اثرعوامل مترشحه استافیلوکوکوس اورئوس بر بقای نوتروفیل‏ها و مونوسیت‏ها در شرایط in vitro

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 مربی ایمنولوژی، دانشگاه ارومیه، ایران،

2 استادیار ایمنولوژی، دانشگاه ارومیه، ایران،

3 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه ارومیه، ایران

چکیده

مقدمه: با توجه به نقش شناخته شده اگزوپروتئین‌های استافیلوکوکوس اورئوس در سرکوب کردن پاسخ ایمنی ذاتی در عفونت‌های انسانی، هدف از مطالعه حاضر، تعیین نقش عوامل مترشحه باکتری در زنده مانی نوتروفیل‌ها و مونوسیت‏ها در گاوان سالم و مبتلا به ورم پستان است. مواد و روش‏‏ها: در تحقیق حاضر، پنج نمونه شیر از گاوان مبتلا به ورم پستان و پنج نمونه از گاوان سالم تهیه شد. نمونه خون هپارینه از گاوان مبتلا و سالم به منظور جداسازی نوتروفیل‌ها و مونوسیت‌ها گرفته شد. نوتروفیل‌ها با استفاده از داروی مگلومین و مونوسیت‌ها در هیستوپک جدا سازی شدند. عوامل مترشحه از باکتری استافیلوکوکوس اورئوس ATCC23219 تهیه و غلظت پروتئین موجود در آن به روش برادفورد به میزان 400 میکروگرم در میلی‌لیتر تعیین شد.تأثیر غلظت‌های مختلف عوامل مترشحه بر میزان زنده مانی نوتروفیل‌ها و مونوسیت‌ها به ترتیب بروش فلوسیتومتری و ایمونوفلورسانس تعیین شد. نتایج: در مورد گاوان سالم، عوامل مترشحه حاوی 800 میکروگرم در میلی‌لیتر پروتئین و در مورد گاوان مبتلا به بیماری400 میکروگرم در میلی‌لیتر پروتئین، بیشترین مرگ سلولی مونوسیت‌ها و نوتروفیل‌ها را داشتند. بررسی مراحل مختلف آپوپتوز در مونوسیت‌ها و نوتروفیل‌های گاوان سالم و مبتلا به بیماری نشان داد که حضور عوامل مترشحه در گاوان سالم موجب کاهش آپوپتوزدر مونوسیت‌ها و در گاوان بیمار موجب افزایش آپوپتوز شد. بحث و نتیجه‏گیری: ترشحات استافیلوکوکوس اورئوس باعث القا آپوپتوز و تا حدودی نکروز، هم در نوتروفیل‏ها و هم در مونوسیت‌های گاوان سالم و بیمار می‌شود، ولی این سلول‌ها در گاوان بیمار نسبت به مرگ سلولی حساس‏تر از گاوان سالم هستند. از طرفی در گاوان سالم نوتروفیل‌ها و در گاوان بیمار مونوسیت‌ها نسبت به مرگ سلولی حساس‏ترند. وقتی گاوان به بیماری ورم پستان استافیلوکوکوس اروئوس مبتلا می‌شوند، عوامل مترشحه از این باکتری تأثیر بیشتری روی مونوسیت‌ها نسبت به نوتروفیل‏ها دارند. آنچه مسلم است، تعیین دقیق محتویات ترشحات باکتری و نیز مکانیسم عمل آن‏ها به روشن شدن مطلب کمک خواهد کرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

The effect of Staphylococcus aureus extraction factors on viability of neutrophils and monocytes in vitro

نویسندگان [English]

  • nahideh Afzal ahangaran 1
  • Nouroz Delirezh 2
  • Malahat Ahmadi 3
1 Ph.D student of Immunology, Urmia University, Iran
2 Assistant Professor of Immunology, Urmia University, Iran
3 Associate Professor of Microbiology, Urmia University, Iran
چکیده [English]

Introduction: Staphylococcus aureus exoproteins are known to have potent effects on cells of the immune system in human infections and their primary inhibitory effects in vivo on innate immune responses. The objective of this study was to determine the effects of bacterial extractions on viability of neutrophils and monocytes in the healthy and the infected cattle (mastitis). Materials and Methods: In order to isolate of neutrophils and monocytes, heparinized blood samples were taken from the healthy (n=5) and the infected cattles (n=5). Neutrophil and monocyte isolation was carried out using meglumine and histopaque compounds respectively. Secretory factors from Staphylococcus aureus ATCC23219 were extracted and its concentration assayed by Bradford method and were determined to be 400 μg/ml. The effect of different concentrations of the extract on viability of neutrophils and monocytes was determined by flowcytometery and immunoflorcent respectively. Results: The results showed that in the healthy and the infected cattles, extract containing 800 and 400 μg/ml protein, respectively caused the most death in monocytes and neutrophils. It also seemed that in the infected cattles, monocytes were more sensitive to cell death than the neutrophils. Discussion and Conclusion: The extract of Staphylococcus aureus induces apoptosis and necrosis in both neutrophils and monocytes of both the healthy and the infected cattle but the cells in the cattle with mastitis are more sensitive to apoptosis than in the non- infected cattles. In the case of mastitis due to Staphylococcus aureus, the bacterial extracts effects on monocytes and not the neutrophils. However, determination of bacterial extraction fractions and their effect on immune system cells are strongly recommended.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Staphylococcus aureus
  • Bacterial extraction factors
  • Neutrophil
  • Monocyte

عفونت‏های باکتریایی با طیف وسیعی از مکانیسم‏های دفاعی محافظت می‏شوند. این عفونت‏ها به دو دسته سیستم ایمنی ذاتی و سیستم ایمنی اکتسابی تقسیم­می­شوند. سیستم ایمنی ذاتی یا غیر اختصاصی نخستین سد دفاعی بر علیه اجرام بیماری‏زای مهاجم است که توسط محرک‏های مختلف فعال می­شود، البته در اثر مواجهه مکرر با عوامل عفونی افزایش نمی‏یابد (1).

