تجزیه‏ زیستی ترکیبات مورد استفاده در صنایع پتروشیمی توسط باکتری تجزیه‏کننده‏ تولوئن حاوی سیتوکروم P450

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، ایران

2 استاد میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه: با توجه به افزایش روزافزون آلاینده‌هایی نظیر هیدروکربن­های آروماتیک و مشکلات زیست محیطی ناشی از انتشار آن‏ها، تجزیه­ی زیستی و پاک­سازی این ترکیبات سمی توسط میکروارگانیسم‌ها از اهمیت بسیار زیادی برخوردار است. تولوئن یکی از مواد اصلی موجود در صنایع پتروشیمی و از مواد آلوده کننده رایج محیط زیست است که آثار مخربی بر سلامتی انسان و سایر موجودات زنده دارد.
مواد و روش‏‏ها: در این تحقیق، به منظور جداسازی باکتری‏های تجزیه کننده­ی تولوئن، از آب­های نواحی مختلف از جمله سواحل دریای خزر و خلیج فارس و همچنین فاضلاب شهری نمونه­برداری انجام شد. سویه­ای که بیشترین توانایی را در تجزیه­ی تولوئن داشت، با استفاده از آزمایش­های بیوشیمیایی و مولکولی شناسایی و توالی S rDNA16 آن در بانک ژنی NCBI با عنوان Bacterium Ex-DG74با شماره HQ414235 ثبت شد. در ادامه میزان حذف تولوئن از محیط کشت با استفاده از دستگاه طیف سنج نوری و کروماتوگرافی گازی، فعالیت آنزیمی سیتوکروم P450 و رشد در حضور آلاینده­های نفتی و پتروشیمی بررسی شد.
نتایج: پس از انجام مراحل غنی‏سازی در محیط حاوی تولوئن، در حدود 20 سویه جداسازی شد که در بین آن‏ها سویه­ی جداشده از پساب تصفیه­خانه اصفهان توانایی بالایی در تحمل و مصرف تولوئن به عنوان تنها منبع کربن و انرژی داشت. نتایج حاصل از طیف سنج نوری و کروماتوگرافی گازی مشخص کرد که این سویه می‏تواند تا غلظت (v/v) 25 درصد تولوئن را به خوبی تحمل کند و بیش از 70 درصد از تولوئن (v/v) 1 درصد را به عنوان تنها منبع کربن و انرژی مصرف کند. سویه­ی Bacterium Ex-DG74 علاوه بر تولوئن توانست در محیط­های حاوی نفت سیاه، نفت سفید، زایلن، نفتالین، اولئیک اسید، استایرن، دی­هیدروآبتیک اسید و پلی­اکسی­اتیلن اکتیل­فنل­اتر نیز به خوبی رشد کند.
بحث و نتیجهگیری: با توجه به نتایج به دست آمده مشخص شد که فعالیت آنزیمی سیتوکروم P450، یکی از عوامل مهم در تجزیه­ی آلاینده­های مختلف توسط Bacterium Ex-DG74است. از این باکتری به علت توانایی رشد در غلظت بالای تولوئن و تجزیه­ی دامنه­ی وسیعی از آلاینده­ها، می‌توان به عنوان بذر سلولی در پاک­سازی محیط‌های آلوده به ترکیبات سمی مختلف استفاده کرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Biodegradation of petrochemical industry compounds by cytochrome P450-producing toluene-degrading bacterium

نویسندگان [English]

  • Seyed Mahdi Ghasemi 1
  • Afrouzosadat Hosseini Abari 1
  • Giti Emtiazi 2
1 Ph.D student of Microbiology, University of Isfahan, Iran
2 Professor of Microbiology, University of Isfahan, Iran
چکیده [English]

