بررسی ترکیب بهینه سین‏بیوتیکی بین باکتری پروبیوتیکی Pediococcus acidilactici و پربیوتیک‏های اینولین، الیگوفروکتوز و زایلوالیگوساکارید

نویسندگان

1 استادیار شیلات، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، ایران

2 دانشیار شیلات، دانشگاه تهران، ایران

3 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران،

4 استادیار تغذیه آبزیان، دانشگاه پلی‏موس، انگلستان

چکیده

مقدمه:استفاده هم‏زمان گونه‌های پروبیوتیکی به همراه پربیوتیک‌های مناسب (سین­بیوتیک) به عنوان سوبسترا برای افزایش غالبیت و رشد پایدار باکتری‏های پروبیوتیکی، به علت ناتوانی گونه‌های پروبیوتیکی برای تشکیل کلونی پایدار و حفظ غالبیت در میکروبیوتای روده‌ای آبزیان پیشنهاد شده است. هدف از این مطالعه، بررسی ترکیب­های مختلف سین­بیوتیکی باکتری پروبیوتیکی Pediococcusacidilactici با پربیوتیک­های اینولین، الیگوفروکتوز، زایلوالیگوساکارید به منظور معرفی بهترین ترکیب سین­بیوتیکی بود.
مواد و روش‏‏ها: باکتری P. acidilactici در محیط‏های حاوی پربیوتیک­های اینولین، الیگوفروکتوز و زایلوالیگوساکارید رشد داده شد. میزان رشد باکتری‏ها و اسیدیته نهایی محیط تحت شرایط کشت بی هوازی بررسی شد. به‏علاوه تعیین کمی مقادیر اسیدهای چرب زنجیره کوتاه (بوتریک، پروپیونیک و استیک اسید) تولید شده در هریک از تیمارهای سین­بیوتیکی با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا انجام شد.
نتایج: نتایج این مطالعه نشان داد که میزان رشد باکتری P. acidilactici در ترکیب سین‏بیوتیکی با زایلو‏الیگوساکارید به‏طور معنی­داری بیشتر از سایر تیمارهای سین­بیوتیکی و تیمار شاهد فاقد پربیوتیک بود (P value <0.05). سایر تیمارها تفاوت معنی­داری از نظر رشد باکتری نداشتند (P value >0.05). همچنین اسیدیته نهایی محیط نیز در تیمار
P.acidilactici با زایلو­الیگوساکارید کاهش معنی­داری در مقایسه با سایر تیمارها نشان داد (P value <0.05). بیش‏ترین و کم‏ترین اسید چرب زنجیره کوتاه تولیدی در همه تیمار­های سین­بیوتیکی به ترتیب پروپیونیک و استیک اسید بودند. اگرچه مقادیر تولید شده استیک و پروپیوتیک اسید تفاوت معنی­داری بین تیمارهای سین­بیوتیکی نشان نداد (P value > 0.05)، بیشترین میزان بوتریک اسید تولید شده مربوط به تیمار P. acidilactici با زایلو الیگوساکارید بود که اختلاف معنی­داری با سایر تیمارها داشت (P value <0.05).
بحث و نتیجهگیری: نتایج این مطالعه نشان داد که استفاده همزمان از باکتری پروبیوتیکی P. acidilactici و زایلو‏الیگوساکارید، می‏تواند به عنوان ترکیب سین بیوتیکی برای آبزیان بهینه مطرح باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Determination of the best synbiotic between probiotic bacteria Pediococcus acidilactici and prebiotics inulin, oligofructose and xylooligosaccharide

نویسندگان [English]

  • Seyed Hossein Hoseinifar 1
  • Alireza Mirvaghefi 2
  • Mohammad Ali Amoozegar 3
  • Daniel Merrifield 4
1 Assistant Professor of Fisheries, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Iran
2 Associated Professor of Fisheries, University of Tehran, Karaj, Iran
3 Associate Professor of Microbiology, University of Tehran, Iran
4 Assistant Professor of Fisheries, The University of Plymouth, UK
چکیده [English]

Introduction: Inability of probiotic bacteria for stable colonization and dominance in intestinal microbiota of aquatic animals, combination of  administration with proper prebiotics (Synbiotic) as substrate for increasing growth and stable domination have been suggested. The aim of the present study was determination of the best synbiotic between a probiotic bacteria, P. acidilactici and prebiotics, inulin, oligofructose and xylooligosaccharide.
Materials and methods: P. acidilactici was cultured in media containing inulin, oligofructose and xylooligosaccharide as prebiotic. Growth of bacteria and final pH of media were determined in each treatment under anaerobic culture. In addition, short chain fatty acids (Butyric, Propionic and Acetic acid) productions in synbiotic treatments were measured using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) system.
Results: Our results revealed that bacteria growth in P. acidilactici with XOS treatments was significantly higher compared to the other synbiotics and to the control groups (P < 0.05). There were no significant differences between other treatments regarding bacteria growth (P > 0.05). Moreover, final pH of media in P. acidilactici with XOS group was significantly lower when compared to the other treatments (P < 0.05). The highest and lowest SCFA produced in all synbiotic treatments were propionic and acetic acid, respectively. While acetic and propionic production showed no significant variation between treatments (P > 0.05), the highest production of butyric acid was observed in P. acidilactici with XOS treatment (P < 0.05).
Discussion and conclusion: The results of this study confirmed that simultaneous administration of in P. acidilactici and XOS could be a potential optimum synbiotic.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Probiotic
  • P. acidilactici
  • Synbiotic
  • Growth
  • SCFA

