جداسازی، شناسایی و تعیین خصوصیت پروتئاز مقاوم به حلال آلی در Bacillus sp. DAF-01

نویسندگان

1 استادیار بیوشیمی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، ایران

2 دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه پیام نور، تهران، ایران،

3 استادیار بیوشیمی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، کرمان، ایران

4 استادیار بیوفیزیک، دانشگاه شهید باهنر کرمان، ایران،

5 استادیار بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه پیام نور، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: باکتری‏های مقاوم به حلال جزو گروه کمابیش جدیدی از باکتری‏های اکسترموفیل هستند که توانایی تولید پروتئازهایی مقاوم به حلال آلی را با کاربرد استفاده در بیوتکنولوژی صنعتی، برای تولید ترکیبات با ارزش دارند. از این رو، یافتن این باکتری‏ها به تازگی مورد توجه ویژه محققان قرار گرفته است. مواد و روش‏‏ها: در این تحقیق، از چشمه آب گرم گور، واقع در شهرستان جیرفت، نمونه برداری شد. نمونه‏ها در محیط حاوی سیکلوهگزان و تولوئن به مدت سه روز کشت داده شدند. غربال‏گری باکتری‏های مولد پروتئاز روی محیط جامد اختصاصی SKM ‏(Skim milk agar) بر اساس قطر هاله، انجام شد. بهترین گونه باکتریایی توسط روش S rDNA16 شناسایی و میزان فعالیت پروتئازی در دماهای مختلف، اسیدیته و حلال‏های آلی بررسی شد. نتایج: نتایج حاصل از تطبیق ‏توالی و درخت فیلوژنتیکی نشان دادند که گونه فوق، 97 درصد به گونه Bacillus niacini شباهت دارد. مطالعات آنزیمی نشان داد که این آنزیم در گستره دمایی20 تا90 درجه سانتی‏گراد فعالیت پروتئازی دارد که بیشترین آن در دمای 60 درجه سانتی‏گراد گزارش می‏شود. علاوه بر این، بیشترین فعالیت پروتئازی نیز در محدوده اسیدیته‏های 8 تا 9 و بیشترین پایداری در اسیدیته 9 گزارش می‏شود. بررسی فعالیت پروتئازی در حضور حلال‏های آلی متانول، تولوئن، DMF، ایزوپروپانول و سیکلوهگزان نشان می‏دهد که میزان فعالیت آنزیمی باقی مانده نسبت به نمونه فاقد حلال آلی بیش از 80 درصد است. بحث و نتیجه‏گیری: قابلیت‏های گرما دوست بودن، فعالیت در اسیدیته‏های قلیایی و پایداری در حضور حلال‏های آلی این پروتئاز اهمیت درخور توجهی برای استفاده در صنایع مختلف را دارد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation, identification and characterization of organic solvent tolerant protease from Bacillus sp. DAF-01

نویسندگان [English]

  • Arastoo Badoei-Dalfard 1
  • Mostafa Amiri-Bahrami 2
  • Ali Riahi-Madvar 3
  • Zahra Karami 4
  • Mohammad Ali Ebrahimi 5
1 Assistant Professor of Biochemistry, Shahid Bahonar University of Kerman, Iran
2 M.Sc. of Agriculture biotechnology, University of Payam-noor, Tehran, Iran
3 Assistant Professor of Biochemistry, Graduate University of Advanced Technology, Kerman, Iran
4 Assistant Professor of Biophysics, Shahid Bahonar University of Kerman, Iran
5 Assistant Professor of Agricultural biotechnology, University of Payam-noor,Tehran, Iran,
چکیده [English]

Introduction: Organic solvent-tolerant bacteria are relatively novel extermophilic microorganisms, which can produce organic tolerant protease with capacity of being used in industrial biotechnology for producing high-value compounds. Therefore, finding of these bacteria has drawn much researchers attention nowadays. Materials and Methods: In this project, samples were collected from a hot spring, located in Jiroft. Samples were incubated in medium supplemented with cyclohexane and toluene for 3 days. Screening of protease producing bacteria was performed on the specific media, SKM (Skim milk agar), based on clear area diameter. The best bacterium was identified based on 16s rDNA gene. Protease activity was considered in different temperatures, pH and organic solvents. Results: Sequence alignment and phylogenetic tree results showed that this bacteria was closely related to Bacillus niacini, with 97% homology. Enzymatic studies showed that, this enzyme was active at a wide range of temperatures, 20-90 °C and it,s optimal activity was in 60 °C. In addition, maximum protease activity was obtained in the 8-9 range of pH, and optimal stability was also at pH 9.0. Protease activity in the presence of methanol, toluene, isopropanol, cyclohexane and DMF ‏showed that, remaining activity was at least 80% compared to the control (without organic solvent) Discussion and Conclusion: Thermopilic capacity, being active in alkaline protease and high protease stability in the presence of organic solvents all herald a remarkable application for using in different industries.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Protease
  • organic solvents
  • thermopile
  • Screening

