جداسازی و بررسی میزان تولید اسید لاکتیک در لاکتوباسیلوس‏های بومی استان چهارمحال و بختیاری جداسازی شده از محصولات لبنی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، ایران

2 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه شهرکرد، ایران

3 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، ایران

چکیده

مقدمه: قرن‏هاست که باکتری‏های اسیدلاکتیک در محصولات لبنی تخمیری به دلیل مشارکت در ایجاد عطر و طعم، بافت و در بسیاری موارد ‏خواص پروبیوتیکی اسفاده می‏‏شوند. از آن‏جایی که کشت‏های آغازگر لاکتیکی در تولید مقدار بهینه اسید لاکتیک در فرآیند تولید انواع پنیر و ماست، استفاده می‏‏شوند، بررسی سویه‏های بومی مولد اسید لاکتیک می‏تواند با اهمیت باشد.
مواد و روش‏‏ها: جداسازی لاکتوباسیلوس‏ها با کمک محیط کشت MRS از نمونه‏های مختلف انجام شد. سپس، بررسی تنوع و ویژگی‏های لاکتوباسیل‏های موجود در نمونه‏های مختلف از لحاظ توانایی تولید دی اکسید کربن از گلوکز، توانایی رشد در اسیدیته‏‏های 50/2 تا 50/8، غلظت‏های مختلف نمک 50/1 ‏تا 10 درصد (وزنی/حجمی) و دماهای 15 و 45 درجه سانتی‏گراد بررسی شد. همچنین، توانایی حرکت باکتری‏ها، تولید اندول و تولید سولفید هیدروژن نیز بررسی شد. میزان تولید اسید لاکتیک کل در محیط شیر بدون چربی به روش تیتراسیون با سود یک درصد به شکل کمی محاسبه و میزان حضور ایزومر L-لاکتات با استفاده از کیت رندوکس[i] انگلستان بررسی شد.
نتایج: در این بررسی از 30 نمونه ماست و پنیر بومی نقاط مختلف استان 43 جدایه باسیل‏های گرم مثبت، کاتالاز منفی و اکسیداز منفی جداسازی شدند. همه جدایه‏ها به اسیدیته‏ 5/2 مقاوم بودند و به ترتیب 30 و 69 درصد نمونه‏ها به غلظت‏های 5/7 و 10 درصد نمک حساس بودند. بیشترین تولید اسید لاکتیک در یکی از جدایه‏ها برابر با 8/1 درصد و L- لاکتات ‏8/6 گرم بر لیتر بود. این جدایه بر اساس آزمون‏های بیوشیمیایی به عنوان لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس شناسایی شد.
بحث و نتیجهگیری: در اکثر جدایه‏ها میزان تولید اسید لاکتیک در دمای 37 درجه سانتی‏گراد بیشتر از دمای 25 درجه سانتی‏گراد ارزیابی شد که از نظر آماری در سطح یک درصد معنا دار بود. با توجه به تولید مطلوب اسید لاکتیک در جدایه بومی و تحمل مناسب اسیدیته‏ و نمک در آن، زمینه ای مناسب برای مطالعات تکمیلی و زمینه‏سازی برای کاربرد آن در صنایع غذایی فراهم است.



[i]. Randox

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and evaluation of lactic acid production content in native Lactobacillus of Chaharmahal va Bakhtiari province isolated from dairy products

نویسندگان [English]

  • Elham Sarmast Ghahfarokhi 1
  • Mohsen Mobini Dehkordi 2
  • Keyvan Beheshtimaal 3
1 Student of M.Sc of Microbiology, Islamic Azad University, Felavarjan, Iran
2 Assistant Professor of Microbiology,Shahrekord University, Iran
3 Assistant Professor of Microbiology, Islamic Azad University, Felavarjan, Iran
چکیده [English]

Introduction: the use of lactic acid bacteria in fermented dairy products due to their effects participation in flavor, texture and most probiotic properties goes back to centuries ago. Optimal amount of lactic starter culture in the production of lactic acid in the production of cheese and yogurt are used.
Materials and methods: Isolation of Lactobacillus in MRS medium from various samples was performed.Then, The variation of different characteristics in terms of the ability of Lactobacilli to produce CO2 from glucose, the ability to grow at pH 2.5 to 8.5, different concentration of NaCl, 1.5 to 10.0 (percent w / v) and temperatures of 15 ° c, 45° c, the ability to move, indole and H2S production were also studied. The production of lactic acid was assayed in skim milk by titration with %1 NaOH. L-lactate isomer was investigated using UK Randox kit.
Results: In this study, from 30 samples of different indigenous yoghurt and cheese 43 gram-positive, catalase-negative, oxidase negative lactobacilli were isolated. All isolates were resistant to pH 2.5 and 30 and %69 of the isolated were sensitive to 7.5 and %10 concentration of salt respectively. Most of lactic acid production with %1.8 and L-lactate 6.8 g/l were consididered for one isolated. This isolated bacillus based on biochemical tests was identified as Lactobacillus acidophilus.
Discussion and conclusion: The amount of lactic acid production at temperature 37°C was found to be higher than the temperature 25°C criteria that were statistically significant at %1 level. The optimal production of lactic acid in the native isolates and tolerance to appropriate pH and salt tolerance, these properties and studies are provided complementary knowledge to be used in the food industry.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Isolation
  • Lactic acid bacteria
  • Lactic acid measurement
  • Dairy Products