Introduction: Owing to the serious environmental problems which have occurred due to the increasing amount of toxic petroleum hydrocarbons in the environment, bioremediation of these compounds by microorganisms seems to be necessary. Among these, toluene is a common pollutant in petrochemical industry and a serious cause for concern due to its adverse health effects and carcinogenic potential.
Materials and methods: In this study, to isolate toluene-degrading bacteria, contaminated seawater and wastewater samples were collected from the Caspian Sea, the Persian Gulf and municipal wastewater. The best toluene-degrading bacterial strain was biochemically and molecularly characterized and its 16S rDNA sequence was submitted as Bacterium Ex-DG74 (accession no. HQ414235) in NCBI. Then, toluene removal rate, cytochrome P450 enzymatic activity, and growth rate of the isolate on oil and petrochemical contaminants were determined.
Results: After enrichment procedures in toluene-containing medium, about twenty toluene-degrading bacteria were isolated. Among them, a newly isolated strain from wastewater exhibited great ability to utilize toluene as the sole source of carbon and energy. According to the results obtained by spectrophotometer and gas chromatograph, Bacterium Ex-DG74 showed a significant tolerance to organic solvent as it could grow in the medium containing %25 (v/v) toluene and also degraded over 70 of %1 (v/v) toluene as the sole source of carbon and energy. Moreover, this bacterium could grow on different toxic oil and petrochemical compounds.
Discussion and conclusion: The results of the present study indicated that cytochrome P450 enzymatic activity can have essential role on biodegradation of different pollutants by Bacterium Ex-DG74. Thus, we suggest this bacterium as a potential biological agent for in situ bioremediation of hydrocarbon-polluted environments.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bioremediation
  • Cytochrome P450
  • Petrochemical wastewater
  • Toluene

مقدمه

نفت خام و مشتقات آن از راه‏های مختلف مثل نشت تانکرهای مخصوص حمل و نقل مواد نفتی و همچنین هنگام استخراج از چاه­ها، محیط زیست را آلوده می‏کند. آلوده شدن آب و خاک به این مواد سمی می‏تواند مشکلات جدی برای اکوسیستم منطقه به وجود آورد. تیمار این ترکیبات با روش‌های فیزیکی و شیمیایی گران قیمت است اما پاک­سازی زیستی علاوه‌ بر آن که ارزان‌تر و مقرون به صرفه­تر است، یک روش سازگار با محیط زیست بوده و امکان معدنی شدن کامل هیدروکربن­های نفتی را فراهم می‏کند. پاک­سازی زیستی یا Bioremediation فرآیندی است که در آن با استفاده از اجزای سلولی یا فعالیت­های متابولیکی میکروارگانیسم­ها می‏توان مواد سمی را از محیط حذف و یا به مواد غیر سمی و بی خطر تبدیل کرد (1- 3).

یکی از گروه­های اصلی ترکیبات موجود در نفت خام، هیدروکربن­های آروماتیک است که به آن‏ها BTEX نیز گفته می­شود. علت این نام‏‏گزاری حضور 4 ماده سمی است که عبارتند از: بنزن، تولوئن، اتیل بنزن و زایلن[1]. در بین این ترکیبات، تولوئن که به میزان زیادی در نفت و مشتقات آن وجود دارد به علت سمیت و خاصیت سرطانزایی خود، نگرانی­های زیادی ایجاد کرده است. این ترکیب به میزان زیادی تولید و به عنوان سوخت، حلال و پیش‌ساز موادی مثل پلاستیک‌ها، فیبرهای سنتزی و آفت­کش‌ها استفاده می‌شود (4 و 5). از جمله مواد دیگر موجود در پساب پتروشیمی می‏توان سورفکتانت‏هایی نظیر اولئیک اسید و پلی‏اکسی‏اتیلن اکتیل‏فنل‏اتر (تریتون X-100) و مواد دیگری مثل تولوئن، استایرن و دی­هیدروآبتیک اسید (DHA) را نام برد (6 و 7). با وجود سمیت تولوئن و جلوگیری از رشد میکروارگانیسم‌ها، تجزیه­ی زیستی این ترکیب در محیط‌های مختلف توسط باکتری‏های مختلفی که قادرند از آن به عنوان منبع کربن و انرژی استفاده کنند، دیده شده است. از جمله باکتری‏های گزارش شده تجزیه کننده تولوئن می‏توان گونه‏های مختلف جنس‏های Bacillus،Pseudomonas،Burkholderia،ExiguobacteriumوRalstonia را نام برد (8- 11).

سویه­های بومی هر ناحیه به علت سازگاری بیشتر به شرایط آن ناحیه مثل دما، شوری، اسیدیته‏ و غیره، برای تجزیه و حذف مواد آلوده کننده کارآیی بهتری دارند (12). با توجه به اثرات سمی و سرطان‏زایی تولوئن و این‏که ورود آن به آب‌ها‌ی آزاد و زیر‌زمینی می‏تواند زندگی آبزیان، انسان و سایر موجودات را تهدید کند، ضرورت جداسازی میکروارگانیسم‏هایی که قادر به تجزیه زیستی این ترکیب هستند مشخص می‏شود.