مقدمه

میکروارگانیسم‏ها مهم‏ترین و عمده‏ترین منبع تولید آنزیم‏ها محسوب می‏شوند. در صنعت منابع گیاهی و جانوری به ترتیب تنها 8 و چهار درصد از کل آنزیم‏های مورد استفاده را شامل می‏شوند و سایر آنزیم‏های مورد استفاده خاستگاه میکروبی دارند (1). جالب است که بیشتر آنزیم‏های میکروبی قابل تجاری شدن، در تعداد معدودی از جنس‏های قارچی و باکتریایی یافت می‏شوند که در اکثر موارد، شناخته شده‏ترین آن‏ها به گونه‏های باکتریایی باسیلوس[1] و سودوموناس[2] متعلق هستند (1-3).

باسیلوس‏ها، تولید‏کنندهاصلی بیشتر پروتئازهای تجاری هستند (3 - 5). با وجود این، یافتن آنزیم‏هایی با خصوصیات ویژه، همواره مورد توجه دانشمندان بوده و باعث شده آن‏ها منابع پروتئازی جدیدی با خصوصیات و عملکردهای متنوع را جستجو کنند. پروتئازها در صنایع متعدد از جمله سنتز پپتید، فرآوری پروتئین، غذایی، دارویی و شوینده، کاربردهای فراوانی دارند. این آنزیم‏ها در محیط آبی پیوند پپتیدی را هیدرولیز کرده و در عدم حضور آب، باعث تشکیل پیوند پپتیدی می‏شوند (6 و 7). به طور کلی، از مزیت‏های استفاده از آنزیم‏ها در حضور حلال‏های آلی می‏‏توان به موارد زیر اشاره کرد: افزایش حلالیت سوبستراهای غیرقطبی، تغییر جهت تعادل ترمودینامیکی به سمت سنتز به جای هیدرولیز، محدود شدن واکنش‏های جانبی وابسته به آب، تغییر در سوبسترا و انتخاب‏گری کایرالیته مورد نیاز در صنایع شیمیایی و دارویی، افزایش پایداری دمایی، حذف آلودگی میکروبی و این‏که آنزیم‏ها را می‏توان به طور مستقیم در فرایند شیمیایی بعدی یا جدید استفاده کرد. با وجود این مزیت‏ها، حلال‏های آلی با جدا کردن مولکول‏های آب پروتئین، باعث تخریب ساختار سه بعدی و دناتوره شدن پروتئین می‏شوند و استفاده از آن‏ها در محیط حلال آلی همواره با این چالش بزرگ همراه است (8 - 10). از این رو، تلاش‏های زیادی برای پایدار‏سازی پروتئاز‏ها در حضور حلال‏های آلی، از جمله بهینه‏ سازی شرایط محیط فعالیت آنزیمی (مهندسی محیط) و بهینه‏سازی پایداری خود آنزیم (مهندسی پروتئین) انجام شده است (11).

باکتری‏های مقاوم به حلال آلی، گروه کمابیش جدیدی از میکروارگانیسم‏های اکسترموفیل هستند که به علت داشتن ویژگی‏های سازشی مثل مکانیسم‏های سریع ترمیمی غشا، پمپ‏های خارج کننده تولوئن، ایزومریزاسیون سیس‏ترانس اسیدهای چرب قادرند در شرایط نامساعد در حضور حلال‏های آلی زندگی کنند. علاوه بر این، آنزیم‏های موجود در این باکتری‏ها نیز فعالیت و پایداری خود را در حضور حلال‏های آلی حفظ می‏کنند (12). پروتئازها پر مصرف‏ترین آنزیم‏های صنعتی می‏باشند که حدود 60 درصد از بازار جهانی آنزیم‏ها را به خود اختصاص داده اند. از پروتئازهای مقاوم به حلال آلی برای سنتز ترکیبات با ارزش دارویی و صنعتی استفاده می‏‏شود. از این رو، یافتن باکتری‏های مولد پروتئاز مقاوم به حلال آلی، از جمله موضوع‏های جالب بوده که ‏قابلیت‏های زیادی در بیوتکنولوژی صنعتی و دارویی دارد. یکی از مهم‏ترین این پروتئازها، پروتئاز PST-01 است که از باکتری سودوموناس آریزونا در سال 2001 ‏جداسازی شد (13). در حالی‏که نیمه عمر آن در عدم حضور حلال آلی 7/9 روز است، در حضور برخی حلال‏های آلی مثل متانول، ایزوپروپانول، اتیلن گلیکول بیشتر از 50 روز گزارش شده است (14). در این مقاله، یک باکتری مقاوم به حلال آلی مولد آنزیم پروتئاز از چشمه آب گرم گور[3] در شهرستان جیرفت جداسازی شد. پروتئاز این باکتری با آمونیوم سولفات 60 درصد به طور مختصر خالص‏سازی و سپس خصوصیات بیوشیمیایی آن، از جنبه کاربردهای بیوتکنولوژی بررسی شد.