مقدمه

تا به امروز مهم‏ترین پربیوتیک‏های مورد مطالعه در مطالعات انسانی و دامی فروکتان‏های بدست آمده از ریشه گیاه کاسنی، اینولین و الیگوفروکتوز بوده اند(1 و 2). علاوه براین دو مورد، سایر الیگوساکاریدها مانند زایلو­الیگوساکارید بدست آمده از مواد غنی از زایلان به عنوان کربوهیدارت­های غیر قابل هضم ولی قابل تخمیر در نظر گرفته می‏شوند که ممکن است اثرات مشابه و یا حتی بهتری را نسبت به این دو پربیوتیک شناخته شده نشان دهند (3). با وجود این، هنوز تولید و استفاده از این دسته از پربیوتیک­ها چندان شایع نشده است (4). سایر الیگوساکاریدهای غیرقابل هضم با اثرات بالقوه پربیوتیکی (اثر گزینشی بر تخمیر روده­ای) شامل گالاکتوالیگوساکارید، لاکتولوز، ایزومالتوالیگوساکارید، لاکتوساکارز، الیگوساکارید سویا و گلوکوالیگوساکارید هستند. اگرچه مطالعات بی‏شماری در زمینه اثرات مفید پربیوتیک یا الیگوساکاریدهای غیر­قابل هضم در انسان­ها و حیوانات اهلی انجام شده، ولی گزارش‏های محدودی در زمینه جانوارن آبزی و بخصوص ماهی­ها وجود دارد (5). میکروبیوتای روده­ای ماهی برای اولین بار توسط کاهیل[1](6)بررسی شده است که نتایج این مطالعه حاکی از وجود ارتباط مشخص بین میکروبیوتای روده ای و محیط آبی پیرامون است. همچنین گزارش شده است که باکتری­های پروبیوتیکی آن‏ها متعلق به جنس­هایی متفاوت نسبت به جانوارن خشکی‏زی است. باکتری­های گرم منفی در روده ماهی غالب هستند ولی برخی از باکتری­های گرم مثبت نیز (گونه­هایی از باکتری­های اسید لاکتیک) در آن مشاهده می‏شوند (7). بعلاوه، درحالی‏که روده بزرگ در انسان­ها شرایطی بی­هوازی داشته و توسط باکتری­های بی هوازی اجباری جا‏گذاری شده است، روده ماهی شامل باکتری‏های هوازی و بی‏هوازی اختیاری است (8). بنابراین، بیشتر باکتری­های پروبیوتیکی در گونه­های آبزی، متفاوت با جانوران خشکی­زی هستند (9). بیشتر پروبیوتیک­های مورد استفاده در آبزی­پروری شامل باکتری­های اسید لاکتیک، باسیلوس­های اسپور­دار و مخمرهاست (10). باکتریPediococcusacidilacticiنیز که جزو خانواده لاکتوباسیلوس­هاست به­عنوان پروبیوتیک برای ماهی قزل­آلای رنگین­کمان (11)، تیلاپیای نیل (12)، توربوت (13)،میگوی Litopenaeus stylirostris (14)استفاده شده است و اثرات سودمند آن بر شاخص‏های ایمنی غیر­اختصاصی، میکروبیوتای روده­ای و مقاومت این گونه‌ها مشخص شده است.

اگرچه تاکنون کوشش شده است که جوامع باکتریایی مانند کارنوباکتریوم و لاکتوباسیلوس‏ها در لوله گوارش ماهی از طریق بکارگیری گونه­های باکتریایی پروبیوتیکی افزایش یابند، اما سویه­های پروبیوتیکی قادر به حفظ غالبیت پس از حذف از جیره غذایی نبودند (15 و 16). برای حل این مشکل راهبرد نوینی تحت عنوان سین­بیوتیک مطرح شده است که در آن برای کمک به حفظ غالبیت باکتری­های پروبیوتیکی در میکروبیوتای روده­ای ماهی از پربیوتیک­ها یا الیگوساکاریدهای غیر قابل هضم استفاده می‏شود (17). اثر سین­بیوتیکی مستلزم توانایی باکتری پروبیوتیکی برای تخمیر پربیوتیک است که متأثر از درجه پلیمریزاسیون آن است (18). به همین علت برای معرفی یک ترکیب سین­بیوتیکی، بررسی قابلیت تخمیر و رشد باکتری تحت تأثیر پربیوتیک به­عنوان سوبسترا باید در نظر گرفته شود (5). با وجود این، تا به امروز تنها در یک مطالعه ‏آزمایشگاهی ترکیب سین­بیوتیکی برخی از باکتری‏های پروبیوتیکی مورد استفاده در آبزی با پربیوتیک‏ها رایج بررسی شده (17) و مطالعات انجام شده در زمینه کاربرد سین­بیوتیک‏ها فاقد چنین پشتوانه آزمایشگاهی است.