یکی از شناخته شده‏ترین باکتری‏های مهاجم، استافیلوکوکوس اورئوس است. این باکتری در انسان و دام موجب ایجاد عفونت‏های مختلف می‏شود. از جمله عفونت‏های شایع ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس در دام‏ها، ورم پستان است. ورم پستان یک بیماری التهابی است که دفاع غده پستانی در برابر آن توسط ایمنی هومورال و وابسته به سلول میانجی‏گری می‏شود. مطالعات نشان داده­اند که نوتروفیل‏ها نخستین سلول‏های خط دفاعی پس از ورود باکتری در غده پستان هستند.قدرت و توانایی نوتروفیل‏ها در بیگانه خواری و یا انهدام باکتری‏های مهاجم در پایداری و استقرار عفونت داخل پستانی موثر است، به‏طوری‏که اگر نوتروفیل‏ها قادر به حذف باکتری از غده پستانی نشوند، عفونت به‏وقوع پیوسته و در نهایت مزمن می‏شود (2).

استافیلوکوکوس اورئوس به‏عنوان یکی از مهم‏ترینعوامل ایجاد کننده ورم پستان در گاو، یک باکتری گرم مثبت، بی‏هوازی اختیاری، غیر متحرک و غیر اسپورزاست. اگزوتوکسین­های مختلفی از جمله لکوسیدین، توکسین آلفا، انتروتوتوکسین­ها، توکسین-1 سندرم شوک توکسیک وتوکسین­های اکسفولیاتیو توسط استافیلوکوکوس اورئوس تولید می­شوند که در حدت آن نقش دارند (3، 4 و 5). همچنین، استافیلوکوک­ها، مولکول­هایی تحت عنوان اجزای سطحی میکروبی شناسایی کننده مولکول­های چسبنده ماتریکس[1](MSCRAMM) تولیدمی‏کنند که در برگیرنده یک سری عوامل چسبندگی شامل: پروتئین متصل شونده به کلاژن، پروتئینمتصل شونده به فیبرونکتین، پروتئین متصل شونده به فیبرینوژن، پروتئین متصل شونده به الاستین، عامل جمع کننده و عامل چسبندگی به ماتریکس­ هستند (6).

نوتروفیل­ها و مونوسیت­ها به‏عنوان نخستین سلول­های دفاعی غده پستان در برابر اجرام بیماری‏زای مهاجم شناخته می‏شوند. از این رو اختلال در عملکرد این سلول­ها به افزایش حساسیت میزبان نسبت به عفونت­های باکتریایی پستان منجر می­شود (7).

عملکرد استافیلوکوکوس اورئوس در القا آپوپتوزیس در طیف وسیعی از سلول­های اپی­تلیال، آندوتلیال،‏ استئوبلاست‏ها، کراتینوسیت­ها، لنفوسیت­ها و ماکروفاژ­ها طی مطالعات متعدد نشان داده شده است. همچنین، استافیلوکوکوس اورئوس با تنظیم آپوپتوزیس در سلول­های ایمنی نظیر نوتروفیل­ها موجب القا بیماری می­شود (8 و 9). علاوه بر این، مشخص شده است که اگزوتوکسین­های مترشحه از استافیلوکوک­ها نقش مهمی در القا پاسخ‏های ایمنی بر ضد باکتری نیز دارند (10).

با توجه به نقش شناخته شده عوامل مترشحه (اگزوتوکسین­ها) استافیلوکوکوس اورئوس در سرکوب پاسخ ایمنی ذاتی در عفونت­های انسانی، در مطالعه حاضر نقش عوامل مترشحه استافیلوکوکوس اورئوس‏های جدا شده از موارد ورم پستان گاو بر زنده مانی نوتروفیل­ها و مونوسیت­ها بررسی و­ با تأثیر استافیلوکوکوس اورئوس­های جدا شده از گاوان سالم بر نوتروفیل­ها و مونوسیت­ها مقایسه شد.

 

مواد و روش‏ها

تهیه نمونه شیر

از مهر تا آذر ماه سال 1390 تعداد پنج نمونه شیر از گاوان مبتلا به ورم پستان و پنج نمونه شیر از گاوان سالم از دامداری­های صنعتی منطقه ارومیه که در شرایط یکسان نگهداری می­شدند، پس از انجام آزمون CMT[2] و تأیید ابتلا به ورم پستان، گرفته شد. ابتدا سر پستانک­ها با آب ولرم شستشو شدند و سپس هر کارتیه به‏وسیله اتانول 70 درصد، ضدعفونی و خشک شد. سه دوشش اولیه دور ریخته شد و حدود 10 میلی‏لیتر نمونه شیر مربوط به کارتیه‏های درگیر، در یک لوله استریل جمع آوری شد (11).