مقدمه

باکتری‏هایاسیدلاکتیک [1](LAB) ‏گروه هتروژنیازباکتری‏هایگرممثبتهستندکهبراساس مجموعهایازویژگی‏هایریخت‏شناسی،متابولیکو فیزیولوژیکدریکگروهبسیاربزرگقرارگرفته‏اند.اگرچه هستهمرکزیاینگروهبسیاربزرگرا جنس‏های لاکتوباسیلوس[2]، پدیوکوکوس[3]، لوکونوستوک[4]، لاکتوکوکوس[5]تشکیلمی‏‏دهند،بهمرورجنس‏های دیگریبهاینگروهاضافهشدندتاجاییکهامروزه باکتری‏های اسید لاکتیکحدود20جنسرادربرمی‏گیرند (1). لاکتوباسیلوس‏ها از مهم‏ترین جنس‏های این خانواده محسوب می‏‏شوند که به تنهایی شامل 80 جنس شناخته شده اند. این جنس یک گروه ناهمگن، شامل گونه‏هایی با تنوع وسیعی از خصوصیت‏های فنوتیپی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی است. ناهمگونی این گروه، به دلیل وجود 32 تا 55 در صد مجموع بازهای G-C در DNA گونه‏های این جنس است، که این مقدار، دو برابر میزان معمول و قابل قبول برای طبقه بندی یک جنس تک است. لاکتوباسیل‏ها، گرممثبت، میکروآئروفیل بهشکلمیله‏هایبلند، باریکوگاهیخمیدهتاکوتاههستندوبیشتربهشکلباسیل‏هایکوچک‏ترکورینهفرمیاکوکوباسیلمشاهدهمی‏‏شوند. ‏ارلا-جنسن[6]، طی تحقیقاتی که انجام داد، توانست لاکتوباسیل‏ها را به سه زیر جنس ترموباکتریوم، استرپتوباکتریوم و بتاباکتریوم تقسیم کند. جنس لاکتوباسیلوس شامل گونه‏هایی است که می‏توانند در هر سه گروه قرار گیرند و این موضوع در حقیقت اساس طبقه بندی به سه گروه است. لاکتوباسیل‏هابخش مهمیاز گروهبزرگباکتری‏هایتولیدکنندهاسیدلاکتیکهستند و ازاجزای اصلی فلورمیکروبیمحصولاتلبنی، کشتآغازگرمحصولاتلبنی تخمیریوانواعغذاهایتخمیریدیگرمانندسوسیسو کالباسشناخته می‏‏شوند.اینباکتری‏هادرطعمفرآورده‏های غذاییدخالتدارندوبهشکلپروبیوتیک‏هایغذاییاستفاده می‏شوند (2). اسیدلاکتیکمهم‏ترینمحصول آن‏هاازتخمیرکربوهیدرات‏هامحسوبمی‏‏شود. اسیدلاکتیکبهدوشکل فعالنوری ‏L(+) و ‏D(-)، وجوددارد.به‏دلیلمصرففراواناسیدلاکتیکومشتقاتآندرصنایع غذایی،نساجی،دارویی،آرایشی،شیمیاییوبه‏ویژه پلیمری، اهمیت توجه و بررسی تولید این اسید آلی پر کاربرد توسط باکتری‏های اسید لاکتیک از اهمیت زیادی برخوردار است (3).

استان چهارمحال و بختیاری دارای تنوع وسیعی از محصولات لبنی بومی است و بههمیندلیل می‏‏تواندبستریمناسببرایبررسیتنوعزیستی،به‏ویژهدر سطحمیکروب‏های اسید لاکتیکباشد. شرایطزیستیمنحصربهفرد،تنوع، گستردگیوازهمهمهم‏ترنبود سابقهبررسی‏هایمشابه،برلزومانجامپژوهش‏هایبیشتر براییافتنباکتری‏هایدارایپتانسیلصنعتیوهمچنین باکتری‏هایجدیددراینمناطقتاکیددارد.هدفازانجاماین پژوهش،بررسیماست و پنیرهای بومی و سنتی مناطق مختلف استان چهارمحال و بختیاری ازنظر وجود لاکتوباسیل‏ها، دستیابیبهجدایه‏هایجدید و با کارآیی بالاتر در تولید اسید لاکتیک برایتحقیق‏های آینده بود.

مواد و روش‏ها

جمعآورینمونه‏ها

30نمونهماست و پنیر بومیازدامداری‏های سنتی 11منطقهمختلف استان چهارمحال و بختیاری تهیهوباشرایط استریلدردمای4درجه سانتی‏گراد بهآزمایشگاهمنتقل شدند.

جداسازی

همهنمونه‏هابلافاصلهپسازانتقالبهآزمایشگاه ورتکسشده، و یک سی سی از رقت‏های 1-10و 4- 10ازهرنمونهدرمحیطآگارMRS[7] به شکل کشت خطی در سطح محیط کشت داده شدند. پلیت‏هابرایمدت48ساعتدردردمای 37 درجه سانتی‏گراد ‏و به شکل هوازی گرمخانه‏گذاریشدند (4).

شناسایی

پسازپایانزمانانکوباسیون،کلونی‏های غیر مشابهکهاز لحاظشکل،اندازه،کدریاشفافبودنوسایرویژگی‏هایظاهریمتفاوتبودند بهشکلجداگانهکشت داده شدند.ازتک کلونی‏هایخالصبرداشت شد وبهروشگرمرنگآمیزیشدند. سپس،آزمایش‏های اکسیدازوکاتالازانجامشد‏‏ (5). آزمون حرکت،تولیداندولوسولفیدهیدروژننیزانجامشد (6). تواناییرشددردماهایمختلف 15 و 45 درجه سانتی‏گراد پس از 24 ساعت، تحملبهغلظتنمک‏هایمختلف 5/1، 5/2، 0/5، 5/7 و 0/10 (درصد، وزنی/حجمی)، تولیدگازازگلوکزدرمحیطMRSبراثحاویلولهدورهام، توانایی رشد دراسیدیته‏ ‏های 5/2، 5/4، 0/6 و 5/8آزمایش شدند (7 و 8).