به همین علت، در این مطالعه ترکیب سین­بیوتیکی یکی از پروبیوتیک­های موثر در آبزی­پروری با پربیوتیک­های رایج بررسی شده است تا با استفاده از شاخص­های رشد و تولید اسید­های چرب زنجیره کوتاه تولیدی ترکیب بهینه سین­بیوتیکی تعیین شود.

 

مواد و روش‏ها

پربیوتیک‏های مورد بررسی

پربیوتیک­هایی که در این مطالعه در ترکیب سین‏بیوتیکی بررسی شدند دارای میانگین درجه پلیمریزاسیون مختلفی بودند: اینولین 25، الیگوفروکتوز 4، زایلوالیگوساکارید 3 (17). زایلوالیگوساکارید از زایلان ذرت بدست آمده و از شرکت لانگ لایف چین تامین شد. اینولین از ریشه گیاه کاسنی و الیگوفروکتوز از هیدرولیز آنزیمی نسبی اینولین بدست آمد
(Beno, Belgium).

سویه پروبیوتیکی مورد بررسی

پروبیوتیک مورد بررسی باکتری P. acidilacticiبود که پیش‏تر اثرات پروبیوتیکی آن بر بسیاری از گونه‏های آبزی و جانوران خشکی‏زی دیگر به اثبات رسیده است (11، 12، 14، 19 - 22). این باکتری جزو خانواده لاکتوباسیلوس‏ها بوده و کوکسی گرم مثبت است که به شکل جفتی یا چهارتایی (تتراد) دیده می‏شود (23). باکتری مذکور از کشور فرانسه (Bactocell, France) به شکل لیوفیلیزه تأمین و صحت آن از طریق توالی­یابی ژن S rRNA16 تأیید شد.

بررسی رشد باکتری در تیمارهای سین بیوتیکی

برای بررسی توانایی مصرف پربیوتیک‏های مختلف و رشد باکتری پروبیوتیکی P. acidilactici تحت شرایط بی هوازی ابتدا تعداد 7 ارلن (به عنوان stock) هر کدام حاوی 90 سی سی محیط brothmMRS(برای 30 لوله آزمایش بازای هر تیمار) تهیه و اتوکلاو شد. پربیوتیک­ها نیز به شکل جداگانه اتوکلاو و به محیط اضافه شد. همچنین یک تیمار بدون پربیوتیک هم به عنوان شاهد درنظر گرفته شده که به ارلن­ها به همان میزان آب مقطر اضافه شد. میزان 2/0 درصد حجم محیط برای هر تیمار سدیم تیوگلیکولیت به شکل تازه تهیه و پس از اتوکلاو شدن به شکل جداگانه تحت شرایط استریل به محیط­ها اضافه شد (برای بی هوازی کردن محیط) (24 و 25). محیط آماده شده پس از افزودن پربیوتیک­ها و سدیم تیوگلیکولیت (به میزان 3 سی سی) به 10 لوله آزمایش (به ازای هر نمونه برداری یک لوله مدنظر قرار گرفت) انتقال داده شد. به منظور اطمینان از ایجاد شرایط بی­هوازی به میزان یک سی­سی پارافین روی محیط­ها ریخته شد (24). پس از اتمام آماده­سازی تیمارهای آزمایشی در لوله­ها، محیط­ها با رقتی معادل 108× 5/1 از باکتریP. acidilactici (کشت 24 ساعته) رشد یافته روی محیط کشت MRS آگار تلقیح و در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوباسیون شدند. برای تعیین میزان رشد باکتری P. acidilactici در هریک از تیمارها، نمونه برداری و تراکم سنجی نوری با استفاده دستگاه اسپکتروفوتومتر (Shimadzo, Japan) انجام شد (17). همچنین در انتهای آزمایش اسیدیته متری در همه تیمارهای آزمایشی برای تعیین اسیدیته نهایی محیط‏ها انجام شد.