کشت و جدا سازی استافیلوکوکوس اورئوس

به منظور تشخیص ابتلا به ورم پستان ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس و نیز تأیید سالم بودن دام‏های مورد مطالعه، 100 میکرولیتر از هر نمونه شیر بر روی محیط مانیتول سالت آگار (مرک - آلمان105404500) انتقال داده، کشت اولیه تهیه و در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. کلونی­های زرد رنگ ظاهر شده بر روی این محیط (مشکوک به استافیلوکوکوس اورئوس) انتخاب و در محیط آگار خون‏دار (پرونادیسا-اسپانیا110800) حاوی پنج در­صد خون گوسفند خالص شد. برای تأیید تشخیص جدایه­های مشکوک، رنگ آمیزی گرم، مشاهده منظره کلونی­ها، آزمایش کاتالاز و کوآگولاز انجام شد. به این ترتیب پنج جدایه خالص استافیلوکوکوس اورئوس از موارد ورم پستان گاو جدا شد. شیرهای مربوط به دام‏های سالم با توجه به عدم وجود علایم بالینی، منفی شدن آزمایش CMT و عدم رشد نمونه در محیط کشت تأیید شد.

تهیه نمونه خون

نمونه خون هپارینه از پنج مورد گاو مبتلا به ورم پستان (‏باکتری استافیلوکوکوس اورئوس از آن‏ها جدا شد) و از پنج مورد گاو سالم در دو لوله استریل و در هر لوله به میزان پنج میلی‏لیتر گرفته شد. یکی از نمونه­های خون در هر مورد به منظور جدا سازی نوتروفیل و نمونه دیگر به منظور جدا سازی مونوسیت استفاده شد (12).

جدا سازی نوتروفیل­ها

نوتروفیل­ها با استفاده از داروی مگلومین[3] (10 گرم سدیم دیاتریزوات، 66 گرم مگلومین دیاتریزوات و 37 گرم ید در 100 میلی‏لیتر محلول (دارو پخش – تهران) جدا سازی شد. به این ترتیب که مقدار پنج میلی‏لیتر خون هپارینه به نسبت 1:1 با سرم فیزیولوژی 9/0 در صد رقیق شد. مگلومین به نسبت 3:1 (سه میلی‏لیتر سرم فیزیولوژی و یک میلی‏لیتر مگلومین) در سه لوله مجزا مخلوط شد و به طور کامل ورتکس شد. سپس، با استفاده از سمپلر دو میلی‏لیتر خون رقیق شده به آهستگی و ملایمت به هر یک از لوله­های حاوی مگلومین رقیق شده اضافه، لوله­ها به مدت 15 دقیقه در2500 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی لوله­ها تخلیه و سلول‏های باقیمانده با سرم فیزیولوژی 9/0 در­صد همگن شد و محتویات سه لوله در یک لوله استریل جمع­آوری شد. 5/0 میلی‏لیتر سرم فیزیولوژی 9/0 در­صد به لوله اضافه شد و چند­بار عمل پیپتینگ انجام شد. سپس با استفاده از 20 میلی‏لیتر آب مقطر سرد گلبول­های قرمز لیز شد و بلافاصله 10 میلی‏لیتر سرم فیزیولوژی 55/2 درصد اضافه ­و به مدت پنج دقیقه در 2500 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع رویی لوله تخلیه و سلول­های باقیمانده با دکستروز پنج درصد به حجم یک میلی‏لیتر همگن شد. تعداد و زنده مانی نوتروفیل­ها با استفاده از رنگ تریپان بلو تعیین شد (13).

جدا سازی مونوسیت­ها

به منظور جدا­سازی مونوسیت­ها، ابتدا سلول­های تک هسته­ای نمونه­های خون به شکل زیر جدا­سازی شد. هم حجم خون گرفته شده، محیط کشت RPMI 1640 اضافه شد و خون رقیق شد و به آهستگی بر روی پنج میلی‏لیتر هیستوپک (سیگما– ایالات متحده امریکا1083) اضافه شد به نحوی که دو فاز کاملاً جدا مشخص شود، سپس مجموعه فوق با سرعت 2000 تا2500 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. لایه مربوط به سلول­های تک هسته­ای خون محیطی[4] از فاز میانی با استفاده از پیپت پاستور و پوار در زیر هود جمع آوری و به درون لوله فالکون تیوپ استریل انتقال داده شد سپس هم حجم سلول­ها، محیط کشت RPMI1640 اضافه و به منظور حذف هیستوپک و پلاکت به ترتیب یک بار با سرعت 2000 دور در دقیقه و بار دیگر با سرعت 1000 دور در دقیقه، هرکدام به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد.

 در مرحله بعد، مایع رویی تخلیه و پس از بهم زدن یک میلی‏لیتر محیط کشت RPMI اضافه شد. تعداد و زنده مانی مونوسیت‏ها با استفاده از رنگ تریپان بلو تعیین شد (14).

تهیه عوامل مترشحه استافیلوکوکوس اورئوس

دو لوپ از باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (‏ATCC23219) که قبلاً در محیط کشت مانیتول سالت آگار کشت داده شده بود درAssay medium (30 میلی‏لیتر محیط کشت1640 RPMI،‏ 5٪ FBSو 1٪ L- glutamine) کشت و در دمای 37 درجه سانتی‏گراد به مدت 6 تا 12 ساعت انکوبه شد. لوله کشت در 3500دور در هر دقیقه به مدت پنج دقیقه در دمای 15 درجه سانتی‏گراد سانتریفیوژ شد. مایع رویی جمع آوری و میزان پروتئین موجود در آن به روش براد فورد تعیین و تا زمان استفاده در فریزر منفی20 درجه سانتی‏گراد نگهداری شد (15).