 

مواد و روش‏ها

مواد شیمیایی

تریس، تریپتون، عصاره مخمر و کازئین از شرکتلیوفیلچم[4](ایتالیا)، خریداری شد‏‏. مواد مورد نیاز برای PCR(10X PCR buffer)، dNTP(10mM)، MgCl2(20mM) و آنزیم Taq DNA polymerase ‏از شرکت سیناژن و سایر مواد شیمیایی مورد نیاز از شرکت مرک (آلمان) خریداری شد. همینطور پرایمرهای مورد نیاز توسط شرکت بیونیر (کره) سنتز شد‏‏. حلال‏های آلی مورد نیاز از شرکت مرک خریداری شدند.

غربال‏گری باکتری‏های مولد پروتئاز مقاوم به حلال آلی

نمونه برداری از چشمه آب گرم گور با دمای 62 درجه سانتی‏گرادانجام شد. در آزمایشگاه در محیط نوترینت براث حاوی 30 درصد سیکلوهگزان و تولوئن به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد(برای‏‏‏ جلوگیری از تبخیر حلال آلی) کشت داده شد. پس از این مدت، پنج میلی‏لیتر از این محیط برداشته و به محیط تازه حاوی 30 درصد سیکلوهگزان و تولوئن تلقیح شد‏‏ (15). پس از 24 ساعت رشد در دمای 37 درجه سانتی‏گراد، مقدار 100 میکرولیتر از این محیط برداشته و روی محیط جامد اختصاصی SKM کشت داده شد. گونه باکتریایی که بیشترین هاله را پس از 48 ساعت انکوباسیون نشان می‏‏داد به ‏عنوان سوش بهینه مولد پروتئاز مقاوم به حلال آلی انتخاب شد‏‏.

شناسایی سویه

از روش مولکولی S rDNA16 برای شناسایی گونه مورد نظر استفاده شد (16). ابتدا باکتری روی محیط نوترینت آگار کشت چمنی داده و به مدت 24 ساعت در دمای‏37 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شد.

باکتری‏های رشد یافته به کمک لوپ از سطح محیط کشت جمع آوری و سوسپانسیونی ازآن در آب مقطر استریل تهیه شد. با سانتریفیوژ سوسپانسیون حاصل در دمای ‏چهار درجه سانتی‏گراد به مدت 10 دقیقه و در دور g8000 رسوب باکتری به دست آمد. جداسازی DNA ژنومی با استفاده از کیت سیناژن انجام شد. به منظور تخمین کیفیت و کمیت ‏DNA ژنومی استخراج شده، جذب محلول رقیق شده DNA (با رقت 100) در طول موج‏های 260 و 280 نانومتر اندازه گیری شد. با استفاده از رابطه DNA (µg/ml)=50.d.A260 Conc. و نسبت A260/A280 به ترتیب غلظت DNA و میزان خلوص آن تخمین زده شد (17). پرایمرها مطابق با پرایمرهای عمومی برای‏‏‏ تکثیر ژن S rDNA16 به شکل زیر طراحی شدند (16): ‏پرایمر Forward:
5' -AGT TTG ATC CTG GCT CAG – 3'
با Tm = 53/7 ºC ‏و Reverse primer:
 5' -GGC/T TAC CTT GTT ACG ACT T-3'
‏با Tm = 53/4 ºC. واکنش PCR مطابق با برنامه ذیل انجام شد: 1) دمای اولیه ‏‏94 درجه سانتی‏گراد، برای مدت پنج دقیقه؛ 2) 30 سیکل که هر کدام شامل: 94 درجه سانتی‏گراد ، 45 ثانیه و 54 درجه سانتی‏گراد، 45 ثانیه و72 درجه سانتی‏گراد،90 ثانیه؛ 3) برای تکثیر نهایی 72 درجه سانتی‏گراد، برای مدت 8 دقیقه. محصول PCR پس از الکتروفورز ژل آگاروز یک درصد با استفاده از کیت استخراجDNAخالص‏سازی شد. سپس توالی DNA با استفاده از توالی یاب DNA توسط بیونیر (کره) تعیین شد‏‏.