بررسی میزان تولید اسیدهای چرب زنجیره کوتاه در هریک از تیمارهای سین­بیوتیکی

برای تعیین کمی میزان اسیدهای چرب زنجیره کوتاه (استیک، پروپیونیک و بوتریک اسید) تولید در انتهای فاز تصاعدی رشد نمونه برداری انجام و مقادیر اسیدهای چرب با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی مایع با کاریی بالا (HPLC) و براساس روش ری کرافت[2] و همکاران (26) تعیین شد. در انتهای فاز لگاریتمی رشد (براساس ترسیم منحنی رشد تعیین شد.) 2 سی­سی از محیط­ها به درون میکروتیوب انتقال داده شد. برای حصول سوپرناتانت حاوی متابولیت­های تولیدی در هریک از تیمار­های سین­بیوتیکی، میکروتیوب‏ها در سانتریفیوژ یخچال دار (4 درجه سانتی­گراد) به مدت 20 دقیقه در 11000 دور سانتریفیوژ و سپس سوپرناتانت به میکروتیوب‏های دیگری منتقل شد. 20 میکرولیتر از سوپرناتانت به دستگاه کروماتوگرافی گازی متصل به دتکتور U.V در طول موج 210 نانومتر تزریق شد. ستون مورد استفاده از نوع ion-exclusion Aminex HPX-87H(طول 300×8/7 میلی متر) بود (26). فاز متحرک اسید سولفوریک 005/0 مول در لیتر آب مخصوص HPLC بود که با نرخ جریان 6/0 میلی لیتر در دقیقه به درون ستون پمپ شد (26). کمی کردن داده از طریق رسم منحنی استاندارد برای استات، پروپیوتات و بوتریات انجام شد.

تجزیه و تحلیل داده‏ها

برای مقایسه بین تیمارها و نیز تعیین وجود اختلاف معنی­دار بین تیمارها در سطح احتمال (P value <0.05) از تحلیل واریانس یک طرفه ANOVA[3] و آزمون چند دامنه‌ای دانکن (Duncan's multiple-range test) استفاده شد (27). تمام تحلیل‏های آماری با استفاده از نرم افزار SPSS (ویرایش 13) و ترسیم نمودارها با استفاده از نرم افزار Excel 2007 در محیط ویندوز انجام شد.

 

نتایج

توانایی تخمیر و مصرف پربیوتیک­ها تحت شرایط بیهوازی

منحنی رشد باکتری P. acidilactici در تیمارهای مختلف سین­بیوتیکی در شکل 1 نشان داده شده است. مدت زمان فاز تأخیری در همه تیمار­های آزمایشی در حدود 9 ساعت بود. فاز تصاعدی رشد از 9 ساعت پس از تلقیح شروع شده و تا 18 ساعت ادامه داشت. در بین تیمارهای سین­بیوتیکی مورد بررسی، بیشترین میزان رشد باکتری در تیمار سین­بیوتیکی پروبیوتیک
 P. acidilactici با زایلو­الیگوساکارید مشاهده شد. پس از این تیمار بیشترین رشد نسبت به سایر تیمارها مربوط به تیمار حاوی پربیوتیک زایلوالیگوساکارید بود. سایر تیمارها روند و میزان رشد مشابهی داشتند و تفاوت چندانی نشان ندادند.

 

 

 

شکل 1- منحنی رشد باکتری P. acidilacticiتحت شرایط تخمیری در تیمار­های مختلف سین­بیوتیکی

 

 

مقایسه آماری بیشینه رشد مشاهده شده (بیشینه کدورت­سنجی نوری) بین تیمارهای مختلف سین بیوتیکی در جدول 1 ارائه شده است. بیشینه رشد مشاهده شده در تیمار سین­بیوتیکی P. acidilactici با زایلو­الیگوساکارید به‏طور معنی­داری بیشتر از سایر تیمار‏ها بود (P value <0.05). سایر تیمارهای سین‏بیوتیکی اختلاف معنی­داری با گروه شاهد که فاقد پربیوتیک بود نشان ندادند (P value >0.05).

 

 

جدول 1- بیشینه رشد (براساس کدورت سنجی در طول موج 600 نانومتر) باکتری P. acidilacticiدر تیمار­های مختلف سین‏بیوتیکی.

 

شاهد

اینولین

الیگوفروکتوز

زایلوالگوساکارید

بیشینه رشد

(براساس کدورت سنجی نوری)

a 013/0± 16/1

a 09/0± 15/1

a 02/0± 17/1

b10/0± 75/1

اعداد نشانه گذاری شده در یک ردیف با حروف لاتین متفاوت دارای اختلاف معنی دار هستند (05/0> P value).

 

 

در انتهای نمونه­برداری، اسیدیته محیط­های کشت اندازه­گیری شد تا تولید محصولات اسیدی (اعم از اسید­لاکتیک و اسیدهای چرب زنجیره کوتاه) بررسی شود. در ابتدای شروع آزمایش اسیدیته محیط­های براساس یافته­های سابق در زمینه بهینه‏سازی رشد باکتری P. acidilacticiدرحد 8/5 تنظیم شد (28). در انتهای دوره، کمترین اسیدیته در تیمار سین­بیوتیکی
 P. acidilactici با زایلو­الیگوساکارید مشاهده شد که اختلاف معنی­داری با سایر تیمارها داشت
(P value <0.05) (شکل 2). پس از این تیمار، کاهش معنی­دار اسیدیته نسبت به سایر تیمارها در تیمار
 P. acidilactici با الیگوفروکتوز مشاهده شد
(P value <0.05). به‏طور کلی در انتهای دوره همه تیمارهای سین­بیوتیکی مورد بررسی با محیط شاهد فاقد پربیوتیک و محیط تلقیح نشده که تحت شرایط مشابه نگهداری شده بود اختلاف معنی دار داشتند
(P value <0.05).