هدف از این تحقیق، جداسازی باکتری تجزیه کننده­ی تولوئن و بررسی قدرت متابولیکی آن در مصرف ترکیبات سمی و آلاینده­های مختلف بود. در این پژوهش، یک باکتری با توانایی بالا در تجزیه تولوئن از پساب فاضلاب اصفهان جداسازی شد که توانایی مصرف سایر آلاینده­های نفتی و صنایع پتروشیمی را نیز داشت.

 

مواد و روش‏ها

نمونه­گیری

نمونه‌برداری از آب‌های ساحلی دریای خزر، خلیج فارس و همچنین تصفیه‌خانه فاضلاب اصفهان انجام شد. برای کاهش احتمال وجود باکتری‏های غیر بومی، نمونه‌ها از عمق 15 سانتی‌متری در شیشه‌های درب دار استریل جمع‌آوری و بر روی یخ به آزمایشگاه منتقل شد.

جداسازی باکتری تجزیه کننده تولوئن

 به منظور جداسازی و خالص‏سازی باکتری‏های تجزیه کننده­ی تولوئن، یک میلی­لیتر از هر یک از نمونه‌ها به 50 میلی­لیتر محیط پایه نمکی موجود در ارلن­های در پیچ­دار که حاوی 4 گرم KH2PO4، 4 گرم Na2HPO4، 2 گرم NH4Cl، 2/0 گرم MgSO4، 001/0 گرم CaCl2و 001/0 گرم FeCl3در یک لیتر آب مقطر بودند، افزوده شد. تولوئن به میزان یک درصد درون هر یک از محیط­ها ریخته شد. سپس ارلن­ها در دمای 28 درجه سانتی‏گراد گرما‏گذاری شدند. پس از یک ماه غنی­سازی، سویه‌های تجزیه کننده­ی تولوئن با انتقال به محیط تولوئن آگار (حاوی محیط پایه نمکی، تولوئن و آگار) و انکوباسیون در دمای 28 درجه سانتی‏گراد جداسازی شدند. به منظور حذف سویه­های اتوتروف، کلونی­های به دست آمده به محیط­های پایه نمکی حاوی و فاقد تولوئن منتقل شدند. سویه­هایی که فقط بر روی محیط حاوی تولوئن رشد کردند، برای بررسی بیشتر در محیط حاوی 50 درصد گلیسرول و در دمای منفی 20 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند (8 و 13).

بررسی خصوصیات ظاهری و بیوشیمیایی باکتری

خصوصیات ظاهری باکتری تجزیه کننده­ی تولوئن، نوع واکنش گرم، رنگ آمیزی اسپور و اسید فاست و همچنین آزمایش­های بیوشیمیایی مختلفی نظیر سنجش آنزیم­های کاتالاز و اکسیداز، احیای نیترات، حرکت، رشد در شرایط هوازی و بی هوازی، دما، اسیدیته بهینه و میزان تحمل به غلظت تولوئن و نمک بررسی شد (14 و 15).

شناسایی مولکولی باکتری

به منظور شناسایی دقیق باکتری جداسازی شده، از روش مولکولی تکثیر و تعیین توالی S rDNA16 استفاده شد. بدین منظور مقداری از کلونی تازه باکتری را در میکروتیوب حاوی 500 میکرولیتر آب مقطر استریل منتقل کرده و پس از 2 بار شستشو، به مدت 10 دقیقه در آب جوش قرار داده شد. سپس برای حذف ضایعات باکتری، نمونه‏ها در rpm 12000 سانتریفوژ و مایع‌رویی به عنوان الگو در PCR استفاده شد(16).

در این پژوهش، بخشی از توالی S rDNA16 با طولی در حدود 370 جفت باز با کمک پرایمر رفت DG74 با توالی5′-AGG AGG TGA TCC AAC CGC A-3′
و پرایمر برگشت RW01 با توالی
 5′-AAC TGG AGG AAG GTG GGG AT-3′ تکثیر شد (17).