تولید آنزیم و خالص سازی جزیی

محیط پیش کشتشامل ‏ترکیبات ‏زیر است:

Nutrient broth (8 g/L), soya meal (17 g/L), peptone (10 g/L), tryptone (10 g/L), NaCl (5 g/L)
اسیدیته این محیط‏های کشت قبل از اتوکلاو به 8/6 رسانده شد. محیطکشت تولید آنزیمی شامل: Yeast extraet (17 g/l)tryptone (10 g/L), NaCl (5 g/L) بود. اسیدیته این محیط‏های کشت، قبل از اتوکلاو به 7 رسانده شد (18). 48 ساعت پس از تلقیح محیط تولید به‏ وسیله محیط پیش کشت، محیط کشت حاوی باکتری تکثیر یافته را به مدت10 دقیقه در ‏چهار درجه سانتی‏گراد با دورg5000 سانتریفوژ کرده و به محلول رویی که به ظرف دیگری منتقل شده بود، محلول ‍PMSF (فنیل متیل سولفونیل فلوراید) اضافه شد؛ به‏طوری که غلظت نهایی آن در محیط یک میلی‏مولار باشد. به محلول رویی در حال هم زده شدن آمونیوم سولفات اضافه شد تا به 65 درصد درجه اشباع برسد. سپس به مدت پنج ساعت در دمای چهار درجه سانتی‏گراد قرار گرفت و بعد از سپری شدن این زمان در دمایچهار درجه سانتی‏گراد و در g12000 به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شده و رسوب حاصل در حداقل حجم بافر 20 میلی‏مولار تریس با اسیدیته 8/7 حل شد. محلول پروتئینی غلیظ شده حاوی فعالیت پروتئازی، حداقل سه بار در دمای چهار درجه سانتی‏گراد در حضور این بافر دیالیز و برای مطالعات آنزیمی استفاده شد.

اندازه گیری فعالیت پروتئازی

 فعالیت پروتئازی با استفاده از سوبسترای کازئین به عنوان سوبسترای طبیعی مطالعه شد. هیدرولیز کازئین توسط محلول آنزیمی با اندازه‏گیری جذب در 280 نانومتر به روش نقطه پایان اندازه‏گیری شد. محلول واکنش 500 میکرولیتر شامل: 250 میکرولیتر بافر تریس50 میلی‏مولار با اسیدیته 8، 200 میکرولیتر محلول کازئین 2 درصد و 50 میکرولیتر محلول آنزیمی بود. این محلول به مدت 10 دقیقه در دمای 50 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد‏‏. سپس 500 میکرولیتر محلول 10 درصد تری‏کلرو استیک اسید ((TCA افزوده‏‏ و در دور
g 12000 به مدت 10 دقیقه رسوب داده شد. محلول رویی حاوی اسید‏های آمینه هیدرولیز شده سوبسترای کازئین است‏‏‏ که جذب آن در طول موج 280 نانومتر اندازه گیری شد‏‏(19). در تمامی واکنش‏ها از محلول شاهد استفاده شد‏‏ که قبل از افزودن آنزیم، محلول TCA اضافه می‏‏شد. آزمایشات سه بار تکرار و انحراف معیار آنها محاسبه شد.

تعیین زمان و اسیدیته بهینه برای تولید آنزیم

به منظور یافتن زمان بهینه تولید پروتئاز، تولید آنزیم در زمان‏های متعدد پس از کشت (از طریق سنجش فعالیت آنزیمی) بررسی و نیز اثراسیدیتهدر تولید پروتئاز مطالعه شد. به این منظور، محیط تولید در اسیدیته‏های متعدد بین5 تا 8 تهیه و استفاده شد.

تعیین خصوصیات آنزیمی

اندازه گیری فعالیت و پایداری در اسیدیته‏های مختلف

برای تعیین اسیدیته بهینه برای عملکرد آنزیم، بافر مخلوط حاوی 50 میلی‏مولار بافر‏های زیر تهیه شد:

 Glysine (2-4), acetate-Na (4-6), phosphate-Na (6-8), Tris-base (8-10), Glycine (10-12). سپس با رساندن اسیدیته محیط واکنش آنزیمی به اسیدیته‏های مورد نظر، فعالیت آنزیم در آن اسیدیته‏ها اندازه گیری شد.

بررسی فعالیت و پایداری پروتئاز در دماهای مختلف

بررسی فعالیت آنزیمی در دماهای مختلف طبق روش استاندارد انجام شد با این تفاوت که در هر بار از یک دمای انکوباسیون متفاوت (20 تا 90 درجه سانتی‏گراد) استفاده شد‏‏. بیشترین فعالیت آنزیمی به دست آمده، 100 درصد در نظر گرفته و میزان فعالیت در سایر دماها نسبت به آن سنجیده می‏‏شود. برای تعیین پایداری، آنزیم‏ها در دماهای 50 و60 درجه سانتی‏گراد انکوبه شده و در زمان‏های 30، 60، 90، 120، 150 و 180 دقیقه پس از انکوباسیون نمونه برداری انجام و به مدت 20 دقیقه در یخ قرار داده شدند. سپس میزان فعالیت آنزیمی باقی مانده طبق روش استاندارد اندازه‏گیری شد.