سنجش میزان پروتئین به روش برادفورد

 سنجش میزان پروتئین به روش برادفورد با استفاده از کیت شرکت بیورد[5] و بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده کیت انجام شد. به این ترتیب که ابتدا رقت­های سریال یک تا 16/1 از محلول استاندارد کیت تهیه شد. 100میکرولیتر از هر رقت در یک لوله ریخته و پنج میلی‏لیتر محلول رنگی رقیق شده (20 میلی‏لیتر محلول رنگی کیت و 80 میلی‏لیتر آب دیونیزه) به آن اضافه شد. لوله­ها ورتکس و جذب نوری آن‏ها در عرض پنج دقیقه تا یک ساعت در طول موج 595 نانومتر خوانده شد. منحنی استاندارد بر اساس جذب نوری بدست آمده رسم شد، سپس غلظت پروتئین موجود در عوامل مترشحه به ترتیب ذکر شده و بر اساس منحنی استاندارد به میزان 400 میکروگرم در میلی­لیتر  تعیین شد.

سنجش میزان زنده مانی نوتروفیل‏ها

به منظور سنجش میزان تأثیر عوامل مترشحه بر زنده مانی نوتروفیل­ها، به روش فلوسیتومتری کشت از نوتروفیل­ها و عوامل مترشحه از باکتری تهیه شد. ابتدا تعداد نوتروفیل­ها در هر میلی‏لیتر به میزان 105×5 تنظیم شد.در یک میکروپلیت 6 چاهک، چهار چاهک برای آزمایش و دو چاهک برای کنترل انتخاب شد. در چاهک­های شماره یک تا چهار محیط کشت RPMI و50 میکرولیتر نوتروفیل با تراکم سلولی 105×5 به ترتیب همراه با غلظت­های 400، 800، 1200 و 1600 میکروگرم در میلی­لیتر از عوامل مترشحه اضافه شد. به‏طوری‏که حجم چاهک­ها با تغییر میزان محیط RPMI در200 میکرولیترتنظیم شد.همچنین در هر یک از چاهک­های پنج (چاهک کنترل نوتروفیل بدون رنگ آمیزی) و 6 (کنترل نوتروفیل با رنگ آمیزی) 50 میکرولیتر نوتروفیل با تراکم سلولی 105×5 و 150 میکرولیتر محیط کشت RPMI ریخته و سپس میکروپلیت به مدت سه ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و پنج در صد دی‏اکسید‏کربن انکوبه شد.

رنگ آمیزی با Annexin/PI

پس از اتمام دوره انکوباسیون، محتویات هر یک از چاهک­ها در فالکون­های جداگانه 15 میلی‏لیتری ریخته شد. لازم به ذکر است که قبل از آن برروی آن‏ها شماره چاهک (نمونه) درج شده بود. پس از آن، لوله­های فالکون در 1200 دور در هر دقیقه به مدت 8 دقیقه سانتریفیوژ و مایع رویی خارج شد. 100 میکرولیتر ABB[6] (6/2 گرم HEPES،‏ 18/8 گرم NaCl و 28/0 گرم CaCl2در یک لیتر آب) به هر لوله اضافه شد. باچند بار پیپتیگ محتویات لوله­ها به شکل سوسپانسیون در آمد. محلول Annexin آماده، به هر کدام به میزان 50 میکرولیتر اضافه و به مدت 15 دقیقه در دمای آزمایشگاه در تاریکی انکوبه شد. لوله­ها در 1200 دور در هر دقیقه به مدت 10 دقیقه در دمای چهار درجه سانتی‏گراد سانتریفیوژ و مایع رویی آن‏ها به آرامی خارج شد.

 به هر کدام از لوله­ها 200 میکرولیتر ABB اضافه شد. در آخرین مرحله به تمام لوله‏ها به استثنا لوله شماره پنج (کنترل نوتروفیل بدون رنگ آمیزی)، 20 میکرولیتر پروپیدیوم آیداید[7] (سیگما - آمریکا) اضافه شد. به هر یک از لوله­ها 5/1 میلی‏لیتر بافر فاکس (1/0 گرم سدیم آزاید،یک گرم BSA و 2/0 گرم EDTA در 100میلی‏لیتر PBS) اضافه و نتایج توسط فلوسیتومتری (شرکت Partec – آلمان و نرم افزار FlowMax) خوانده شد (31).

سنجش میزان زنده مانی مونوسیت­ها

سنجش میزان تأثیر عوامل مترشحه بر زنده مانی مونوسیت­ها با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس انجام شد. به این ترتیب که کشت توام مونوسیت و عوامل مترشحه از باکتری به عمل آمد. به هر فلاسک کشت T25 تعداد 106×10 سلول تک هسته­ای خون محیطی ریخته شده به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و پنج در صد دی اکسید کربن انکوبه شد.

سلول­های غیر چسبنده جدا و مونوسیت­های چسبنده به تعداد تقریبی 105×10 در فلاسک باقی ماند. عوامل مترشحه با غلظت نهایی 400، 800، 1200 و 1600 میکروگرم در میلی­لیتربه فلاسک اضافه و به مدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و پنج در صد دی‏اکسید‏کربن انکوبه شد.

پس از اتمام دوره انکوباسیون 60 دقیقه ای،نمونه­ها باAcridine Orange به میزان 10µl/ml PBS و به مدت 15 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و پنج در صد دی‏اکسید‏کربن رنگ آمیزی شد. پس از شستشو باPBS 10 میکرولیتر پروپیدیوم آیداید (PI) (‏شرکت سیگما- آمریکا) اضافه شد و به مدت پنج دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و پنج درصد دی اکسید کربن انکوبه شد (31).

در آخرین مرحله پس از شستشو با PBS، تعداد یک صد سلول شمارش و سلول­های زنده، آپوپتوز اولیه، آپوپتوز تأخیری و نکروز شده به شرح جدول 1 تعیین شد.