مخلوط PCR حاوی 2 میکرولیتر DNA باکتری به عنوان الگو، 5/2 میکرولیتر بافر x10 PCR، 75/0 میکرولیتر MgCl2، 1 میکرولیتر dNTP (10 میلی‏مولار)، یک میکرولیتر از هر یک از پرایمرها (10 پیکومول) و 3/0 میکرولیتر از آنزیم DNA پلیمراز Taq (U/µL 5) بود. حجم نهایی مخلوط با استفاده از آب دیونیزه دوبار تقطیر به 25 میکرولیتر رسانده شد. واکنش PCR با دناتوراسیون اولیه در 94 درجه سانتی­گراد به مدت دو دقیقه برای یک سیکل آغاز شد و با برنامه دمایی به شکل دناتوراسیون در 94 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه، چسبیدن در 60 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه، پلیمریزاسیون در 72 درجه سانتی­گراد به مدت 45 ثانیه به تعداد 30 سیکل تکرار شد. واکنش PCR با پلیمریزاسیون نهایی در 72 درجه سانتی­گراد به مدت دو دقیقه برای یک سیکل به پایان رسید (18). محصول DNA الگو به همراه نمونه شاهد (حاوی تمام مواد PCR به جز DNA الگو) و نشانگر اندازه DNA، بر روی ژل آگاروز 5/1 درصد حاوی اتیدیوم بروماید و بافر TBE[2] به مدت 90 دقیقه در ولتاژ 80 ولت الکتروفورز شد و توسط دستگاه ژل داکیومنتاسیون (Biometra ساخت آلمان) با تابش اشعه­ی ماورای بنفش مشاهده شد. تعیین توالی نوکلئوتیدی ژن S rDNA16 توسط شرکت Eurofin آلمان انجام شد.

بررسی میزان رشد و تجزیه تولوئن با استفاده از طیف سنج نوری

ابتدا غلظتی معادل با 5/0 مک فارلند از باکتری در محیط پایه نمکی تهیه شد و 10 میکرولیتر از آن به 10 میلی­لیتر محیط­های کشت حاوی 1 درصد تولوئن‌ افزوده شد. پس از گرما‏گذاری در دمای 28 درجه سانتی­گراد به مدت 24 ساعت، میزان رشد باکتری با استفاده از دستگاه طیف سنج نوری (Shimadzu ساخت ژاپن) در طول موج 600 نانومتر بررسی شد. سپس به منظور تعیین میزان تولوئن باقیمانده در محیط کشت، ابتدا سوسپانسیون سلولی به مدت 20 دقیقه در rpm 6000 سانتریفوژ شد. به مایع رویی یک میلی­لیتر هگزان اضافه و به شدت تکان داده شد تا تولوئن موجود در محیط کشت در هگزان حل شود. در پایان، از فاز رویی که حاوی هگزان و تولوئن است برای اندازه گیری میزان تولوئن در طول موج 262 نانومتر استفاده شد. از محیط کشت حاوی تولوئن و فاقد باکتری به عنوان شاهد استفاده شد. همچنین تعیین میزان رشد و تحمل باکتری نسبت به غلظت­های 5 تا 25 درصد تولوئن، به همین شکل انجام شد(13).

بررسی تجزیه‏ی تولوئن با دستگاه کروماتوگرافی گازی (GC)

پس از بررسی تجزیه­ی تولوئن با روش طیف‏سنجی، برای تأیید نتایج، میزان تجزیه تولوئن توسط سویه جداسازی شده با استفاده از کروماتوگرافی گازی (Avondale ساخت آمریکا) مجهز به آشکار کننده یونیزاسیون شعله­ای[3] (FID) و ستون HP1 اندازه‌گیری شد. برنامه دمایی GC به این شکل تنظیم شد: درجه حرارت ستون از 60 تا 130 درجه سانتی­گراد (با سرعت 7 درجه سانتی­گراد در دقیقه)، دمای تزریق کننده 220 درجه سانتی­گراد و دمای آشکار کننده 240 درجه سانتی‏گراد. از گاز هلیوم با فشار psi 34 به عنوان گاز حامل استفاده شد. از محیط کشت حاوی تولوئن و فاقد باکتری به عنوان شاهد استفاده شد.

