شناسی موش‏های زنده نکروز شدید کبدی (شدت چهارمثبت) را نشان داد در صورتی‏که در گروه کنترل که بافر رینگر لاکتات دریافت کردند، آسیب کبدی مشاهده نشد (شدت صفر). در مطالعه مشابهی کون[x] و همکاران 400 میلی‏‏گرم/کیلوگرم گالاکتوز آمین و 50 میکروگرم/کیلوگرم وزن بدن لیپو پلی ساکارید به طور داخل صفاقی به موش‏های بالب سی تزریق کردند و 9 ساعت پس‏‏ از تزریق شدت نکروز کبدی را بررسی نموده و بروز نکروز هموراژیک در بافت کبدی رامشاهده نمودند. این محققان‏‏ نشان دادند که آسیب‏های کبدی القا‏‏ شده تحت تاثیر لیپو پلی ساکارید و
د- گالاکتوز آمین با واسطه افزایش تولید عامل‏‏ نکروز توموری آلفا روی می‏دهد (‏‏10). ‏از طرفی در گروه‏هایی که کاربنوکسولون را به عنوان دارو دریافت نمودند شدت نکروز در کبد در مقایسه با گروه LPS کاهش یافت که نشان دهنده نقش موثر کاربنوکسولون در کاهش شدت نکروز در کبد موش‏ها است‏ (‏‏شکل3).

جوناسن وهمکاران نشان دادند که در موش‏هایی که به طور سیستمیک با لیپوپلی ساکارید تجویزشدند، عملکرد توبول‏های کلیه دچار اختلال شده، میزان فیلتراسیون گلومرولی وفشار خون کاهش یافته، سیستم‏های انتقال آب ونمک در سلول‏های توبولار کلیه دچار اختلال شده و نارسایی حاد کلیه ایجاد می‏شود. البته این محققان‏‏ خاطر نشان کردند که مکانیسم‏های آسیب‏های کلیوی به دنبال تجویز سیستمیک لیپوپلی‏ساکارید پیچیده بوده و به طور کامل شناخته نشده است (‏‏25). در مطالعه حاضر نیز نقش تجویز لیپوپلی ساکارید در ایجاد نکروز حاد توبولار و از دست رفتن هسته‏های سلولی مشاهده شد. البته تجویزداروی کاربنوکسولون دی سدیم سالت در زمان‏های مختلف کاهش درخور توجهی درمیزان نکروز توبولی را در گروه‏های دریافت کننده دارو باعث شد.

مقدار عامل‏‏ نکروز توموری آلفا تولید شده در گروه LPS به طور میانگین ‏729.88±199.63 پیکوگرم/ میلی‏‏لیتر و در گروه کنترل 27.92±10.7 پیکوگرم/ میلی‏‏لیتر بود. بنابراین، می‏توان نتیجه گرفت که تجویز لیپو پلی ساکارید باعث القا‏‏ تولید عامل‏‏ نکروز توموری آلفا شده است. این سیتوکین نقش مهمی درالقا‏‏ آسیب‏های کشنده کبدی ایفاء می‏کند.