جدول 1- مقایسه سلول­های زنده، آپوپتوز اولیه، آپوپتوز تاخیری و نکروز

PI (پروپیدیوم آیداید)

AO (آکریدین اورنج)

نوع سلولی

منفی

مثبت و هسته طبیعی

زنده

منفی

مثبت و هسته متراکم

آپوپتوتیک اولیه

مثبت

مثبت و هسته متراکم

آپوپتوتیک نهایی

مثبت

مثبت و هسته متورم

نکروتیک

 

تحلیل آماری

نتایج این مطالعه با برنامه Graph Pad Prism Software (version 5.03. Graph Pad Software Inc. San Diego, California) تفسیر و بررسی شد. مقایسه بین گروه‌ها توسط paired t-test انجام شده، مقدار 05/0>p معنی‌دار در نظر گرفته شد.

 

نتایج

نتایج مطالعه­ حاضر نشان داد که عوامل مترشحه از باکتری استافیلوکوکوس اورئوس  ATCC 23219بر مونوسیت­ها ونوتروفیل­ها در گاوان سالم و بیمار تأثیرات متفاوتی دارد. مراحل مختلف آپوپتوز در مونوسیت­های جدا شده از خون محیطی گاوان سالم و بیمار با استفاده از رنگ اکریدین اورنج و پروپیدیوم آیداید بررسی شد (‏شکل1).

 

 

شکل 1- بررسی آپوپتوز القا شده در مونوسیت‏های جدا شده از خون محیطی گاوان مبتلا به ورم پستان توسط عوامل مترشحه از باکتری استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 23219 با استفاده از رنگ آکریدین اورنج و پروپیدیوم آیداید.

 

نتایج حاصل از تأثیر عوامل مترشحه از باکتری استافیلوکوکوس اورئوسATCC 23219 بر زنده مانی نوتروفیل­ها و مونوسیت­های جدا شده از گاوان سالم و مبتلا به بیماری ورم پستان نشان داد که در مورد گاوان سالم عوامل مترشحه حاوی 800 میکروگرم در میلی­لیتر پروتئین (EXT100) و در مورد گاوان مبتلا به بیماری  400 میکروگرم در میلی­لیتر پروتئین (EXT50) بیشترین مرگ سلولی مونوسیت­ها و نوتروفیل­ها را داشته است (شکل2).


 

 

شکل 2- نمودار میزان مرگ مونوسیت­های خون محیطی گاوان سالم (الف) و مبتلا به بیماری ورم پستان ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس (ب) تحت تأثیر غلظت‏های مختلف عوامل مترشحه از باکتری استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 23219.

 

بررسی مراحل مختلف آپوپتوز در مونوسیت­ها و نوتروفیل­های گاوان سالم و مبتلا به بیماری نشان داد که حضور عوامل مترشحه در گاوان سالم موجب کاهش آپوپتوزدر مونوسیت­ها و در گاوان بیمار موجب افزایش آپوپتوز در آن‏ها شد. یعنی مونوسیت‏های گاوان مبتلا حساسیت بیشتری نسبت به عوامل مترشحه از باکتری نشان دادند و مرگ آن‏ها از طریق آپوپتوز انجام گرفته و میزان آپوپتوز در گاوان مبتلا بیشتر است (شکل3).

نتایج فلوسیتومتری سنجش میزان آپوپتوز درنوتروفیل‏های گاوان مبتلا به ورم پستان ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس نیز در شکل 4 آمده است

 

 

 

 

 

شکل3- نمودار میزان آپوپتوژ اولیه، آپوپتوز تاخیری و نکروز القا شده در مونوسیت­های گاوان سالم (الف) و مبتلا به بیماری ورم پستان ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس (ب) توسط غلظت­های مختلف عوامل مترشحه از باکتری استافیلوکوکوس اورئوس
 ATCC 23219.

شکل 4- نمونه­ایاز نمودار فلوسیتومتری سنجش میزان آپوپتوزدر نوتروفیل­های گاوان مبتلا به ورم پستان ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس. مثبت بودن رنگ­های Ann-V/PI بر اساس گیت نوتروفیل­ها ارزیابی شده است.

 

 


 

شکل 5- میزان مرگ نوتروفیل­های خون محیطی گاوان سالم (الف) و مبتلا به بیماری ورم پستان استافیلوکوکی (ب)تحت غلطت‏های مختلف عوامل مترشحه از باکتری استافیلوکوکوس اورئوسATCC 23219.

 

 

 

میزان مرگ نوتروفیل‏های خون محیطی در گاوان سالم و مبتلا به ورم پستان ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس در اثرعوامل مترشحه آن در شرایط کشت در شکل 5 آمده است.

در مورد آپوپتوز اولیه، تأخیری و نکروز، حضور عوامل مترشحه در نوتروفیل­های گاوان سالم موجب افزایش آپوپتوز و نکروز و در مورد نونروفیل‏های گاوان بیمار باعث کاهش آپوپتوز آن‏ها شده است. یعنی نوتروفیل­های گاوان سالم حساسیت بیشتری نسبت به عوامل مترشحه نشان داده اند و میزان آپوپتوز و نکروز در گاوان سالم بیشتر است (‏شکل 6)

مقایسه میزان مرگ سلولی و آپوپتوز در مونوسیت­ها و نوتروفیل­های گاوان سالم و مبتلا به ورم پستان در شکل 7 آمده است.

 

 

 

 

 

شکل6- میزان آپوپتوز اولیه، آپوپتوز تاخیری و نکروز القا شده در نوتروفیل­های گاوان سالم (الف) و مبتلا به بیماری ورم پستان ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس (ب) توسط غلظت­های مختلف عوامل مترشحه از باکتری استافیلوکوکوس اورئوس
 ATCC 23219.