بررسی فعالیت آنزیمی سیتوکروم P450

برای آماده‌سازی توده سلولی، کشت 24 ساعته از سویه­ی مورد نظر در محیط حاوی تولوئن تهیه شد. پس از سانتریفیوژ در rpm 6000 به مدت 10 دقیقه، به منظور شکستن غشای توده سلولی با استفاده از دستگاه فراصوت (HielscherUP200H ساخت آلمان)، سلول‏ها در 4 فاصله زمانی مختلف، هر بار 30 ثانیه در معرض امواج فراصوت (دوره 5/0 و دامنه 40 درصد) قرار گرفتند. پس از سانتریفیوژ مجدد، 200 میکرولیتر از مایع رویی که حاوی سیتوکروم P450 است به لوله آزمایشی که حاوی یک میلی­لیتر از هر کدام از محلول‌های بافر سنجش (300 میلی‏مولار بافر فسفات پتاسیم (8/7 اسیدیته‏) حاوی 1/0 میلی‏مولار EDTA)، بافر رقیق‌کننده آنزیمی (300 میلی‏مولار بافر فسفات پتاسیم (8/7 اسیدیته‏) حاوی 1/0 میلی‏مولار EDTA و 5/0 میلی­گرم در میلی­لیتر آلبومین سرم گاوی) و سوبسترا (500 میکرومولار فری­سیانید پتاسیم در 50 میلی‏مولار تریس اسیدکلریدریک با 2/7 اسیدیته‏) بود، افزوده شد. نمونه شاهد منفی هر سه محلول را شامل می‌شود اما فاقد عصاره­ی سلولی است. مقدار کاهش جذب نمونه در 430 نانومتر پس از نیم ساعت قرار گرفتن در دمای 28 درجه سانتی‏گراد، دلالت بر فعالیت سیتوکروم P450 و احیای فری­سیانید پتاسیم دارد (19). از سویه PG-3 Acinetobacter که در مطالعات قبلی جداسازی شده بود به عنوان شاهد مثبت استفاده شد (20).

بررسی رشد باکتری در حضور سایرآلاینده‌های نفتی

پس از تهیه 5/0 ‌مک فارلند از سویه­ی مورد آزمایش، به میزان 5 میکرولیتر از سوسپانسیون میکروبی به 5 میلی­لیتر محیط کشت پایه نمکی حاوییک درصد نفت سیاه، نفت سفید، زایلن و 5 میلی‌گرم نفتالین به عنوان تنها منبع کربن و انرژی افزوده و بیشترین میزان رشد باکتری پس از گرما‏گذاری در دمای 28 درجه سانتی­گراد به مدت 24 ساعت در طول موج 600 نانومتر در مقایسه با شاهد تعیین شد.

بررسی رشد باکتری در حضور آلاینده‌های موجود در پساب پتروشیمی

5 میکرولیتر از سوسپانسیون میکروبی با غلظتی معادل با 5/0 مک فارلند به 5 میلی­لیتر محیط کشت پایه نمکی حاوی یک درصد اولئیک اسید، استایرن، دی‏هیدروآبتیک اسید و پلی‏اکسی‏اتیلن اکتیل‏فنل‏اتر به عنوان تنها منبع کربن و انرژی افزوده شد. بیشترین میزان رشد باکتری پس از 24 ساعت گرما‏گذاری در دمای 28 درجه سانتی­گراد توسط طیف سنج نوری در 600 نانومتر در مقایسه با شاهد بررسی شد.

 

نتایج

جداسازی و شناسایی

پس از انجام نمونه­گیری از آب­های مختلف و غنی‏سازی در محیط پایه نمکی حاوی تولوئن، حدود 20 سویه باکتریایی تجزیه کننده تولوئن جداسازی شدند که در میان آن‏ها سویه­ی به دست آمده از پساب تصفیه خانه­ی فاضلاب اصفهان (سویه ww) بالاترین توانایی را در مصرف تولوئن به عنوان تنها منبع کربن و انرژی از خود نشان داد. جدول 1 ویژگی­های ظاهری، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی این باکتری را نشان می­دهد.