تعیینفعالیتاسیدیسویه‏ها

سویه‏هایجداشدهجوان24ساعته، بهمیزانیک درصد (وزنی/حجمی) بهمحیط شیر بدون چربی 10 درصد (وزنی/ حجمی) استریلتلقیحشدهودردمای37 درجه سانتی‏گراد به مدت 72 ساعت انکوبهشدند. در بازه‏های زمانی 24 ساعتهتغییراتاسیدیته‏و درصد تولید اسیدلاکتیک به روش تیتراسیون با سود یک درصد برایهرسویهاندازه‏گیریشد (9). سویه‏ای که بیشترین تولید اسیدلاکتیک در محیط شیر بدون چربی داشت انتخاب و مقدار فرم انانتیومری
L-لاکتات با استفاده از کیت آنزیمی رندوکس انگلستان اندازه‏گیری شد (10). بدین شکل که 10 میکرولیتر سوسپانسیون حاصل از رشد باکتری در محیط شیر بدون چربی و پس از پایان زمان گرمخانه‏‏گذاری 72 ساعته، با 1000 میکرولیتر از محلول آنزیم لاکتات پراکسیداز و معرف TOOS(N-اتیل-N-2-هیدروکسی-3-سولفوپروپیل-m-تولوئیدن) کیت مخلوط کرده و جذب نوری حاصل در طول موج 550 نانومتر اندازه گیری شد. همگی آزمون‏ها سه بار تکرار شدند.

تحلیل آماری

برای انجام تحلیل‏های آماری از نرم افزار SPSS17.0.0و آزمون‏های آماری ANOVA و t-Testاستفاده شد.

 

نتایج

همه کلونی تک سفید تا کرمی با قطر 1 تا 5/1 سانتیمترجداسازی شده، رنگ آمیزی گرم مثبت و شامل 23 باسیل طویل 2 تا 6 میکرومتر و 20 باسیل کوتاه و خمیده با طول 2 تا 4 میکرومتر بودند. آزمایش کاتالاز و اکسیداز برای همه باسیل‏ها منفی بود. همچنین، آزمایش حرکت، تولیدسولفید هیدروژن و اندول برای همه جدایه‏ها منفی مشاهده شد. همه جدایه فاقد توانایی تولید دی اکسیدکرین از گلوکز بودند. میزان جذب نوری جدایه‏ها پس از گرمخانه‏گذاری 24 ساعته در دمای 37 درجه سانتی‏گراد در محیط‏های تنش نمک و اسید و باز، به دست آمد و پس از تهیه رقت، جذب نهایی محاسبه شد. نتایج به دست آمده نشان می‏‏دهد که جدایه‏های خالص شده فاقد توانایی رشد در اسیدیته‏ 5/2 بودند و در اسیدیته‏ 5/4 توانایی رشد را داشتند. بهترین رشد سویه‏ها در اسیدیته‏ 5/6 و به نسبت کمتر در اسیدیته‏ 5/8 بود که قابلیت تحمل و رشد مناسبی داشتند. جدایه‏هایی که بیشترین مقاومت و رشد را در اسیدیته‏‏های مختلف از جمله اسیدیته‏ برابر 50/8 داشتند در شکل 1 و میزان رشد ایزوله 25Y- در اسیدیته‏ ‏های مختلف در شکل 2 آمده است. اختلاف مورد مشاهده بین جدایه‏های شاخص از نظر آماری در سطح 5 درصد معنا دار است(P value <0.05).

 

شکل 1- نمودار حداکثر رشد بهترین جدایه‏های مقاوم در اسیدیته‏‏های مختلف در محدوده 50/2 تا 50/8 ‏پس از 24 ساعت

 

شکل 2- نمودار حداکثر رشد ایزوله 25Y- در اسیدیته‏ ‏های مختلف در محدوده 50/2 تا 50/8 ‏پس از 24 ساعت‏

 

جدایه‏های جداسازی شده توانایی مقاومت و رشد در غلظت نمک 5/1 و 5/2(درصد، وزنی/حجمی) را داشته و به خوبی در این محیط رشد کردند. تنها 2 جدایه تحمل به غلظت نمک 0/5 درصد کمتری داشته و در حقیقت کمابیش به این غلظت نمک حساس بودند. میزان رشد باکتری‏ها و مقاومت سویه‏ها در غلظت‏های نمک ‏5/7 و 0/10 درصد در همه جدایه‏ها ‏کاهش یافته به طوری‏که به ترتیب 13 و 35 سویه از کل 43 سویه جداسازی شده، به غلظت 5/7 و 0/10 درصد نمک حساس بوده و فاقد توانایی تحمل و رشد در این غلظت‏های بالای نمک بودند. بهترین جدایه‏های مقاوم به غلظت‏های مختلف نمک در شکل 3 و نمودار رشد جدایه 25Y- در غلظت‏های مختلف نمک در شکل 4 آمده است. اختلاف مورد مشاهده بین جدایه‏های شاخص در سطح 5 درصد معنا دار است
(P value <0.05).