 

 

شکل 2- اسیدیته نهایی محیط­ها در هریک از تیمار­های سین­بیوتیکی ‏پس از 24 ساعت کشت بی­هوازی؛ ستون­ها نشانه­گذاری شده با حروف لاتین متفاوت دارای اختلاف معنی­دار هستند (P value <0.05).

 


تولید اسید­های چرب زنجیره کوتاه

برای تعیین کمی میزان اسیدهای چرب زنجیره کوتاه تولیدی با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در هریک از تیمارهای سین­بیوتیکی ابتدا استانداردهای اسیدهای مدنظر (لاکتیک، بوتریک، پروپیوتیک و استیک) به دستگاه تزریق شد. زمان ظهور پیک هریک از اسیدهای چرب زنجیره کوتاه و اسید لاکتیک به ترتیب به شکل ذیل بود: لاکتیک اسید 51/15، بوتریک اسید 13/13، پروپیونیک اسید 08/18 و استیک اسید 95/21 دقیقه

پس از بدست آوردن زمان ظهور پیک مربوط به هریک از اسیدهای چرب منحنی استاندارد با استفاده از تزریق رقت­های مختلف استاندارد ترسیم شد. تعیین میزان تولید هریک از اسیدهای چرب زنجیره کوتاه براساس محاسبه سطح زیر منحنی کروماتوگراف و قرار دادن آن در فرمول بدست آمده برای منحنی استاندارد انجام شد. در شکل3 و 4 کروماتوگراف بدست آمده برای تیمار سین­بیوتیکی باکتری P. acidilacticiبا زایلوالیگوساکارید و گروه شاهد فاقد پربیوتیک ارائه شده است. همانطور که در کروماتوگراف ملاحظه می‏شود بیشترین اسید چرب زنجیره کوتاه تولیدی پروپیونیک بوده است. کمترین اسید چرب زنجیره کوتاه در همه تیمار­های سین­بیوتیکی استیک اسید بود.


1

 

2

 

4

 

3

شکل 3- منحنی کروماتوگراف بدست آمده برای تیمار شاهد فاقد پربیوتیک؛ 1، بوتریک اسید؛ 2، لاکتیک اسید؛ 3، پروپیونیک اسید؛ 4، استیک اسید

 

4

 

2

 

3

 

1

شکل 4- منحنی کروماتوگراف بدست آمده برای تیمار سین­بیوتیکی باکتری P. acidilactici با زایلوالیگوساکارید 1، بوتریک اسید؛ 2، لاکتیک اسید؛ 3، پروپیونیک اسید؛ 4، استیک اسید

 

 

مقادیر کمی محاسبه شده برای تولید اسید­های چرب زنجیره کوتاه در هریک از تیمارهای سین­بیوتیکی و مقایسه آماری آن‏ها در شکل 5 ارائه شده است. همان‏طور که در شکل ملاحظه می‏شود اگرچه بیشترین اسید چرب زنجیره کوتاه تولیدی در همه تیمارها پروپیونیک بوده است، ولی هیچ اختلاف معنی­داری بین تیمارهای سین‏بیوتیکی و تیمار شاهد فاقد پربیوتیک وجود نداشت (P value >0.05). روند مشابهی در خصوص استیک اسید مشاهده شد. میزان تولید بوتریک اسید در تیمار سین­بیوتیکی باکتری P. acidilacticiبا زایلوالیگوساکارید به طور معنی­داری بیشتر از سایر تیمارها بود (P value <0.05). با وجود این، سایر تیمارها تفاوت معنی­داری از نظر میزان تولید بوتریک‏اسید نشان ندادند (P value >0.05).


 

 

شکل 5- مقادیر اسید­های چرب زنجیره کوتاه تولیدی در هریک از تیمارهای سین­بیوتیکی پس از 18 ساعت کشت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد (برحسب میلی مول بر لیتر). ستون­های نشانه­گذاری شده با حروف لاتین متفاوت دارای اختلاف معنی­دار هستند
(P value <0.05).