 

جدول 1- خصوصیات ریخت­شناسی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی باکتری

آزمایش‏های شناسایی

Bacterium Ex-DG74

شکل

باسیل، کورینه فرم

واکنش گرم

مثبت

اسید فاست

منفی

تولید اسپور

منفی

حرکت

مثبت

اکسیداز

مثبت

کاتالاز

مثبت

احیای نیترات

منفی

رشد هوازی

مثبت

رشد بی هوازی

مثبت

اسیدیته‏ بهینه رشد

7

دمای بهینه رشد

28 درجه سانتی­گراد

تحمل تولوئن

تا 25 درصد

تحمل نمک

تا 20 درصد

 

 

شکل 1 الکتروفورز محصول PCR با طولی حدود 370 جفت باز را بر روی ژل آگاروز نشان می­دهد. توالی S rDNA16 حاصل از واکنش PCR این باکتری پس از تعیین ترادف، با عنوان Bacterium Ex-DG74 و با شماره HQ414235 در بانک ژنی NCBI ثبت شد.

شکل 1- باند S rDNA16 حاصل از PCR بر روی ژل آگاروز 5/1

میزان رشد و تجزیه تولوئن: بر اساس نتایج حاصل از طیف سنج نوری بیشترین میزان رشد (71/0OD=) و تجزیه تولوئن (79 درصد) پس از 24 ساعت گرما‏گذاری در دمای 28 درجه سانتی‏گراد مشاهده شد. بررسی­های انجام شده توسط GC و مقایسه ارتفاع پیک­های به دست آمده (در زمان 13/8 دقیقه) از نمونه‏ اصلی (9/454 [pA]=) و نمونه­ی شاهد
 (2025 [pA]=) نشان داد تولوئن باقیمانده در محیط کشت در حدود 5/22 درصد نسبت به مقدار نخستین است (جدول 2).

 

 

جدول 2- حداکثر میزان رشد و تجزیه­ی تولوئن توسط باکتری

باکتری

میزان رشد (OD600nm)

حذف تولوئن

(طیف سنج نوری)

حذف تولوئن

(کروماتوگرافی گازی)

Bacterium Ex-DG74

71/0

79 درصد

5/77 درصد

 

 

از آنجایی که تولوئن به عنوان تنها منبع کربن و انرژی در محیط کشت بود، باکتری در محیط فاقد تولوئن رشدی نداشت. بررسی میزان رشد در غلظت­های مختلف تولوئن مشخص کرد که مناسب ترین غلظت برای رشد بهینه­ی باکتری 1 تا 5 درصد است. همانطور که در شکل 2 مشاهده می­شود، Bacterium Ex-DG74قادر است تا غلظت 25 درصد تولوئن را تحمل کند.

شکل2- اثر غلظت تولوئن بر رشد باکتری

 

فعالیت سیتوکروم P450

همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است، Bacterium Ex-DG74توانست مانند کنترل مثبت جذب نوری را در طول موج 430 نانومتر کاهش دهد که بیانگر فعالیت سیتوکروم P450 و احیای فری­سیانید پتاسیم است.

 

شکل 3- کاهش جذب نوری در نتیجه فعالیت سیتوکروم P450 باکتری

 

رشد در حضور آلاینده­های نفتی و پتروشیمی

با توجه به نتایج، Bacterium Ex-DG74 قادر است بر روی دامنه وسیعی از آلاینده­های نفتی و پتروشیمی به عنوان تنها منبع کربن و انرژی رشد کند (شکل 4). همانطور که در شکل 4 مشاهده می­شود، این سویه توانایی بیشتری در رشد بر روی آلاینده­های نفتی از خود نشان داد.

 

 

شکل 4- میزان رشد باکتری بر روی آلایندهای نفتی و پتروشیمی در مقایسه با میزان رشد بر روی محیط حاوی تولوئن و نوترینت براث

 