 

 

 

 

شکل 7- مقایسه میزان مرگ سلولی وآپوپتوز در مونوسیت­ها و نوتروفیل­های گاوان سالم و مبتلا به ورم پستان ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس که تحت تأثیر عوامل مترشحه از باکتری استافیلوکوکوس اورئوسATCC 23219 قرار گرفته اند. مقایسه میزان مرگ سلولی در مونوسیت­ها و نوتروفیل­های گاوان سالم (الف)، مقایسه میزان مرگ سلولی در مونوسیت­ها و نوتروفیل­های گاوان بیمار (ب)، مقایسه میزان آپوپتوز در مونوسیت­ها و نوتروفیل­های گاوان سالم (ج)و مقایسه میزان آپوپتوز در مونوسیت­ها و نوتروفیل­های گاوان بیمار (د).

 

 

در نهایت وقتی گاوان به بیماری ورم پستان استافیلوکوکوس اروئوس مبتلا می­شوند، عوامل مترشحه از این باکتری تأثیر بیشتری روی مونوسیت­ها نسبت به نوتروفیل­ها دارند.

 

بحث

استافیلوکوکوس اورئوس یکی از مهم‏ترین عوامل ایجاد کننده ورم پستان در گاو محسوب می­شود. این باکتری به منظور ایجاد تورم پستان باید از طریق مجرای سر پستانک وارد غده پستان شده و با ایجاد اختلال در عملکرد سیستم ایمنی ذاتی و اکتسابی مکانیسم­های دفاعی غده پستانی را تحت تأثیر قرار ­دهد (16).

 این عمل به واسطه یک سری عوامل حدت انجام می­شود. این عوامل در دیواره سلولی باکتری قرار داشته و یا به شکل پروتئین­های خارج سلولی (اگزو پروتئین‏ها) ترشح می­شوندکه شامل کپسول (17)، پپتیدوگلیکان، اسیدهای تیکوئیک، آگلوتینوِژن­ها، پروتئین A، عامل جمع کننده (کوآگولاز متصل1) (18)، استافیلوکوآگولاز، استافیلوکیناز، هیالورونیداز (19)، همولیزین­ها (α،β،γ،δ)، لکوسیدین­ها (20)، توکسین‏های اکسفولیاتیو B)،(A،‏ پیگمان‏های متصل به سلول[viii] به‏نام کارتنوئید، انتروتوکسین­ها (SEA-SEI) و توکسین-1 سندرم شوک توکسیک (TSST-1) می‏باشند (21).

 از این رو در مطالعه حاضر، تأثیرعوامل مترشحه از باکتری استافیلوکوکوس اورئوسATCC 23219 که پس از کشت در محیط آزاد می‏شوند بر روی زنده مانی دو سلول مهم سیستم ایمنی یعنی نوتروفیل‏ها و مونوسیت‏ها بررسی شد. به این ترتیب که نوتروفیل‏ها و مونوسیت­ها در مجاورت غلظت­های مختلف عوامل مترشحه قرار گرفته، میزان مرگ سلولی به روش آپوپتوز و نکروز با استفاده از رنگ­های Annexin V و PI، دستگاه فلوسیتومتری و روش ایمنوفلورسانس سنجش شد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که در مورد مونوسیت‏های گاوان سالم و بیمار به ترتیب غلظت 800 میکروگرم در میلی­لیتر(EXT100) و غلظت 400 میکروگرم در میلی­لیتر(EXT50) از عوامل مترشحه باعث بیشترین مرگ سلولی شدند. از طرفی، حضور عوامل مترشحه بر روی مونوسیت‏های گاوان بیمار در مقایسه با مونوسیت‏های گاوان سالم تأثیر بیشتری بر القا آپوپتوز داشت.

در مورد نوتروفیل‏ها نیز همانند مونوسیت‏ها در گاوان سالم غلظت بیشتر و در گاوان بیمارغلظت کمتر عوامل مترشحه باعث بیشترین مرگ سلولی می‏شدند. ولی در مورد آپوپتوز بر خلاف مونوسیت‏ها، حضور عوامل مترشحه آپوپتوز بیشتری را در نوتروفیل‏های گاوان سالم در مقایسه با گاوان مبتلا القا نمود.

نتایج این مطالعه نشان داد که هم در گاوان سالم و هم بیمار میزان مرگ نوتروفیل‏ها در حضور عوامل مترشحه از باکتری استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 2321 در مقایسه با مونوسیت‏ها بیشتر است (‏شکل 7 الف و ب). از نظر تأثیر عوامل مترشحه بر میزان آپوپتوز، مقایسه بین گاوان سالم و بیمار نشان داد که میزان آپوپتوز نوتروفیل­ها در گاوان سالم بیشتر از مونوسیت­ها است ولی این پدیده در مورد گاوان بیمار بر عکس است. یعنی در گاوان بیمار در حضور عوامل مترشحه مونوسیت‏ها بیشتر از نوتروفیل‏ها دچار آپوپتوز می‏شوند.

عوامل متعددی از جمله آنچه در بالا به آن‏ها اشاره شد، در عوامل ترشح شده از استافیلوکوکوس اورئوس وجود دارند که باعث مرگ سلول­های خونی اعم از مونوسیت­ها و نوتروفیل­ها چه از طریق نکروز و چه از طریق آپوپتوز می­شوند (22).