 

 

بحث ‏و نتیجه گیری

مصرف آنتی بیوتیک­ها به شکل خودسرانه برای پیشگیری از بروز بیمار­ها در آبزیان به ظهور باکتری‏های مقاوم در برابر آنتی بیوتیک منجر شده است. به همین علت در ‏بسیاری از کشورها قوانین بسیار سخت و اکیدی در زمینه استفاده از آنتی بیوتیک‏ها وضع شده است (29). یکی از این راه‏ها حل این مشکل استفاده از مکمل‏های غذایی چون پروبیوتیک، پربیوتیک و سین‏بیوتیک است که اثرات سومندی بر ایمنی و مقاومت در برابر بیماری میزبان دارند (30). باوجود بررسی اثرات پربیوتیک­ها و پروبیوتیک­های مختلف، اطلاعات محدودی در زمینه سوبسترای ترجیهی هریک از باکتری‏های پروبیوتیکی برای انتخاب ترکیب بهینه سین بیوتیکی وجود دارد (17). بررسی رشد باکتری
 P. acidilacticiتحت تیمار­های مختلف سین­بیوتیکی با پربیوتیک­های مختلف نشان داد که بیشترین میزان رشد پروبیوتیک مذکور مربوط به تیمار سین­بیوتیکی با زایلوالیگوساکارید است که دارای کمترین درجه پلیمریزاسیون بود. مطالعه منتشر شده ای درخصوص بررسی رشد باکتری P. acidilactici در تیمار سین‏بیوتیکی با پربیوتیک­های رایج وجود ندارد. تنها در یک مطالعه مندال[iv] و همکاران ‏گزارش کردند که استفاده از پربیوتیک­های مانیتول، مالتودکتسروز و سوربیتول در ترکیب سین­بیوتیکی با P. acidilactici اثری بر رشد باکتری نداشت. پربیوتیک‏ها استفاده شده در مطالعه مذکور جزو پربیوتیک‏ها شناخته شده و کارا نبودند. باوجود اطلاعات محدود و گاهی متناقض در زمینه گونه‏های مختلف باکتریایی، مطالعات نشان داده است که باکتری Carnobacterium piscicolaنیز قادر به تخمیر پربیوتیک با درجه پلیمریزاسیون بالا نیست (31). قابلیت استفاده و تخمیر پربیوتیک­های متأثر از درجه پلیمریزاسیون آن‏هاست (4 و 32). به‏طوری‏که با افزایش درجه پلیمریزاسیون سرعت تخمیر کند می‏شود که این مورد خود می­تواند سبب انباشت پربیوتیک و اثرات مضر شود (33). بنابراین استفاده از پربیوتیک­ها در ترکیب­های سین­بیوتیکی باید با دقت و براساس پشتوانه مطالعات آزمایشگاهی انجام شود.

همانطور که در بخش نتایج بیان شد تولید اسیدهای چرب زنحیره کوتاه (استیک، پروپیونیک و بوتریک اسید) در همه تیمارهای سین بیوتیکی مشاهده شد. بیشترین اسید چرب زنجیره کوتاه تولیدی در همه تیمارها، پروپیونیک اسید بود. اگرچه تاکنون گزارشی در خصوص تولید اسید­های چرب زنجیره کوتاه توسط باکتری P. acidilacticiتحت شرایط تخمیری و در اثر مصرف سوبسترای پربیوتیکی ارائه نشده است، در مطالعه آزمایشگاهی انجام شده توسط رورنگاوا[v] و همکاران (17) در زمینه ترکیب­های مختلف سین­بیوتیکی آبزیان مهم‏ترین اسید چرب زنجیره کوتاه تولید شده در همه تیمارهای سین‏بیوتیک استیک اسید بود. همچنین یافته‏های این مطالعه نشان داد که در تیمار سین‏بیوتیکی که بیشترین رشد باکتری مشاهده شد تولید بوتریک اسید به‏طور معنی‏داری بیشتر از سایر تیمارها بود. تفاوت نتایج مطالعه حاضر با مطالعه یاد شده، ممکن است ناشی از تفاوت در نوع پربیوتیک استفاده شده به عنوان سوبسترا و نیز سویه پروبیوتیکی مورد استفاده باشد. اگرچه در همه تیمارهای سین­بیوتیکی مورد بررسی در مطالعه رورنگاوا و همکاران (17) میزان تولید بوتریک اسید پایین بود، اما در مطالعه انجام شده در زمینه اثرات پربیوتیک فروکتوالیگوساکارید بر تولید اسیدهای چرب زنجیره کوتاه توسط میکروبیوتای روده­ای موش (34) مقادیر تولید بوتریک اسید در تیمار فرکتوالگوساکارید به‏طور معنی­داری بیشتر از تیمار شاهد بود؛ درحالی‏که سایر اسیدهای چرب زنجیره کوتاه تفاوت معنی‏داری نشان ندادند. مشخص شده است که اسید­های چرب زنجیره کوتاه و بخصوص بوتریک اسید از طریق اتصال به برخی از گیرنده­های موجود در سطح اجزا دستگاه ایمنی قادر به تحریک ایمنی هستند (35). بنابراین، با توجه به افزایش معنی­دار تولید بوتریک اسید در تیمار سین‏بیوتیکی P. acidilacticiبا زایلوالیگوساکارید، این ترکیب پتانسیل افزایش ایمنی و مقاومت در برابر بیماری ماهیان و سایر جانواران و به تبع آن کاهش مصرف آنتی­بیوتیک­ها را دارد. همچنین اسیدها چرب زنجیره کوتاه به عنوان عوامل ضد سرطان مطرح بوده و نیز به عنوان یک منبع انرژی برای انتروسیت‏ها روده نقش ایفا می‏کنند. از طرفی ورود اسید‏های چرب زنجیره کوتاه به روده سبب افزایش جریان خون می‏شود که به نظر می‏رسد افزایش جریان خون به اکسیژن رسانی بهتر به بافت‏ها و انتقال مواد مغذی منجر شده و به تبع آن باعث بهبود وضعیت فیزیولوژیک دستگاه گوارش می‏شود که از این جهت نیز نتایج بدست آمده حائز اهمیت است.