مقدار عامل‏‏ نکروز توموری آلفا در گروه LPS1Carb 741.46±250.23 پیکوگرم/میلی‏‏لیتر به دست آمد. این مقادیر در مقایسه با گروه LPS (729.88±199.63 ‏پیکوگرم/میلی‏‏لیتر) بیش‏تر است‏. همچنین، در گروه دیگری که پس از آن به آزمایش اضافه شد با نامLPS1Carbi.p.(که تزریق دارو به شکل‏‏ داخل صفاقی انجام شد‏‏)، مقدار عامل‏‏ نکروز توموری آلفا به 474.78±91.16 پیکوگرم/میلی‏‏لیتر کاهش یافت. بنابراین، می‏توان نتیجه گرفت با در نظر گرفتن شرایط و جوانب تجویز دارو از جمله نحوه تزریق، داروی کاربنوکسولون باعث کاهش مقدار تولید عامل‏‏ نکروز توموری آلفا به دنبال تجویز لیپوپلی ساکارید می‏شود، تفاوت مشاهده شده شاید به این دلیل است که موش‏هایی که به دنبال تزریق لیپوپلی ساکارید دچار شوک اندوتوکسیک شده اند به علت‏‏ تحریک شدید سیستم عصبی سمپاتیک، عروق محیطی تنگ شده ای دارند و بنابراین تزریق دوم داخل وریدی در این موش‏ها به شدت استرس زا است‏، در حالی که تزریق داخل صفاقی باعث چنین استرسی نمی‏شود. ‏همچنین در حالی‏که در گروه LPS افزایش معنی‏داری در غلظت عامل‏‏ نکروز توموری آلفا نسبت به گروه کنترل می‏بینیم، مشاهده می‏شود که اختلاف در غلظت عامل‏‏ نکروز توموری آلفا در گروه‏های دریافت کننده دارو با کنترل معنی دار نیست، که این رویداد نشان دهنده نقش موثر تجویز دارو با روش مناسب در جلوگیری از افزایش غلظت عامل‏‏ نکروز توموری آلفا است‏ (‏‏27 و 26) . در مجموع، مطالعه پیش روی نشان داد که تزریق داروی کاربنوکسولون دی سدیم سالت باعث کاهش التهاب و آسیب ناشی از شوک آندوتوکسیک ‏با واسطه کاهش در میزان عامل‏‏ نکروز توموری آلفا، کاهش شدت نکروز در کبد وکلیه ونیز کاهش میزان مرگ ومیر در موش‏های تحت مطالعه می‏شود‏.

 



1. Hepatoprotective

[2]. Heat shock protein 70

[3]. Lipopolysaccharide from salmonella enterica serotype typhimurium

[4]. Absent Necrosis

[5]. Occasional Necrosis

[6]. Mild Necrosis

[7]. Moderate necrosis

[8]. Severe necrosis

[ix]. Mai Van Dien

[x]. A. H. Kwon

References

(1) Brooks GF, Butel JS, ‏Morse SA. Jawetz, Melnick, & Adelberg's Medical Microbiology, 25rd ed. ‏New York: McGraw-Hill; 2010.

(2) Ohno A, Isii Y, Tateda K, Matumoto T, Miyazaki S, Yokota S, et al. Role of LPS length in Clearance rate of bacteria from the bloodstream in mice. Microbiol1995; 141(10): 2749-59.

(3) Ulevitch RJ, Tobias PS. Receptor-dependent mechanisms of cell stimulation by bacterial endotoxin. Annu Rev Immunol 1995; 13: 437-57.

(4) Hirata K, Kaneko A, Ogawa K, Hayasaka, H, Onoe T. Effect of endotoxin on rat liver. Analysis of acid phosphatase isozymes in the liver of normal and endotoxin-treated rats. Lab Invest 1980; 43(2): 165-71.

(5) Hewett JA, Roth RA. Hepatic and extrahepatic pathobiology of bacterial lipopolysaccharides. Pharmacol Rev 1993; 45(4):382−411.

(6) Ensor JE, Wiener S, McCrea KA, Viscardi RM, Crawford EK, Hasday JD. Differential effects of hyperthermia on macrophage interleukin-6 and tumor necrosis factor-expression. Am J Physiol Cell Physiol 1994; 266 (4 Pt 1): C967–74.

(7) Blumenthal M, Goldberg A, Brinckmann J. Herbal Medicine: expanded Commission E Monographs. First rd ed, Newtown: American Botanical Council; 2000.

(8) Turpie AG, Thomson TJ. Carbenoxolone sodium in the treatment of gastric ulcer with special reference to side effects. Gut 1965; 6(6):591–4.

 

(9) Hosseinzadeh H, Nassiri Asl M. Anticonvulsant, sedative and muscle relaxant effects of carbenoxolone in mice. BMC Pharmacol. 2003; 29(3): 3.

(10)          Tangri KK, Seth PK, Parmar SS, Bhargava KP. Biochemical study of anti-inflammatory and anti-arthritic properties of glycyrrhetinic acid. Biochem Pharm 1965; 14(8): 1277–81.