بررسی پایداری آنزیم در حضور حلال‏های آلی در دمای اطاق

برای بررسی پایداری آنزیم در حلال‏های آلی در دمای اطاق، غلظت (V/V)40 درصد از حلال‏های آلی دی متیل فورمامید، متانول، ایزوپروپانول، کلروفرم، سیکلو هگزان در بافر 50 میلی‏‏‏مولار تریس و بااسیدیته مورد نظر تهیه شد. سپس مقدار مساوی از این حلال و آنزیم در یک میکروتیوپ با هم مخلوط شد‏‏. مقدار غلظت نهایی حلال در زمان انکوباسیون (V/V) 20درصد بود. سپس میکروتیوپ‏ها در دمای30 درجه سانتی‏گراد و دور 160 به مدت 3 ساعت انکوبه شدند. پس از این مدت، میزان فعالیت باقی مانده آنزیم در آن‏ها ارزیابی شد (20). مقدار غلظت نهایی حلال (V/V) دو درصد بود.

 

نتایج

غربال‏گری و شناسایی گونه باکتری مولد پروتئاز مقاوم به حلال آلی

چشمه آب گرم گور دارای دمای 62 درجه سانتی‏گراد و اسیدیته 5 است که در جنوب استان کرمان و در شهرستان جیرفت واقع شده است. نمونه‏های آب برداشته شده از دهانه چشمه به محیط کشت حاوی 30 درصد تولوئن و 10 درصد سیکلوهگزان تلقیح شد‏‏ند. پس از 48 ساعت محیط کشت تعویض شد‏‏. نمونه‏ها روی محیط جامد SKM (Skim milk agar) کشت داده شدند و باکتری‏هایی که پس از 48 ساعت در اطراف کلونی هاله ایجاد کرده بودند مقایسه شدند. گونه باکتریایی که بیشترین هاله را در اطراف کلونی نشان داده بود به‏عنوان بهترین سوش انتخاب شد‏‏ (شکل 1) و بر روی آن مطالعه شد.

 

 

شکل 1- غربال‏گری باکتریاییBacillus sp.DAF-01مولد پروتئاز روی محیط SKM

 

تعیین گونه میکروارگانیسم با استفاده S rDNA16

تعیین گونه باکتریایی با استفاده از اطلاعات حاصل از S rDNA16 انجام می‏‏شود (16). برای تهیه DNA ژنومی باکتری از کیت استخراج DNA سیناژن استفاده شد وDNA ‏تکثیر یافته با استفاده از PCR (شکل 2)، توسط کیت تخلیص DNA از شرکت سیناژن تخلیص شد و سپس برای تعیین توالی به شرکت بیونیر (کره) ارسال شد‏‏.

 

شکل 2- محصول PCR ژن S rDNA16 باکتری Bacillus sp. DAF-01(چاهک شماره 2) وDNA ladder(چاهک شماره 1).

 

بعد از تعیین توالی محصول PCR در مقایسه با سایر ژن‏های S rDNA16 درخت فیلوژنتیکی برای آن رسم شد. رسم درخت فیلوژنتیک با استفاده از نرم افزار MEGA4و مقایسه توالی S rDNA16 باکتری Bacillus sp. DAF-01 با 19 گونه‏های باسیلوس موجود در مرکز ملی بیوتکنولوژی[5] انجام شده است (21 و22). نتایج حاصل از تطبیق توالی و درخت فیلوژنتیکی نشان دادند که گونه فوق به گونه Bacillus niacini نزدیک است‏‏‏ که میزان شباهت نوکلئوتیدی آنها 97 درصد می‏‏باشد (شکل 3). عدد دسترسی توالی نوکلئوتیدی ارائه شده در بانک ژنی، تحت عنوان JX500529 است‏‏‏.

 

 

شکل 3- درخت فیلوژنی باکتری مولد پروتئاز باکتریایی مقاوم به حلال آلی جدا شده از چشمه آب گرم


بهینه سازی شرایط تولید آنزیم

از آن‏جا که زمان انکوباسیون تأثیر مهمی بر میزان ترشح آنزیم دارد، در ابتدا این متغیر بررسی شد. در این تحقیق، فعالیت آنزیم پس از گذشتن زمان‏های انکوباسیون 24، 36، 48، 72 و 96 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد، اندازه گیری شده است. نتایج نشان می‏‏دهد که در زمان 48 ساعت پس از انکوباسیون تولید آنزیم به حد اکثر مقدار خود می‏رسد(شکل 4).