در مجموع، نتایج این مطالعه حاکی از آن است که در بین ترکیب­های سین­بیوتیکی بررسی شده، بهینه‏ترین ترکیب سین­بیوتیکی استفاده از پروبیوتیک
P. acidilactici به همراه زایلو الیگوساکارید است. این پربیوتیک پتانسیل استفاده به عنوان سوبسترا برای افزایش رشد و فعالیت باکتری پروبیوتیکی موردنظر را دارد. بررسی کارایی این ترکیب­سین بیوتیکی در شرایط روده آبزیان و سایر جانوران و مقایسه آن با استفاده جداگانه از هرکدام از این پروبیوتیک و پربیوتیک‏ها باید به منظور تایید اثر هم­افزایی (سینرژیسم) در مطالعات آتی مدنظر قرار گیرد. همچنین، بررسی کنش­های متقابل بین جوامع میکروبی بومی روده با ترکیب سین­بیوتیکی معرفی شده نیز نیازمند تحقیقات بیشتری است. ‏

تشکر و قدردانی

از جناب آقای دکتر رضایی، دانشیار گروه صنایع غذایی دانشگاه تهران، مهندس علی مویدی، متیو کاستکس نماینده شرکت باکتوسل و همچنین از سرکار خانم علوی و مهرشاد که با مساعدت‌هایشان راه را در انجام این مطالعه هموار نمودند تشکر و قدردانی می‏شود.

 

 

 

 

 

 



[1]. Cahill

[2]. Rycroft

[3]. one-way analysis of variance (ANOVA)

[iv]. Mandal

[v]. Rurengawa

References

(1) Niness KR. Inulin and oligofructose: What are they? J Nutr 1999; 129(7): 1402S-6S.

(2) Flickinger EA, Van Loo J, Fahey GC. Nutritional responses to the presence of inulin and oligofructose in the diets of domesticated animals: a review. Crit Rev Food Sci Nutr 2003; 43(1): 19-60.

(3) Vázquez MJ, Alonso JL, Domı́nguez H & Parajó J. Xylooligosaccharides: manufacture and applications. Trends in Food Science &amp; Technology 2000; 11(11): 387-93.

(4) Roberfroid M. Prebiotics: the concept revisited. The Journal of nutrition 2007; 137(3): 830S.

(5) Ringø E, Olsen RE, Gifstad Tø, Dalmo RA,Amlund H, Hemre G.-I, et al. Prebiotics in aquaculture: a review. Aquaculture Nutrition 2010; 16(2): 117-36.

(6) Cahill MM. Bacterial flora of fishes: a review. Microbial ecology 1990; 19(1): 21-41.

(7) Ringø E, Gatesoupe F-J. Lactic acid bacteria in fish: a review. Aquaculture 1998; 160(3-4): 177-203.

(8) Ringø E, Strøm E, Tabachek J. Intestinal microflora of salmonids: a review. Aquaculture Research 1995; 26(10): 773-89.

(9) Gatesoupe FJ. The use of probiotics in aquaculture. Aquaculture 1999; 180(1-2): 147-65.

(10) Gatesoupe FJ. Updating the importance of lactic acid bacteria in fish farming: Natural occurrence and probiotic treatments. J Mol Microbiol Biotechnol 2008; 14(1-3): 107-14.

(11) Merrifield D, Bradley G, Harper G, Baker R, Munn C, Davies S. Assessment of the effects of vegetative and lyophilized Pediococcus acidilactici on growth, feed utilization, intestinal colonization and health parameters of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum). Aquaculture Nutrition 2011; 17(1): 73-9..

 

(12) Ferguson RM, Merrifield DL, Harper GM, Rawling, MD, Mustafa S, Picchietti S, et al. The effect of Pediococcus acidilactici on the gut microbiota and immune status of on-growing red tilapia (Oreochromis niloticus). Journal of Applied Microbiology 2010; 109(3): 851-62.

(13) Villamil L, Figueras A, Planas M, & Novoa B. Control of Vibrio alginolyticus in Artemia culture by treatment with bacterial probiotics. Aquaculture 2003; 219(1-4): 43-56.