یکی از عوامل مهم موجود در ترشحات باکتری استافیلوکوکوس اورئوس، لکوسیدین­ها هستند که علاوه بر اثرات زیستی، موجب مهار پاسخ ایمنی بر علیه این باکتری می‏شوند. مطالعات به عمل آمده نشان می‏دهد هر چند لکوسیدین مترشحه از استافیلوکوکوس اورئوس قادر به القا آپوپتوز در نوتروفیل­های انسانی هستند، در دوز بالا باعث مرگ سلولی به روش نکروز می‏شوند (23).

مطالعات انجام شده نشان می­دهد نه تنها استافیلوکوک­ها بلکه اگزوتوکسین مترشحه از پاستورلا‏ها نیز باعث مرگ سیستمیک ماکروفاژها و نوتروفیل­ها از طریق آپوپتوز و نکروز ثانویه می‏شوند (24).

عامل دیگری که در ترشحات استافیلوکوک‏ها یافت می‏شود Panton-Valentine Leukocidin (PVL) است که در غلظت پایین باعث آپوپتوز و در غلظت بالا باعث نکروز نوتروفیل‏ها می‏شود (25 و 26). PVL استافیلوکوکوس اورئوس یک عامل سیتوتوکسیک بسیار قوی برای نوتروفیل­های انسان است (25).

پدیده‏ ای که در این مطالعه نیز مشاهده شد، شاید به همین خاطر است که گفته می‏شود آپوپتوز در مونوسیت‏ها و نوتروفیل‏های گاوان مبتلا به ورم پستان استافیلوکوکی یا اشریشیا کلی تسریع می‏شود (27 و 28).

Phenol-Soluble modulin (PSM) ماده دیگری از ترشحات استافیلوکوکها است که باعث القا آپوپتوز خود بخودی مونوسیت‏ها و نوتروفیل‏ها می‏شود (28، 29 و 30). البته میزان القا آپوپتوز به مدت زمان سنجش آنپس از بر خورد با عوامل مترشحه نیز بستگی دارد؛ به‏طوری که گفته می‏شود در طی 36 ساعت LPS باعث کاهش آپوپتوز و افزایش تعداد نوتروفیل­های زنده می‏شود. علاوه بر این، در صد سلول­های نکروز شده از 9 به 30 درصد افزایش می­یابد (31). مقاومت در برابر القا آپوپتوز به شرایط سلولی نیز بستگی دارد به طوری که حرارت دادن مونوسیت­ها از طریق القا HSP72 باعث مقاومت آن‏ها در برابر آپوپتوز القا شده به وسیله استافیلوکوکوس اورئوس می­شود (32).

در مورد مکانیسم القا آپوپتوز توسط ترشحات استافیلوکوکوس اورئوس در سلول‏های سیستم ایمنی به خصوص نوتروفیل‏ها و مونوسیت‏ها نظریات متفاوتی بیان می­شود از جمله این‏که گفته می‏شود این باکتری از طریق فعال سازی کاسپازهای 6 و9 (27) و یا القا ترشح FasL در سرم یا سطح سایر سلول­ها باعث القا آپوپتوز در مونوسیت‏ها و نوتروفیل‏ها می‏شود (33). آن‏چه از یافته‏های سایر مطالعات و تحقیق حاضر بر می‏آید این است که، ترشحات استافیلوکوکوس اورئوس باعث القا آپوپتوز و تا حدودی نکروز هم در نوتروفیل‏ها و هم در مونوسیت‏های گاوان سالم و بیمار می‏شود. ولی این سلول‏ها در گاوان بیمار نسبت به مرگ سلولی حساس‏تر از گاوان سالم هستند از طرفی در گاوان سالم نوتروفیل‏ها و در گاوان بیمار مونوسیت‏ها نسبت به مرگ سلولی حساس‏ترند. بنابراین، به نظر می‏رسد در گاوان بیمار نوتروفیل‏ها مقاومت بیشتری از خود در مقابل آپوپتوز القا شده نشان می‏دهند. آنچه مسلم است تعیین دقیق محتویات ترشحات باکتری و نیز مکانیسم عمل آن‏ها به روشن شدن مطلب کمک خواهد کرد.



[1]. Microbial surface components adhesive matrix molecules recognizing

[2]. Californi Mastitis Test

[3]. Meglumin                                                               

[4]. Periphral mononuclear cells

[5]. Bio Rad KIt

[6]. Annexin binding buffer

[7]. Propedium iodide

[viii]. Cell bound pigment

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

References:

(1) Sordillo LM, Streicher KL. Mammary gland immunity and mastitis susceptibility. Mammary Gland Biology and Neoplasia 2002; 7 (2): 135-46.

(2) Hornef MW, Wick MJ, Rhen M, Normark S. Bacterial strategies for overcoming host innate and adaptive immune responses. Nat Immunol 2002; 3(11): 1033-40.

(3) Marechal C, Seyffert N, Jardin J, Hernandez D, Jan D, Rault L, et al. Molecular basis of virulence in staphylococcus aureus mastitis. PLOS ONE 2011; 6(11): e27345.

(4) Watts JL. Etiological agents of bovine mastitis. Vet Microbial 1988; 16(1): 41-66.

(5) Watts JL, Pankey J W, Oliver W M, Nickerson S C, Lazarus AW. Prevalence and effects of mastitis in beef cows. Anim. Sci 1986; 62(1): 16-20.

(6) Biberstein E, Hirsh D. Staphylococcuses. In: Songer JG, Post KW, Veterinary Microbiology. 1st ed, UK: Blackwell Science; 2005. P 115-26.

(7) Newbould FHS, Neave FK. The recovery of small numbers of Staphylococcus aureus infused into the bovine cistern. Dairy Res 1965; 32: 157-62.

 

(8) Nickerson SC. Immunological aspects of mammary involution. Dairy sci 1989; 72: 1665-78.