 

 

شکل 4- ‏بهینه سازی زمان تولید پروتئاز باکتریایی

Bacillus sp. DAF-01

 

 

تولید آنزیم در محیط‏های با اسیدیته مختلف نیز بررسی شد. در محیط کشت تولید از بافر فسفات استفاده شد که در اسیدیته‏های مختلف بین 5 تا 8 تنظیم شده بود. پس از 48 ساعت از تلقیح محیط تولید توسط باکتری تکثیر یافته در محیط پیش کشت و در دمای 37 درجه سانتی‏گراد، محیط‏های کشت سانتریفوژ شده و فعالیت پروتئازی در شرایط استاندارد بررسی شد. نتایج نشان داد که بیشترین تولید به اسیدیته 7 مربوط است‏‏‏. از این رو، در مراحل بعدی برای تولید آنزیم پروتئاز، اسیدیته محیط به 7 رسانده شد و مدت زمان کشت در محیط تولید 48 ساعت انتخاب شد. ‏

تعیین خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم پروتئاز

بررسی فعالیت و پایداری پروتئاز در دماهای مختلف

میزان فعالیت آنزیمی در دمای 20 تا90 درجه سانتی‏گراد اندازه گیری شد که در شکل 5 نشان داده شده است. نتایج نشان می‏‏دهد که این آنزیم در گستره دمایی 20 تا 90 درجه سانتی‏گراد فعال است‏‏‏ و بیشترین ‏فعالیت در دمای 60 تا 70درجه سانتی‏گراد است‏‏‏ که این فعالیت به زیستگاه ‏طبیعی باکتری که در دمای 62 است نزدیک است‏‏‏.

 

شکل 5- میزان فعالیت آنزیمی را در زمان‏های مختلف

نتایج نشان می دهد که این آنزیم بیشترین فعالیت را در دمای 65 درجه سانتی‏گراد نشان می‏‏دهد.

 

اندازه گیری فعالیت و پایداری در اسیدیته‏های مختلف

برای مطالعه اثر اسیدیته بر فعالیت پروتئازی، پروتئاز دراسیدیته‏‏های مختلف انکوبه شده و فعالیت آن اندازه‏گیری شده است. نتایج نشان داد که این آنزیم در محدوده وسیعی ازاسیدیتهفعال بوده و بیشترین فعالیت خود را در محدوده اسیدیته‏های 8 تا 9 نشان می‏‏دهد (شکل 6).

 

شکل 6- ‏فعالیت پروتئازی Bacillus sp. DAF-01 در حضور اسیدیته‏های مختلف

 

علاوه بر این، پایداری اسیدیته این آنزیم نیز پس از انکوبه کردن به مدت 30 دقیقه در اسیدیته‏های مختلف نیز بررسی شد. نتایج نشان می‏‏دهد که پایداری بهینه این پروتئاز در ‏اسیدیته 8 است‏‏‏ (شکل 7). قبل و بعد از این ‏اسیدیته نیز پایداری کاهش می‏‏یابد که تاکیدی بر خاصیت قلیایی آن دارد.

 

 

شکل 7- ‏پایداری پروتئاز Bacillus sp. DAF-01 در حضور اسیدیته‏های مختلف

 

 

 

 

 

بررسی حلال‏های آلی روی فعالیت ‏و پایداری پروتئاز

فعالیت آنزیمی باقی مانده پس از 3 ساعت انکوباسیون در حضور 20 درصد حلال آلی نیز بررسی شد. نتایج نشان داد که فعالیت پروتئازی در حضور حلال‏هایآلی DMF و متانول (به ترتیب 10 و 25 درصد)بیش از نمونه کنترل فاقد حلال است. در حضور سایر حلال‏ها نیز، میزان فعالیت آنزیمی باقی مانده بیش از 85 درصد است(جدول 1).

 

‏جدول 1- میزان فعالیت پروتئازی پس از 3 ساعت انکوباسیون در حضور 20 درصد حلال‏های آلی

Remaining activity (%)

Organic solvent

100

No O. S.

110

DMF

86

Isopropanol

94

Cloroform

125

Methanol

92

Cyclohexane

 

بحث و نتیجه‏گیری

بیشترین فعالیت پروتئاز مورد مطالعه در دمای 60 تا 70 درجه سانتی‏گراد است که قابلیت استفاده از این آنزیم گرمادوست را در صنعت نشان می‏‏دهد. دمای بهینه پروتئاز جدا شده از باکتری باسیلوس سوبتیلیس[vi] PE-11، 60 درجه سانتی‏گراد است. دمای بهینه یک پروتئاز قلیایی از باسیلوس استئاروترموفیلوس[vii] AP-4، نیز 55 درجه سانتی‏گراد گزارش شده است (18 و 23). در حالی که جو[viii] و همکاران یک پروتئاز قلیایی با دمای بهینه حدود 45 تا 50 درجه سانتی‏گراد را گزارش کرده اند (24). گوربل[ix] و همکاران نیز یک پروتئاز از باسیلوس سرئوس با دمای بهینه 60 درجه سانتی‏گراد گزارش کردند (25).