(14) Castex M, Chim L, Pham D, Lemaire P, Wabete N, Nicolas JL, et al. Probiotic P. acidilactici application in shrimp Litopenaeus stylirostris culture subject to vibriosis in New Caledonia. Aquaculture 2008; 275(1): 182-93.

(15) Panigrahi A, Kiron V, Puangkaew J, Kobayashi T, Satoh S, Sugita H. The viability of probiotic bacteria as a factor influencing the immune response in rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Aquaculture 2005; 243(1-4): 241-54.

(16) Robertson P, O'Dowd C, Burrells C, Williams P, Austin, B. Use of Carnobacterium sp. as a probiotic for Atlantic salmon (Salmo salar L.) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum). Aquaculture 2000; 185(3-4): 235-43.

(17) Rurangwa E, Laranja JL, Van Houdt R, Delaedt Y, Geraylou Z, Van de Wiele T, et al. Selected nondigestible carbohydrates and prebiotics support the growth of probiotic fish bacteria mono cultures in vitro. Journal of applied microbiology 2009; 106(3): 932-40.

(18) de Vrese M & Schrezenmeir J. Probiotics, prebiotics, and synbiotics. Food Biotechnology.Berlin Heidelberg: Springer; 2008.

(19) Castex M, Lemaire P, Wabete N, & Chim L. Effect of probiotic Pediococcus acidilactici on antioxidant defences and oxidative stress of Litopenaeus stylirostris under Vibrio nigripulchritudo challenge. Fish & Shellfish Immunology 2010; 28(4): 622-31.

(20) Perera S. The Probiotic Pediococcus acidilactici Protects Goldfish (Carassius auratus) Undergoing Induced Stress. New York: Hood College; 2008.

(21) Planas M, Vazquez JA, Marques J, Perez-Lomba R, Gonzalez MP, Murado M. Enhancement of rotifer (Brachionus plicatilis) growth by using terrestrial lactic acid bacteria. Aquaculture 2004; 240(1-4): 313-29.

(22) Villamil L, Figueras A, Planas M & Novoa B. Pediococcus acidilactici in the culture of turbot (Psetta maxima) larvae: Administration pathways. Aquaculture 2010; 307(1-2): 83-8.

(23) Mandal V, Sen SK, Mandal NC. Optimized culture conditions for bacteriocin production by Pediococcus acidilactici LAB 5 and its characterization. Indian Journal of Biochemistry & Biophysics 2008; 45(2): 106-10.

(24) Elliott SD, Dole VP. An inactive precursor of streptococcal proteinase. The Journal of experimental medicine 1947; 85(3): 305.

(25) Mandal V, Sen SK, Mandal NC. Effect of prebiotics on bacteriocin production and cholesterol lowering activity of Pediococcus acidilactici LAB 5. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2009; 25: 1837-47.

(26) Rycroft CE, Jones MR, Gibson GR, Rastall R. A comparative in vitro evaluation of the fermentation properties of prebiotic oligosaccharides. Journal of applied microbiology 2001; 91: 878-87.

(27) Zar JH. Biostatistical Analysis. Prentice-Hall, New Jersey, , 1994.

(28) Mandal V, Sen S, Mandal N. Isolation and Characterization of Pediocin NV 5 Producing Pediococcus acidilactici LAB 5 from Vacuum-Packed Fermented Meat Product. Indian Journal of Microbiology 2011; 51(1): 22-9.

(29) Cabello FC. Antibiotics and aquaculture in Chile: Implications for human and animal health. Rev Medica Chile 2004; 132(8): 1001-6.

(30) Hoseinifar SH, Mirvaghefi A, Mojazi Amiri B, Rostami HK, & Merrifield DL. The effects of oligofructose on growth performance, survival and autochthonous intestinal microbiota of beluga (Huso huso) juveniles. Aquaculture Nutrition 2011; 17(5): 498–504.

(31) Khouiti Z, Simon J. Detection and partial characterization of a bacteriocin produced by Carnobacterium piscicola 213. Journal of industrial microbiology & biotechnology 1997; 19(1): 28-33.

(32) Cummings JH, Macfarlane GT, Englyst HN. Prebiotic digestion and fermentation. The American journal of clinical nutrition 2001; 73(2): 415S.

(33) Olsen RE, Myklebust R, Kryvi H, Mayhew TM, Ringø E. Damaging effect of dietary inulin on intestinal enterocytes in Arctic charr (Salvelinus alpinus L.). Aquaculture Research 2001; 32(11): 931-4.

(34) Juskiewicz J, Semaskaite A, Zdunczyk Z,Wróblewska M, Gruzauskas R, Juskiewicz M. Minor effect of the dietary combination of probiotic Pediococcus acidilactici with fructooligosaccharides or polysaccharidases on beneficial changes in the cecum of rats. Nutrition Research 2007; 27(3): 133-9.

(35) Maslowski KM, Mackay CR. Diet, gut microbiota and immune responses. Nature Immunology 2010; 12(1): 5-9.