 

شکل 3- نمودار حداکثر رشد جدایه‏های شاخص مقاوم به غلظت‏های مختلف نمک پس از 24 ساعت

 

شکل 4- نمودار حداکثر رشد جدایه 25Y- در غلظت‏های مختلف نمک پس از 24ساعت

 

نتیجهآزمایشتواناییرشددردماهای 15 و 45 درجه سانتی‏گراد نشانداد 30 جدایه توانایی رشد در دمای 45 درجه سانتی‏گراد داشتند و 13 جدایه نیز قادر به رشد در دمای 15 درجه سانتی‏گراد بودند.  نتایج به دست آمده مشخص کرد که همه جدایه‏های جداسازی شده توانایی تولید اسید لاکتیک در محیط شیر بدون چربی را داشته و توانستند پس از گذشت 24 ساعت میزان در خور توجهی اسید تولید کنند. همچنین با توجه به آزمایش‏های انجام شده مشخص شد که لاکتوباسیلوس‏های جداسازی شده توانایی بهتری در تولید اسید با توجه به شرایط دمایی 37 نسبت به 25 درجه سانتی‏گراد دارند. این اختلاف در تولید اسید لاکتیک در بیشتر جدایه‏ها در سطح یک درصد معنا دار است. در جدایه‏های 3Ch- و 6Y-و 15Y- اختلاف در تولید اسید لاکتیک در دو دمای مذکور معنا دار نبود. بیشترین میزان تیتر اسیدلاکتیک در دمای 25 درجه سانتی‏گراد پس از گذشت 72 ساعت برابر با ‏481/0 درصد و اسیدیته‏ 63/4 مربوط به جدایه 25Y- بود که همین جدایه بیشترین تولید اسیدلاکتیک را در دمای 37 درجه سانتی‏گراد دارد. پس از گرمخانه‏گذاری محیط شیر بدون چربی همراه با این سویه توانست اسیدیته‏ شیر را تا حدود 64/3 کاهش دهد و در نهایت 81/1 درصد اسیدلاکتیک تولید نماید. میزان تیتر اسید لاکتیک برای جدایه‏هایی که بیشترین تولید را در محیط شیر بدون چربی و دو دمای25 و 37 درجه سانتی‏گراد ‏به ترتیب در جدول 1 و 2 نشان داده شده است. مقدار درصد اسیدلاکتیک در دماهای 25 و 37 درجه سانتی‏گراد برای جدایه 25Y- در شکل 5 آمده است. اختلاف در میزان اسید لاکتیک تولید شده در دو دمای مختلف از نظر آماری در سطح یک درصد معنا دار است (P value <0.01). اندازه‏گیری فرمL-لاکتات تولید شده، این مقدار برابر با 8/6 گرم بر لیتر بود که از مقدار اسید لاکتیک کل تیتر شده توسط سود یک درصد کمتر بوده و مشخص شد که سویه جداسازی شده هر دو فرم انانتیومری ‏L وD اسیدلاکتیک را تولید کند. نتایج تخمیر قندها در جدایه 25Y- در جدول 3 آمده است.

 

جدول 1- جدایه‏هایی با بیشترین تولید اسیدلاکتیک و میزان تیتر اسید در دمای 25 درجه سانتی‏گراد

نمونه

 

24

48

72

تیتر با NaOH

1 درصد

درصد اسیدلاکتیک

اسیدیته‏

تیتر با NaOH

1 درصد

درصد اسیدلاکتیک

اسیدیته‏

تیتر با NaOH

1 درصد

درصد اسیدلاکتیک

اسیدیته‏

7Ch-

باسیل کوتاه

76/1

136/0

93/5

05/3

369/0

59/4

67/3

481/0

63/4

25Y-

باسیل کوتاه

66/1

188/0

97/5

01/2

181/0

78/5

36/2

244/0

41/5

29Y-

باسیل کوتاه

64/2

295/0

24/5

47/2

264/0

18/5

31/3

415/0

87/4

 

جدول 2- جدایه‏هایی با بیشترین تولید اسیدلاکتیک و میزان تیتر اسید در دمای 37 درجه سانتی‏گراد

نمونه

کد

24

48

72

تیتر با NaOH

1 درصد

درصد اسیدلاکتیک

اسیدیته‏

تیتر با NaOH

1 درصد

درصد اسیدلاکتیک

اسیدیته‏

تیتر با NaOH

1 درصد

درصد اسیدلاکتیک

اسیدیته‏

3Ch-

باسیل کوتاه

40/1

072/0

00/6

64/3

12/6

23/4

89/9

60/1

71/3

6Ch-

باسیل کوتاه

14/2

205/0

58/5

51/5

811/0

27/4

25/9

48/1

91/3

25Y-

باسیل کوتاه

57/2

282/0

26/5

83/6

049/1

15/4

16/11

83/1

64/3

                       

 

 

شکل 5- نمودار درصد اسیدلاکتیک تولید شده در جدایه 25Y- پس از 72 ساعت در دو دمای 25 و 37 درجه سانتی‏گراد

 

جدول 3- نتایج تخمیر قندها در جدایه لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس

قند

سلوبیوز

لاکتوز

گالاکتوز

مالتوز

مانیتول

مانوز

ملیبیوز

رافینوز

سالیسین

سوکروز

ترهالوز

ریبوز

سوربیتول

ایزوله

25y-

+

+

+

+

-

+

+

+

+

+

-

-

-

 

 

 

 

 

بحث و نتیجه‏گیری

اهمیتباکتری‏هایاسیدلاکتیکدربحثصنعتوسلامت هرروزبیشترمی‏‏شود. دراینبینکشورمایکیاز واردکننده‏هایسویه‏هایمختلف باکتری‏های اسید لاکتیک وفرآورده‏هایآن‏هاطیسال‏هایگذشتهبودهاست.هدفازاینتحقیق، شناسایی لاکتوباسیل‏ها و اندازه‏گیری میزان اسیدلاکتیک تولید شده توسط این سویه‏های بومی جداسازی شده از ماست و پنیر سنتی مناطقمختلف استان چهارمحال و بختیاری بودهاستتاامکانبررسیو دستیابیبهباکتری‏های دارایقابلیتصنعتیمناسبدرزمینه‏هایمختلفراایجاد کند.