فعال بودن آنزیم در محدوده اسیدیته‏های بازی نشان از خاصیت قلیایی این آنزیم دارد که این موضوع از لحاظ بیوتکنولوژیکی قابل توجه است. ‏اسیدیته بهینه برای فعالیت آنزیمی و اسیدیته بهینه برای پایداری آنزیمی به ویژگی‏های جایگاه فعال آنزیم از جمله رزیدوهای جایگاه فعال آنزیم وابسته است و تحت تاثیر ساختار آنزیم است. معمولا رابطه مستقیمی بین شرایط بهینه فعالیت آنزیمی و شرایط زیست باکتری وجود ندارد. پروتئازهای مقاوم به حلال از باکتری‏های سودوموناسآریزوناPseA [x] ‏و باسیلوس سرئوس[xi] BG1 نیز جداسازی شده که اسیدیته بهینه آن‏ها بین 8 تا 9 گزارش می‏‏شود. در حالی که در اسیدیته‏های بالاتر از 10 فعالیت خود را به طور کامل از دست داده اند (26 و 27). بسیاری از پروتئازهای جدا شده از باسیلوس‏ها در اسیدیته‏های قلیایی فعالیت می‏‏کنند. سوبتیلیزین کارلسبرگ[xii] باکتری باسیلوس لچنیفورمیس[xiii] ‏فعالیت بهینه خود را در اسیدیته 8 تا 10 نشان می‏‏دهد (12 و 18).

پروتئاز Bacillus sp. DAF-01 در حضور تمامی حلال‏های مورد مطالعه، بیش از 85 درصد از فعالیت پروتئازی خود را حفظ کرده است. این نتایج نشان از پایداری این پروتئاز در حضور حلال‏های آلی دارد. علاوه بر این، در حضور حلال آلی متانول نیز 25 درصد افزایش فعالیت نشان می‏‏دهد. فعالیت پروتئاز باسیلوس گونه RN2 در حضور بنزن، دی اتیل اتر و استون به میزان 108، 102 و 100 درصد گزارش شده است (12). پروتئاز HR-08 نیز در حضور حلال آلی ایزوپروپانول به میزان 20 درصد افزایش فعالیت نشان می‏‏داد در حالی که در حضور حلال آلی پروپانول فعالیت آن کاهش نشان می‏‏داد (18).

باکتری‏های مقاوم به حلال آلی به علت داشتن آنزیم‏هایی با مقاومت و کارایی بالا در حضور حلال‏های آلی مورد توجه ویژه قرار گرفته اند. در صورت یافتن پروتئاز مقاوم به حلال می‏‏توان بدون استفاده از روش‏های پر هزینه و زمان‏بر مهندسی پروتئین، بر چالش غیر فعال شدن پروتئازها در محیط حلال آلی غلبه کرد. نتایج این پژوهش نشان داد که باکتری غربال شده مولد پروتئازی است که ویژگی‏های ممتازی مثل گرما دوست بودن، فعالیت در اسیدیته‏های بازی و پایداری قابل توجه در حضور حلال‏های آلی را دارد که هرکدام از آنها در بیوتکنولوژی سنتزی اهمیت در خور توجهی دارند. با توجه به این خصوصیات، این آنزیم می‏‏تواند در صنعت برای سنتز ترکیبات با ارزش دارویی و صنعتی در حضور حلال‏های آلی، استفاده شود.

تشکر و قدردانی

این پژوهش با حمایت مالی پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، کرمان، ایران (طرح پژوهشی شماره 3121/1) و دانشگاه شهید باهنر کرمان انجام شده است که بدین‏وسیله از مسئولین محترم این سازمان ها سپاسگزاری می شود.

 

 

 

 

 

 

 



[1]. Bacillus

[2]. Pseudomonas

[3]. Gever

[4]. liofilchem

[5]. http://www.ncbi.nlm.nih.gov(NCBI)

[vi]. Bacillus subtilis

[vii]. Bacillus stearothermophilus 

[viii]. Joo

[ix]. Ghorbel

[x]. Pseudomonas aeruginosa

[xi]. Bacillus cereus

[xii]. Subtilisin Carlsberg

[xiii]. Bacillus licheniformis

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

References

)1( Bornscheuer U, Pohl M. Improved biocatalysts by directed evolution and rational protein design. Curr Opin Chem Biol 2001; 5(2): 137-43.

(2) Bommarius AS, Riebel BR. Biocatalysis: fundamentals and applications. Weinheim: Wiley-VCH; 2007.

(3) Archer D. Enzyme production by recombinant Aspergillus. Bioprocess Technol1994; 19: 373-93.