(9) Loeb L. The influence of certain bacteria on the coagulation of theblood. Med Res Inst.1993; 10: 407-19.

(10)           Kurjogi MM, Kaliwal BB. Prevalence and antimicrobial susceptibility of bacteria isolated from bovine mastitis. Advances in Applied Science Research 2011; 2(6): 229-35.

(11)           MorRis DD. Collection and submission of samples for cytologic and hematologic studies. In: Smith BP. Large animal internal medicine. 3th ed. USA: Mosby Inc; 2002. P 413-414.

(12)           Rezapour A, Majidi J. An Improved Method of Neutrophil Isolation in Peipheral Blood of Sheep. Animal and Veterinary Advances 2009; 8(1): 11-5.

(13)           Hay FC, Westwood OMR. Isolation of cells. In: Practical Immunology. 4th ed. UK: Blackwell Science; 2002. P 179-202.

(14)           Mullarky IK, Su C, Frieze N, Park YH, Sordillo LM. Staphylococcus aureus agr genotypes with entrotoxin production capabilities can resist neutrophil bactericidal activity. infection and immunity 2001;69(1): 45-51.

(15)           Bien J, Sokolova O, Bozko P. Characterization of virulence factors of Staphylococcus areus : Novel function of known virulence factors that are implicated in activation of airway epithelial proinflammatory response. Pathogens 2011; 1(2):10(3):2-16.

(16)           Riodan KO, Lee JC. Staphylococcus aureus capsular polysaccharides. Clin Microbial. Reviews 2004; 17(1): 218-34.

(17)           Evelyn J, Walsh HM, Oleg V, Gorkun T, Foster J. Identification of the Staphylococcus areus MSCRAMM clumping factor B (CIfB) binding site in the ac-domain of human fibrinogen. Molecular microbiology 2007; 154(2): 550-58.

(18)           Coulter SN, Schwan WR, Ng EY, Langhorne MH, Ritchie HD, Westbrockwadman S, Hufnagle WO, Folger KR, Bayer AS, Stover CK. Staphylococcus areus genetic loci impacting growth and survival in multiple infection environments. Molecular Microbiology 1998; 30: 393-404.

(19)           Gravet A, Colin DA, Keller D, Giradot R, Monteil H, Prevost G. Characterization of a novel structural member, LukE-LukD, of the bi-component Staphyloco ccal leucotoxins family. FEBS letters 1998; 465: 202-8.

(20)           Dinge MM, Orwin PM, Schlievert PM. Exotoxins of Staphylococcus areus. Clinical microbiology reviews 2000; 13: 16-34.

(21)           Yamamoto CH, Yoshida S I, Taniguchi H, Qin MH, Maymoto H, Mizuguchi Y. Lipopolysaccharide and granulocyte colony-stimulating factor delay neutrophil apoptosis and ingestion by guinea pig macrophages. Infect. Immun 1993; 61(3): 1972-79.

(22)           Genestier AL, Michallet MC, Prévost G, Bellot G, Chalabreysse L, Peyrol S, et al. Staphylococcus areus Panton-Valentine leukocidin directly mitochondria and induces Bax-dependent apoptosis of human neutrophils. Clin Invest 2005; 115: 3117-27.

(23)           Vale AD, Costa-Ramos C, Silva ASP, Silva D, Gartner FMS, dos Santos NT, Silva M. Systemic macrophage and neutrophil destruction by secondary necrosis induced by a bacterial exotoxin in a Gram-negative septicemia. Cellular Microbiology 2007; 9(7): 988-1003.

(24)           Loffler B, Hussain M, Grundmeier M, Bruck M, Holzinger D, Varga G, et al Staphylococcus areus panton-valentine leukocidin is a very potent cytotoxic factor for human neutrophils. Plos Pathogens 2010; 6(1): 1-12.

(25)           Fox S, Leitch AE, Duffin R, Haslett C, Rossi AG. Neutrophil apoptosis: Relevance to the Innate Immuno Response and Inflammatory Disease. Innate Immun 2010; 2: 216-27.

(26)           Wang JH, Niu HY, Zhang M, He Ping, Zhang Y, Kan L. Apoptosis induced by Staphylococcus arureus in human monocytic U937 cells involves Akt and mitogen-activated protein (MAPK) phosphorylation. Biotechnology 2011; 10 (21): 4318-27.

(27)           Tharwat M. Accelerated neutrophil apoptosis in cows affected with acute Mastitis. Agricultural and Veterinary Sciences 2011;4(2): 125-34.

(28)           Weinrauch Y, Zychlinsky A. The induction of apoptosis by bacterial pathogens. Annu Rev Microbiol 1999; 53: 155-87.

(29)           Liles WC, Thomsen RO, Mahony DS, Klebanoff SJ. Stimulation of human neutrophils and monocytes by Staphylococcal phenol-soluble modulin. Leu. Bio 2001; 70: 96-102.

(30)           Turina M, Miller FN, Mchugh PP, Cheadle WG, Polk JrH. Endotoxin inhibits apoptosis but induces primary necrosis in neutrophils. Inflammation 2005; 29(1): 55-63.

(31)           Guzik K, Bzowska M, Dobrucki J, Pryjma, J. Heat-shocked monocytes are resistant to Staphylococcus arureus-induced apoptotic DNA fragmentation due to expression of HSP72. Infection and immunity 1999; 67(8): 4216-22.

(32)           Nwakoby IE, Reddy K, Patel P, Shah N, Sharma S, Bhaskaran M. Fas-Mediated Apoptosis of Neutrophils in Sera of Patients with Infection. Infection and immunity 2001; 69 (5): 3343-3349.