اسیدی یا بازی بودن یک محیط تأثیر زیادی بر ثبات و فعالیت مولکول‏های بزرگ نظیر آنزیم‏ها دارد. از این رو جای تعجب نیست که رشد و متابولیسم میکروارگانیسم‏ها به وسیله اسیدیته‏ تحت تأثیر قرار می‏‏گیرد. به دلیل این که باکتری‏های اسید لاکتیک در نتیجه فرآیند متابولیسم تولید انرژی، قادر به تولید مقدار زیادی اسید هستند، می‏توان نتیجه گرفت که این باکتری‏ها به طور مکرر تحت شرایط تنش اسید قرار می‏‏گیرند.

مقاومت به اسید و باز

سویه‏های جداشده از نمونه‏های لبنی استان چهارمحال و بختیاری توانایی چشمگیری در تحمل به شرایط اسیدی و قلیایی داشتند و توانستند در اسیدیته‏ 5/4، 0/6 و 5/8 به خوبی رشد کنند. این درحالی است که همه جدایه فاقد توانایی رشد در اسیدیته‏‏های خیلی اسیدی (5/2) بودند. با وجود این‏که 4 جدایه توانایی رشد در اسیدیته‏ 5/4 را داشته و کدورت در خور توجه در این اسیدیته‏ ایجاد کردند، برخی از باکتری‏های اسیدلاکتیک در اسیدیته‏‏های نزدیک به 2/3، برخی دیگر تا اسیدیته‏‏های 6/9 و بیشتر آن‏ها در اسیدیته‏‏های بین 0/4 و 5/4 رشد می‏‏کنند(11). همه جدایه‏های جداسازی شده در این تحقیق نیز دامنه وسیعی در مقاومت و رشد تحت ‏اسیدیته‏های اسیدی و کمی بازی از خود نشان دادند. توانایی رشد دراسیدیته‏‏‏های پایین در بین باکتری‏های اسیدلاکتیک متفاوت است که این نتیجه در راستای تحقیق‏های انجام شده توسط ایبورهما و همکاران[viii] است (12). بهترین رشد سویه‏های جداسازی شده در اسیدیته‏ 6 بود که همه سویه‏ها حداکثر رشد را داشتند همچنین همه جدایه‏ها توانستند رشد در خور توجه در اسیدیته‏ 5/8 نشان دهند. این مشاهدات نشان می‏‏دهد که بهینه رشد باکتری‏های اسیدلاکتیک ‏ در رنج اسیدیته 6 تا 4/6 است. این نتیجه با نتایج گزارش شده توسط شده توسط پانسار و همکاران[ix] مطابقت دارد (13). در اسیدیته‏‏های پایین نزدیک به 4، با تولید اسید و خروج آن از سلول باکتری به محیط، اسیدیته‏ سلول باکتری بالاتر از محیط اطراف باکتری می‏‏شود. در نتیجه پروتون‏ها به درون سلول نفوذ کرده و باکتری برای بیرون راندن این پروتون‏ها احتیاج به انرژی دارد که این عمل باعث کند شدن رشد می‏‏شود. اگر اسیدیته‏ خارجی خیلی پایین (در حدود 5/2 تا 3) باشد و غلظت اسید خارج سلولی بالا باشد، فشار وارده به سلول به میزان زیادی افزایش می‏‏یابد و بنابراین اسیدیته‏ سیتوپلاسم نیز کاهش یافته و میزان آن به سطحی می‏‏رسد که دیگر رشد ممکن نیست و احتمالا سلول باکتری می‏‏میرد (14). رولو و همکاران[x]، 3 مکانیسم مختلف برای مقاومت اسیدیته‏ پیشنهاد کرده اند این مکانیسم ها شامل ATPase–H+، مسیر دآمینازشدن آرژنین و واکنش گلوتامات دکربوکسیلاز است. پمپ ATPase –H+ ، پروتون‏ها را از طریق هیدرولیز ATP از سلول بیرون می‏‏راند و هرچقدر که میزان اسید تولید شده بیشتر و درحقیقت اسیدیته‏ پایین‏تر رود، فعالیت این پمپ نیز افزایش می‏‏یابد و ATP بیشتری مصرف می‏‏شود. درنتیجه به رشد سلول خسارت وارد می‏‏شود و رشد کند و حتی متوقف می‏‏شود (15).

مقاومت به نمک طعام

نمک طعام یک عامل دخیل اصلی در پنیر است که تأثیر عمده بر روی ترکیب، فلور میکروبی، رسیدن، بافت، طعم و کیفیت آن دارد (16). مقاومت به نمک یکی از ویژگی‏های اساسی برای باکتری‏های آغازگر مورد استفاده در صنعت پنیرسازی است که سویه‏های جداسازی شده در این تحقیق با توجه به مقاومت به غلظت‏های نمکی می‏‏توانند کاربرد فراوانی داشته باشند. ‏بر اساس نتایج بدست آمده سویه‏ها ی جداسازی شده بومی توانایی خوبی برای رشد در محیط‏های با غلظت‏های نمکی متفاوت نشان داند و توانستند به نمک طعام با غلظت 5/1 و 5/2 درصد (وزنی/حجمی) مقاومت کنند. بهترین رشد در غلظت نمکی 5/1 درصد است و این نتیجه مشابه یافته‏های هوگو و همکاران و الزته و آر.اس.[xi] بود (8 و 17). آتاسور و ادی گزل[xii]نیز گزارش کردند که همگی باکتری‏های اسیدلاکتیک جداشده از سوسیس در غلظت 5/2 و 4 درصد نمک رشد کردند (7). بررسی‏های ساندرز[xiii] بر روی لاکتوکوکوس لاکتیس نشان داد که تحت شرایط تنش 5/2 درصد نمک (مقدار نمک موجود در برخی از انواع پنیر)، میزان رشد از 25 تا 50 درصد نسبت به شرایط بدون تنش کاهش می‏‏یابد و همچنین سنتز پروتئین‏ها تا حدود 50 درصد تنزل می‏‏کند. درحالی‏که در باکتری‏های مقاوم به غلظت‏های بالاتر نمک، سنتز حداقل 12 پروتئین تحریک می‏‏شود که این پروتئین‏ها به نام پروتئین‏های تحریکی- نمکی شناخته می‏‏شوند. همچنین این باکتری‏ها می‏‏توانند به وسیله شوک حرارتی نیز تحریک شوند. ClpP یکی از پروتئین‏های شوک حرارتی است که حین تنش نمک تحریک می‏‏شود و پس از 10 دقیقه قرار گرفتن در محیط غلظت نمک 5/2 درصد، 4 پیچش اضافی در ساختمان این پروتئین ایجاد می‏‏شود. این موضوع مطرح شده است که در سویه‏های مقاوم به نمک لاکتوکوکوس لاکتیس، اجتماع نامناسب پروتئین‏های غشا، باعث ایجاد یک سد دفاعی برای تحمل به نمک در باکتری است (18).