بحث و نتیجه گیری

با توجه به اینکه کشور ما در مجاورت خلیج فارس، دریای عمان و دریای خزر قرار دارد، حمل و نقل، جابه‌جایی، تخلیه و بارگیری فرآورده­های مختلف نفتی مانند حلال‌ها، موادپتروشیمیایی و بسیاری دیگر از محصولات نفتی یکی از منابع مهم آلودگی سواحل دربنادر محسوب می‌شود. از این رو آلودگی آب‌ها به مشتقات نفتی از معضل‏های اساسی است. با وجود سمیت تولوئن برای موجودات زنده، تجزیه تولوئن در محیط زیست توسط میکروارگانیسم‌های مختلف انجام می‏شود (8). از این‏رو، میکروارگانیسم­ها و بویژه باکتری‏ها به علت داشتن قدرت متابولیکی بالا و در نتیجه تطابق سریع با محیط اطراف خود، برای حذف آلاینده­های زیست محیطی مورد توجه بسیاری از محققین قرار گرفته اند (21). در مطالعه حاضر، باکتری تجزیه کننده­ی تولوئن، Bacterium Ex-DG74، از پساب تصفیه­خانه­ی اصفهان جداسازی شد. ورود این سویه در پساب تصفیه­خانه می­تواند نشانه وجود آلاینده‌های نفتی و ورود پساب­های حاوی تولوئن کارخانه‌ها در این محیط باشد. در مقایسه با مطالعاتی که در گذشته در زمینه تجزیه­ی تولوئن انجام شده، این باکتری توانایی بالایی در تحمل و تجزیه­ی تولوئن و سایر آلاینده­های پتروشیمیایی دارد (22 و 23). بر اساس مطالعه وانگ[iv] و همکاران سویه­های تجزیه کننده تولوئن LJ8 (Exiguobacterium gaetbuli) و JB5 (Bacillus mojavensis)قادرند به ترتیب غلظت 10 و 15 درصد تولوئن را تحمل ‌کنند (8). همچنین در مطالعه دیگری که بر روی سویه‏های Bacillus pumilusانجام شده، میزان حذف تولوئن فقط 25 درصد گزارش شده است (24). توانایی ایجاد کدورتی با جذب نوری بیش از 7/0 در محیط تولوئن براث، قابلیت تجزیه بیش از 70 درصد از تولوئن موجود در محیط کشت در مدت 24 ساعت، قدرت تحمل غلظت 25 درصدی تولوئن و همچنین رشد بر روی دامنه­ی وسیعی از ترکیب‏های سمی نفتی و پتروشیمی، این سویه را در مقایسه با سایر سویه‌ها منحصر به فرد کرده است.

مطالعاتی که در گذشته بر روی این باکتری انجام شده است نشان می­دهد که Bacterium Ex-DG74 قادر است به میزان زیادی آنزیم­های پراکسیدازی نظیر کاتالاز و لاکاز تولید کند (13). با توجه به نتایج به دست آمده، به نظر می­رسد که توانایی بالای این سویه در پاک­سازی زیستی آلاینده­های مختلف علاوه بر وجود آنزیم­های پراکسیدازی به علت فعالیت سیتوکروم P450 است. سیتوکروم P450 پروتئین آهن‏داری است که در سلسله­ی گیاهی، جانوری، قارچ‏ها و باکتری‏ها وجود دارد و به عنوان یک مونواکسیژناز انتهایی در زنجیره انتقال الکترون، در سمیت­زدایی نقش به سزایی ایفا می­کند (25). سیتوکروم P450 باکتریایی محلول است ولی نوع یوکاریوتی آن‏ها متصل به غشاست که این امر خالص­سازی آنزیم­های باکتریایی را راحت‏تر می‌کند. سیتوکروم P450 دارای کاربردهای متعددی است از جمله سیستمی برای متابولیزه‌کردن ترکیباتی از قبیل ترپن‌ها و آلکان‌هاست که از این سیستم می‏توان در تجزیه­ی پساب‌های آلی و آلاینده‌ها به خوبی استفاده کرد. بنابراین، این پروتئین با فعالیت اکسیژنازی خود از عوامل مهم در تجزیه­ی حلال‌هایی مانند تولوئن و سورفکتانت­هایی نظیر اسید اولئیک و غیره محسوب می‌شوند (26).

در این پژوهش، سویه­ی BacteriumEx-DG74 به عنوان یک گزینه­ی مناسب برای پاک­سازی زیستی محیط­های آلوده به مواد نفتی و پساب پتروشیمی معرفی شد. بر اساس مطالعات قبلی و یافته­های این پژوهش به نظر می­رسد آنزیم­های لاکاز و کاتالاز و همچنین سیتوکروم P450 نقش مهمی در تجزیه­ی آلاینده­های مختلف توسط این باکتری ایفا می­کنند. بنابراین به علت توانایی رشد در غلظت بالای تولوئن و تجزیه­ی دامنه وسیعی از آلاینده­ها، از این باکتری می‌توان به عنوان بذرسلولی در پاک­سازی محیط‌های آلوده به ترکیب‏های سمی مختلف استفاده کرد.