(11)          Matsui S, Matsumoto H, Sonoda Y, Ando K, Aizu-Yokota E, Sato T, et al. Glycyrrhizin and related compounds down-regulate production of inflammatory chemokines IL-8 and otaxin 1 in a human lung fibroblast cell line. Int Immunopharmacol 2004; 4(13): 1633–44.

(12)          Kiso Y, Tohkin M, Hikino H, Hattori M, Sakamoto, T, Namba T. Mechanism of antihepatotoxic activity of glycyrhhizin, I: Effect on free radical generation and lipid peroxidation. Planta Med 1984; 50(4): 298–302.

(13)          Haraguchi H, Ishikawa H, Mizutani K, Tamura Y, Kinoshita T. Antioxidative and superoxide scavenging activities of retrochalcones in Glycyrrhiza inflate. Bioorg Med Chem 1998; 6(3): 339–47.

(14)          Salvi M, Fiore C, Battaglia V, Palermo M, Armanini D, Toninello A. Carbenoxolone induces oxidative stress in liver mitochondria which isresponsible for transition pore opening. Endocrinology 2005; 146(5): 2306–12.

(15)          Braunwald E, Fauci AS, Kasper DL, Hauser SL. Harrison's Principles of Internal Medicine. 15rd ed. New York: McGraw-Hill; 2001.

(16)          Zhang GY, Cao YH, Xu Y. Effect of gap junction in the ischemic injury of focal cerebral infarct. Chin J Clin Rehab 2004; 8: 4510-11.

(17)            Kwon A H, Qiu Z, Nagahama H, MKaibori M, Kamiyama Y. Fibronectin Suppresses Apoptosis and Protects Mice From Endotoxic Shock. Transplant Proc 2004; 36(8): 2432-5.

(18)            AkikoMorikawa TS, Naoki Koide YK, Guo-zhi J, Takahashi K, TamadaY, Yokochi T. Apoptotic cell death in the response of D- Galactosamine-sensitized mice to lipopolysaccharide as an experimental endotoxic shock model. Infect Immun 1996; 64(3):734-738.

(19)            Jing L, Qiong W, Wang F. Glutamine induces heat-shock protein and protects against Escherichia coli lipopolysaccharide-induced vascularhyporeactivity in rats. Crit Care 2007: 11(2): R34.

(20)            Fredricka C, Martin AH. Carbenoxolone and mefloquine suppress tremor in the harmaline mouse model of essential tremor. Mov Disord 2006; 21(10): 1641-9.

(21)            Van Westerloo DJ, Giebelen I, Florquin S, Daalhuisen J, Bruno M, DeVos A, et al. The Cholinergic Anti-Inflammatory Pathway Regulates the Host Response during Septic Peritonitis. J Infect dis 2005; 191(12): 2138-48.

(22)            Mai Van Dien KT, Mya mu M, Koide N, Sugiyama T, Mori I, Yoshida T, et al. Protective Effect of Wogonin on Endotoxin-Induced Lethal Shock in D-Galactosamine-Sensitized Mice. Microbial Immunol 2001; 45(11):751-6.

(23)            Laubenthal F, Frage einer lebersch Z, Wirkung von A. Carbenoxolone. Dtsch med Wschr 1972; 97:1351–4

(24)            Constantin J, Ishii-Iwamoto EL, Suzuki-Kemmelmeier F, Yamamoto N, Bracht A. Bivascular liver perfusion in the anterograde and retrograde modes. Zonation of the response to inhibitors of oxidative phosphorylation. Cell Biochem Funct 1995; 13(3): 201–9.

(25)      Jonassen TE, Graebe M, Promeneur D, Nielsen S, Christensen S, Olsen NV. Lipopolysaccharide-induced acute renal failure in conscious rats: effects of specific phosphodiesterase type 3 and 4 inhibition. J Pharmacol Exp Ther 2002; 303(1): 364-74.

(26)            Sethi A, Prakash S, Mohta M, Tyagi A. Shock - a short review. Indian J Anaesth 2003; 47(5):345-59.

(27)            Chien S. Role of the sympathetic nervous system in hemorrhage. Physiol Rev. 1967; 47(2): 214-88.