تحمل دمایی

باکتری‏های اسیدلاکتیک دامنه تحمل دمایی متفاوتی دارند. از باکتری‏های سایکروتروف با دامنه دمایی 25 تا 30 درجه سانتی‏گراد، باکتری‏های مزوفیل با رنج دمایی 30 تا 40 درجه سانتی‏گراد و همچنین ترموفیل‏ها با بهینه دمای رشد 55 تا 75 درجه سانتی‏گراد گسترده هستند. باکتری‏های اسیدلاکتیک جداسازی شده از نمونه‏های لبنی استان دارای رنج دمایی متفاوتی هستند. این جدایه‏ها به خوبی در دمای37 و 30 درجه سانتی‏گراد رشد کردند. از بین سویه‏های جداسازی شده 13 سویه جداسازی شده شامل باسیل‏های کوتاه و بلند توانایی رشد در دمای 15 درجه سانتی‏گراد را داشتند و 30 جدایه در دمای 45 درجه سانتی‏گراد رشد کردند. این نشان می‏‏دهد که باکتری‏هایاسیدلاکتیک جداسازی شده از نمونه‏های ماست و پنیر بومی استان چهارمحال و بختیاری بیشتر از گونه‏های مزوفیل بودند. این نتیجه مغایر با گزارشی است که در آن گونه‏هایمزوفیل گونه‏های غالب باکتری‏های اسید لاکتیک در پنیرلیقوانهستند (19).

فعالیتاسیدیسویه‏ها

ازمهم‏ترینشاخص‏هایدخیلدر مقبولیتفرآورده‏هایلبنی تخمیری از جمله ماست و پنیر،خصوصیت‏هایبافتیآن‏هااست که شروع لخته شدن کازئین ‏شیر با اضافه کردن کشت‏های آغازگر و تولید اسید لاکتیک و در نهایت پایین آمدن اسیدیته‏ تا محدوده 6/4 آغاز می‏‏شود. نخستینوظیفهکشتآغازگرتبدیلتخمیریقندشیربه تولیداتاسیدیاستکهبهماندگاری،طعم،مزهوساختار محصوللبنیتخمیریکمکمی‏‏کند (16). لاکتوباسیل‏ها قادرند اسیدیته‏ مواد غذایی را که دارای یک کربوهیدرات قابل تخمیر هستند به 4 برسانند (11). مقدار اسیدیته قابل سنجش ماست نباید از 7/0 درصد بر حسب درصد وزنی/وزنی اسید لاکتیک کمتر باشد (16) (استاندارد ملی ایران شماره 695). باکتری‏های میله ای حدود 6/0. تا 8/0 درصد اسید لاکتیک تولید می‏‏کنند (11). اما میزان تولید اسید در سویه‏های جداسازی شده متفاوت بود که بدلیلشرایطوتواناییمتابولیکیسویه‏هایبکار رفته است. بهترین دمای رشد برای تولید اسید در باکتری‏های اسید لاکتیک جداشده برابر با 37 درجه سانتی‏گراد بود. این نتیجه با نتیجه گزارش شده توسط ‏هادادجی و بن سلطان[xiv] برای باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و بیفیدیوباکتریوم لانگوم جداسازی شده از نمونه‏های ماست فرانسه، بین 37 تا 45 درجه سانتی‏گراد، هم‏خوانی دارد (20).

در نهایت، مشخص شد که بیشترین تولید اسید در دمای 37 درجه سانتی‏گراد پس از گذشت 72 ساعت برابر با 83/1 درصد اسیدلاکتیک و اسیدیته‏ نهایی 61/3 است. درگزارش یالیانا و همکاران[xv] بیشترین مقدار تولید اسید لاکتیک پس از 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد‏‏ برابر با 62/0 درصد و اسیدیته‏ 79/3 آمده است (21). نتایج بدست آمده نشان داد تعدادباکتری‏های اسیدلاکتیکدرطیدورهتخمیربالا می‏رودولیباتوجهفعالیتباکتری‏ها،سرعتافزایشآن‏ها متفاوتاست و در نتیجه میزان تولید اسیدلاکتیک توسط این سویه‏ها متفاوت است. بررسی اخیر مشخص کرد که تولید اسیدلاکتیک با زمان انکوباسیون افزایش می‏‏یابد و این نتیجه در راستای گزارش هوگو و همکاران[xvi] ‏و محمود و همکاران[xvii] است (8 و 22).