 

 

 

 

 

 



[1]. Benzene, Toluene, Ethylbenzene, Xylene (BTEX)

[2]. Tris/Borate/EDTA

[3]. Flame ionization detector

[iv]. Wang

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

References

(1)Dua M, Singh A, Sethunathan N, Johri AK. Biotechnology and bioremediation: successes and limitations. Appl Microbiol Biotechnol 2002; 59(2-3): 143-52.

(2)Paul D, Pandey G, Pandey J, Ain RK. Accessing microbial diversity for bioremediation and environmental restoration. Trend Biotechnol 2005; 23(3): 135-42.

(3)Kuiper I, Lagendij EL, Bloemberg GV, Lugtenberg BJJ. Rhizoremediation: A beneficial plant-microbe interaction. Mol Plant-Microbe Interact 2004; 17(1): 6-15.

(4)Chapelle FH. Bioremediation of petroleum hydrocarbon-contaminated ground water: The perspectives of history and hydrology. Ground Water 1999; 37(1): 122-32.

(5)Zilli M, Del Borghi A, Converti A. Toluene removal vapor in a laboratory-scale biofilter. Appl Microbiol Biotechnol 2000; 54(2): 248-54.

(6)Frigon JC, Stephenson R, Larab´ee S, Guiot S. Biotreatment of resin acid by a coupled anaerobic/aerobic integrated system. Pulp Pap Can 1999; 100(5): 131-4.

(7)Shackelford WM, Keith LH. Frequency of organic compounds identified inwater,EPA 600/4-76-062. NTIS No. PB-265470, U.S. Environmental ProtectionAgency, Office of Research and Development, Environmental Research Laboratory, Athens, GA, 1976.

(8)Wang L, Qiao N, Sun F, Shao Z. Isolation, gene detection and solvent tolerance of benzene, toluene and xylene degrading bacteria from nearshore surface water and Pacific Ocean sediment. Extremophiles 2008; 12(3): 335-42.

(9)Newman LM, Wackett LP. Purification and characterization of toluene 2-monooxygenase from Burkholderia cepacia G4. Biochemistry 1995; 34(43): 14066-76.

(10) Olsen RH, Kukor JJ, Kaphammer B. A novel toluene-3-monooxygenase pathway cloned from Pseudomonas pickettii PKO1. J Bacteriol 1994; 176(12): 3749-56.

(11)  Whited GM, Gibson DT. Toluene-4-monooxygenase, a three-component enzyme system that catalyzes the oxidation of toluene to p-cresol in Pseudomonas mendocina KR1. J Bacteriol 1991; 173(9): 3010-6.

(12) Farhadian M, Duchez D, Vachelard C, Larroche C. BTX removal from polluted water through bioleaching processes. Appl Biochem Biotechnol 2008; 151(2-3): 295-306.

(13)  Hosseini Abari A, Emtiazi G, Ghasemi SM. The role of exopolysaccharide, biosurfactant and peroxidase enzymes on toluene degradation by bacteria isolated from marine and wastewater environments. Jundishapur J Microbiol 2012; 5(3): 479-85.

(14) Slepecky RA, Hemphill HE. The genus Bacillus. In: Dworkin M, Falkow S, Rosenberg E, Schleifer KH, Stackbrandt E, editors. The prokaryotes. 3rd ed. New York: Springer; 2006.

(15) Hosseini Abari A, Emtiazi G, Ghasemi SM, Roghanian R. Isolation and characterization of a novel toluene-utilizing bacterium exhibiting potential application in bioremediation. Jundishapur J Microbiol 2013;)in press(

(16) Li S, Qu Y, Hu D, Shi Y. Comparison of extended spectrum β-lactamases-producing Escherichia coli with non-ESBLs-producing E.coli: drug-resistance and virulence. World J Emerg Med 2012; 3(3): 208-12.

(17) Greisen K, Loeffelholz M, Purohit A, Leong D. PCR Primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol 1994; 32(2): 335-51.

(18) Bickley J, Short JK, McDowell DG, Parkes HG. Polymerase Chain Reaction (PCR) detection of listeria monocytogenes in diluted milk and reversal of PCR inhibition caused by calcium ions. Lett Appl Microbiol 1996; 22(2): 153-8.