(4) Sheppard P, Grant F, Oort P, Sprecher C, Foster D, Hagen F, et al. The use of conserved cellulase familyspecific sequences to clone cellulase homologue cDNAs from Fusarium oxysporum. Gene 1994; 150(1): 163-67.

(5) Wahler D, ReymondJ. Novel methods for biocatalyst screening. Curr Opin Chem Biol 2001; 5(2): 152–58.

(6) Rao M, Tanksala A, Ghatge M, Deshpande V. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol Mol Biol Rev 1998; 62(3): 597-635.

(7) Kumar C, Takagi H. Microbial alkaline proteases: from a bioindustrial viewpoint. Biotechnol Adv 1999; 17(7): 561–94.

(8) Clapes P, Torres-Luis J, Adlercreutz P. Enzyme peptide synthesis in low water content systems: preparative enzymatic synthesis of [Leu]-and [Met]-enkephalin derivatives. Bioinorg Ned Chem 1995; 3(3): 244-55.

(9) Ogini H, Ishikavawa H. Enzymes which are stable in the presence of organic solvents. J Biosci Bioeng 2001; 91(2): 109-16.

(10) Mattos C, Ring D. Proteins in organic solvents. Curr Opin Struct Biol 2001; 11(6): 761- 4.

(11) Noriyuki D, Hiroyasu O. Organic solvent-tolerant enzymes. Biochem Eng J 2010; 48(3): 270–82.

(12) Sardessai Y, Bhosle S. Industrial potential of organic solvent tolerant bacteria. Biotechnol Prog2004; 20(3): 655-60.

(13) Ogino H, Watanabe F, Yamada M, Nakagawa S, Hirose T, Noguchi A, et al. Purification and characterization of organic solvent-stable protease from organic solvent-tolerant Pseudomonas aeruginosa PST-01. J Biosci Bioeng 1999; 87(1): 61–8.

(14) Tang X, Pan Y, Li S, He B. Screening and isolation of an organic solvent-tolerant bacterium for high-yield production of organic solvent-stable protease. Bioresour Technol.2008; 99(15): 7388-92.

(15)Badoei Dalfard A, Khajeh Kh, Soudi M R, Naderi-Manesh H, Ranjbar B, Sajedi HR. Isolation and biochemical characterization of laccase and tyrosinase activities in a novel melanogenic soil bacterium. Enzym Microb Technol 2006; 39(7): 1409-16.

(16) Sambrook, J, Russell D. Molecular Cloning a Laboratory Manual. NewYork: Cold Spring Harbor: 2001.

(17) Moradian F, Khajeh K, Naderi-Manesh H, Sadeghizadeh M. Isolation, purification and characterization of a surfactants-, laundry detergents- and organic solvents-resistant alkaline protease from Bacillus sp. HR-08. Appl Biochem Biotechnol2009; 159(1): 33-45.

(18) Pazhang M, Khajeh Kh, Ranjbar B, Hosseinkhani S. Effects of water-miscible solventsand polyhydroxy compounds on the structure andenzymatic activity of TLN. J Biotechnol. 2006; 127(1): 45-53.

(19)Badoei-Dalfard A, Khajeh K, Asghari SM, Ranjbar B, Karbalaei-Heidari HR. Enhanced activity and stability in the presence of organic solvents by increased active site polarity and stabilization of a surface loop in a metalloprotease. J Biochem 2010; 148(2): 231–38.

 

 

(20) Sievers F, Wilm A, Dineen DG, Gibson TJ, Karplus K, Li W, et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega, Mol Syst Biol 2011; 7: 1-6.

(21) Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. MolBio Evo 2007; 24: 1596-99.

(22) Adinarayana K, Ellaiah P, Prasad DS. Purification and partial characterization of thermostable serine alkaline protease from a newly isolated Bacillus subtilis PE-11. AAPS PharmSciTech, 2003; 4(4): 440–8.

(23) Joo H-S, Park G-C, Kim KT, Paik SR, Chang C-S. Simple methods for alkaline protease purification from the polychaeta, Periserrula leucophryna. Proc Biochem 2001; 37: 299–303.

(24) Ghorbel B, Sellami-Kamoun A, Nasri M. Stability studies of protease from Bacillus cereus BG1.Enzym Microb Technol 2003; 32(5): 513-8.

(25) Gupta A, Roy I, Khare SK, Gupta MN. Purification and characterization of a solvent stable protease from Pseudomonas aeruginosa PseA, J Chromatogr A, 2005;1069 (2):155-61.

(26) Shah K, Mody K, Keshri J, Jha B. Purification and characterization of a solvent, detergent and oxidizing agent tolerant protease from Bacillus cereus isolated from the Gulf of Khambhat. J Mol Catal B: Enzym 2010; 67(2): 85–91.

(27) Gupta R, Beg QK, Lorenz P. Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications. App Microbiol Biotech 2002; 59:15-32.