کمترین مقدار تولید اسید 252/0 و اسیدیته‏ 32/5 برای باسیل جداسازی شده از منطقه دیگری است، پس می‏‏توان این طور نتیجه گرفت که این تفاوت بین تولید اسید لاکتیک توسط باکتری‏های اسید لاکتیک جدا شده از مناطق مختلف وجود دارد. این یافته با گزارش‏های ‏هادادین[xviii] تطبیق دارد. وی توضیح داد که سویه لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس جدا شده از شمال امریکا ممکن است به طور ژنتیکی با یک گونه مشابه در اروپا یا خاورمیانه متفاوت باشد (23). این نتیجه با نتایج هوگو و همکاران مطابقت ندارد به این دلیل که در میزان تولید اسید لاکتیک لاکتوباسیل‏های مناطق مختلف بنگلادش تفاوت معنی داری وجود ندارد (8).

در اسیدیته‏ 5، نزدیک به اسیدیته‏ ایزوالکتریک کازئین (6/4)، بافت مناسب ماست به دنبال افزایش پیوندهای هیدروفوب و تولید اسید لاکتیک ایجاد می‏شود. سویه‏هایی که اسیدیته‏ 6/4 را ایجاد کردند شامل 60/82 درصد بودند. این نتیجه با نتیجه واسیلن و همکاران[xix] همخوانی دارد که سویه‏های ‏صنعتی استرپتوکوکوس ترموفیلوس و لاکتوباسیلوس بولگاریکوس توانستند اسیدیته‏ 57/4 و میزان اسید لاکتیک 78/0 درصد را تیتر کردند (24).

تولید اسیدلاکتیک توسط لاکتوباسیلوس‏ها به سه عامل وابسته است، محیط کشت، اسیدیته‏ محیط مورد نظر برای تولید اسید و دمای گرمخانه‏گذاری. شرایط متفاوت خارج از سلول باکتری می‏‏تواند تأثیر مستقیم بر فعالیت کاتالیکی آنزیم‏ها (D یا ‏-Lلاکتات دهیدروژناز) یا تمایل آنزیم به سوبسترا (پیروات) داشته باشد (25).

مقدار بالای تولید اسید لاکتیک به دست آمده در این تحقیق پس از 72 ساعت گرمخانه‏گذاری و کشت یک ارگانیسم به دست آمد. درحالی که در صنعت به دلیل ترکیب 2 ارگانیسم کشت آغازگر به شکل همزمان در محیط شیر در مدت زمان کوتاه‏تری اتفاق می‏‏افتد و این به دلیل تأثیر سینرژیسمی دو ارگانیسم نسبت به یکدیگر است که رشد و تولید اسید را تحریک می‏‏کند. این مطابق با گزارشی است که لنگ کی و آدریانی[xx] منتشر کردند مبنی بر این‏که میزان تولید اسید هنگامی‏که 2 ارگانیسم کشت آغازگر با یکدیگر کشت داده شوند نسبت به زمانی که به شکل مجزا کشت داده شوند، بیشتر است (26).

یکی از خصوصیت‏های لاکتوباسیلوس‏ها توانایی تولید هر دو فرم انانتیومری L و D-لاکتات است، برای این منظور مقدار فرم L-لاکتات برای سویه ای که بیشترین تولید اسید را داشت پس از 72 ساعت با استفاده از کیت آنزیمی اندازه‏گیری شد که این میزان برابر با 8/6 گرم/ لیتر بود. پانسار با استفاده از لاکتوباسیلوس کازئی میزان L-لاکتات برابر 73/33 گرم بر لیتر پس از 36 ساعت را به دست آورد (13).

 

 

پیشنهادات

باکتری‏هایشناساییشدهدراین پژوهشمی‏‏تواننددرآیندهبهعنواناستارترویاکمکاستارتردرمحصولاتلبنیتخمیریباتوجهبهویژگیموردنیازفرآوردهبه کارروند. امااثرترکیبگونه‏هادرتولیدترکیباتمعطروافزایشکیفیتمحصولنیازبهآزمایش‏هایدقیق‏تردرواحد آزمایشگاهیدارد. بنابراین پیشنهاد می‏‏شود در مطالعات آینده بتواندرنخستین گام به وسیله روش‏های نوین تشخیصیبانک‏هایمیکروبیقابلقبولیاز این سویه‏های بومی مناطقبکرایجادکرده ‏و نیز تحقیقاتی بر پایه نحوه بکارگیری این باکتری‏ها، بهینه‏سازی در تولید بیشترین مقدار اسیدلاکتیک و همچنین شرایط دمایی متفاوت انجام شود و درمراحلبعدبابررسی ویژگی‏هاییافته‏ها،بهسویاستفادهصنعتیازآن‏ها حرکت کرد.

تشکر و قدردانی

از کلیه افرادی که ما را در انجام این تحقیق یاری نمودند به ویژه جناب آقای مهندس نظری مدیر محترم اداره کل استاندارد استان چهارمحال و بختیاری تشکر و قدردانی می شود.



[1] . Lactic Acid Bacteria

[2]. Lactobacillus

[3]. Pediococcus

[4]. Leuconostoc

[5].Lactococcus

[6]. Orla-jensen

[7]. De Man, Rogosa, Sharpe ‏

[viii]. Ibourahema et al.

[ix]. Pansar et al.

[x]. Rallu et al.

[xi]. Elizete and R.S.

[xii]. Adiguzel and Atasever

[xiii]. Sanders

[xiv]. Hadadji and Binsoltan.

[xv]. Yuliana et al.

[xvi]. Hoque et al.

[xvii]. Mehmood et al.

[xviii]. Haddadin.

[xix]. Vasilean et al

[xx]. Langkey et al.

References

(1)    Forghani F, Nazmi AS, Sharif Sh, Eskandari M. Isolation and molecular identification of lactic acid bacteria in raw milk Central Alborz heights using 16S rDNA PCR Sequencing and High Resolution Melting Real Time PCR. J. Microbial Biotech Research Islamic Azad University 1389; 2 (5): 21-28.

(2)      Lars A. Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology. In, Hoang-Dung T, Fennema O, HuiY, WalstraP, KarelM, et al. Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects, 3th ed. New York, USA, Marcel Dekker Inc. 2004, p 18-85.

(3) Abdallyzadeh, M. Farahani Vasheghani, Ps. Khodabandeh, M. Hashemi Najaf –Abadi S. Production of lactic acid fermentation in non-continuous optimization process whey by Lactobacillus casei bacteria. J. Food Sci 1389; 7 (2): 95-102.

(4) El Soda M, Ahmed N, Omran N, Osman G, Morsi A. Isolation, identification and selection of lactic acid bacteria cultures for cheesemaking. Emir. J. Agric.Sci. 2003; 15(2): 51-71.

(5) Abdullah A.S, Osman M.M. Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Raw Cow Milk, White Cheese and Rob in Sudan. Pakistan J. Nutrition 2010; 9(12): 1203-06.

(6) Abd El GawadI, Abd El Fatah A, Al Rubayyi K. Identification and Characterization of Dominant Lactic Acid Bacteria Isolated from Traditional Rayeb Milk in Egypt. J. American Sci 2010; 6(10): 728-35.

(7) Adiguzel G.C, Atasever M. Phenotypic and Genotypic Characterization of Lactic Acid Bacteria Isolated from Turkish Dry Fermented Susage. Romanian Society of Biological Sciences 2009; 14 (1): 4130-38.

(8) HoqueM. Z, Akter F, Hossain K.M, Rahman M.S, Billah M.M, Islam K.M.D. Isolation identification and analysis of probiotic properties of Lactobacillus Spp. From selective regional yoghurts. World J. Dairy & Food Sci 2010; 5 (1): 39-46.

(9) National Standard No. 2852 – milk and its products – Determination of acidity and pH-test 1385.

(10) Mirdamadi S, Sadeghi H, Sharafi N, Fallahpour M, Aziz Mohseni F, Bakhtiari M.R.Comparison of Lactic Acid Isomers Produced by Fungal and Bacterial Strains. Iranian Biomedical Journal 2002; 6 (3): 69-75.

(11)  M. J Jay, Lansr M, Goldenberg D. ModernFoodMicrobiology. As translator. Mortazavi H, Zyaalhq R. 2nd. ed. Mashhad: Mashhad Ferdowsi University Press 1389; 1, p 793.

(12)  Ibourahema C, Dauphin R, Jacqueline D, Thonart Ph. Characterization of Lactic Acid Bacteria Isolated from Poultry Farms in Senegal. African J. Biotech 2008; 7(12): 2006-2012.

(13)  Panesar P,Kennedy J,Knill Ch. Kosseva M. Production of L(+) Lactic Acid using Lactobacillus casei from Whey. Braz. Arch. Biol. Technol 2010; 53 (1) : 219-226.

(14)  Adams M.R, mouse M.A. Food Microbiology. As Translator. Mortazavi A, Sadeghi MahonakA. R. 4th.ed, Mashhad: Mashhad Ferdowsi University Press 1389; p 611.

(15)  Rallu F, Gruss A, Ehrlich D, Maguin E. Acid and multistress-resistant mutants of Lactococcus lactis: identification of intracellular stress signals. Molecular Microbiology 2000; 35(3): 517-28.

(16) National Standards No. 695 – our features and test methods 1387.

(17)  Elizete, D, R.S. C. Biochemical characterization and identification of probiotic Lactobacillus for swine. B.CEPPA. Curitiba 2005; 23 (2): 299-310.

(18)  Sanders J, Venema G, Kok J. Environmental stress responses in Lactococcus lactis. FEMS Microbiology Reviews 1999; 23: 483-501.

(19)  Ahmadi M, Khosrowshahi A, Kashanynzhad M. Isolation and identification of lactic bacterial flora Lighvan traditional cheese. Proceedings of the 18th National Congress of sciences and food industries; 1387 Apl 24-25; Mashhad, Iran.

(20)  Hadadji M, Bensoltane A. Growth and lactic acid production by Bifidobacterium longum and Lactobacillus acidophilus in goat’s milk. African J. Biotech 2006; 5 (6): 505-509.

(21)   Yuliana N, Rangga A, Rakhmiati E. Manufacture of fermented coco milk-drink containing lactic acid bacteria cultures. African J. Food Science 2010; 4(9): 558-562.

(22) Mehmood T, Masud T, Abbass A, Maqsud Sh. Isolation and Identification of Wild Strains of Lactic Acid Bacteria for Yoghurt Preparation from Indigenous Dahi. Pakistan J. Nutrition 2009; 8(6): 886-871.

(23) Haddadin J. Kinetic Studies and Sensorial Analysis of Lactic Acid Bacteria Isolated from White Cheese Made from Sheep Raw Milk. Pakistan J. Nutrition 2005; 4 (2): 78-84.

(24)  Vasilean I, Segal R, Vasile A. Obtaining Fermented Dairy Products with The Yogurt Culture YF-L 812. The Annals of the University Dunarea de Jos of Galati Fascicle VI – Food Technology 2011; 35(1): 92-99.

(25)  Tomas M, Ocana V, Wiese B, Nader-Macarias M. Growth and lactic acid production by vaginal Lactobacillus acidophilus CRL 1259, and inhibition of uropathogenic Escherichia coli. J. Med Microbiol 2003; 52 (12): 1117-24.

(26)   Lengkey H, Adriani L. Effects of Milk Fermented With Lactobacillus acidophilus And Bifidobacterium spp on Lactic Acid and Acetic Acid Contentand on Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa.Biotechnology in Animal Husbandry 2009; 25(5): 719-724.