ردیابی مولکولی استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس یوبریس در شیرهای ورم پستانی گاوها در استان اصفهان

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، ایران

2 دکتری دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، ایران

3 استادیار بیماری‏های تولید مثل دام، دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، ایران

چکیده

مقدمه: ورم پستان یکی از شایع‏ترین و مهم‏ترین بیماری‏های گله‏های گاو شیری است. ورم پستان یک بیماری التهابی غده پستان است که ‏به‏وسیله‏ عوامل عفونی زیادی ایجاد می‏‏شود. استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس یوبریس به فراوانی از نمونه‏های شیر ورم پستانی گاو جدا شده اند. مواد و روش‏‏ها:. درکل 123 نمونه شیر از گاوان مبتلا به ورم پستان بالینی جمع آوری و بلافاصله به آزمایشگاه انتقال داده شد. شیر این مطالعه، به منظور بررسی میزان شیوع استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس یوبریس در شیر گاوان مبتلا به ورم پستان بالینی در گاوداری‏های صنعتی اطراف اصفهان، انجام شد ‏های ورم پستانی ‏به‏وسیله‏ آزمایش‏ ورم پستان کالیفرنیایی تأیید و همه نمونه‏ها با استفاده از آزمایش‏‏های میکروبی و بیوشیمیایی آزمایش شدند. در نهایت همه 123 نمونه با واکنش زنجیره ای پلیمراز دوباره ارزیابی شدند. نتایج: نتایج روش کشت نشان داد که باکتری‏های استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس یوبریس به ترتیب در 13 و 31/7 درصد‏ از نمونه‏های شیر، تشخیص داده شدند. واکنش زنجیره ای پلیمراز نشان داد که باکتری‏های استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس یوبریس به ترتیب در 51/19‏ و56/10 درصد‏ از نمونه‏های شیر تشخیص داده شدند. بحث و نتیجه‏گیری: نتایج این بررسی نشان داد، واکنش زنجیره ای پلیمراز برای تشخیص دو باکتری استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس یوبریس از دقت بالایی برخوردار است. ما استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز را برای کنترل کیفیت میکروبی نمونه‏های شیر، پیشنهاد می‏‏کنیم.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Molecular detection of Streptococcus uberis and Streptococcus agalactiae in the mastitic cows milks in Isfahan province

نویسندگان [English]

  • Hassan Momtaz 1
  • Mohammad Seyed Froutan 2
  • Taghi Taktaz 3
  • Mojtaba Sadeghi 2
1 Associate Professor of Microbiology, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Iran,
2 DVM, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Iran
3 Assistant Professor of Theriogenology, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Iran
چکیده [English]

Introduction: Mastitis is one of the most prevalent and important diseases in dairy cow herds. It is an inflammatory disease of mammary gland which is caused by many infectious agents. Streptococcus uberis and Streptococcus agalactiae have been frequently isolated from bovine mastitic milk. This research was carried out to study the prevalence of Streptococcus uberis and Streptococcus agalactiae in the milk of cows with clinical mastitis in industrial dairy farms around the province of Isfahan. Materials and Methods: In total, 123 milk samples were collected from cows with clinical mastitis and then, were immediately transferred to the laboratory. Mastitic milks were confirmed using California Mastitis Test and then, all samples were tested using microbial and biochemical tests. Finally, all 123 samples were tested using PCR. Results: Culture results showed that 16% and 7.31% of the milk samples were positive for Streptococcus agalactiae and Streptococcus uberis, respectively. The PCR showed that 19.51% and 10.56% of the samples were infected with Streptococcus agalactiae and Streptococcus uberis, respectively. Discussion and Conclusion: This study showed that the Polymerase Chain Reaction has a higher accuracy and safety than the culture method. Therefore, we recommend the use of Polymerase Chain Reaction for inspection of microbial quality of milk samples.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Streptococcus agalactiae
  • Streptococcus uberis
  • Mastitic milk
  • Isfahan

مقدمه

شیر و فراورده‏های آن، به عنوان یک غذای کامل به ویژه برای نوزادان و سالمندان محسوب می‏‏شوند. ارزش غذایی بالای آن از نظر پروتئین، مواد معدنی، ویتامین‏ها و چربی، انکار ناپذیر است. تولید شیر یک فرایند پیچیده است که با فعالیت کامل غدد پستانی انجام می‏‏شود. به لحاظ شکل و محل آناتومیکی بافت پستان، امکان آلوده شدن آن نه تنها در زمان تماس پستان با بستر آلوده، بلکه در زمان شیردوشی نامناسب، وجود دارد. سندرم ورم پستان یکی از بیماری‏های مهم در پستانداران، به ویژه به علت‏ استرس شیردوشی که به گاوان وارد می‏‏شود، در گاو شیری می‏‏باشد.

ورم پستان به التهاب بافت پارانشیم غدد پستانی گفته می‏‏شود که باعث تغییرات مرضی در غدد پستانی و تغییرات فیزیکی و شیمیایی در شیر می‏‏شود. ضررهای اقتصادی ناشی از ورم پستان تنها محدود به هزینه‏های درمانی و دامپزشکی، کاهش تولید شیر و بیرون ریختن شیر به علت‏ آنتی بیوتیک درمانی نمی‏شود، حذف دام مبتلا می‏‏تواند ضرر اقتصادی بزرگ‏تری محسوب شود (1). تغییر رنگ شیر، لخته در شیر، افزایش سلول‏های بدنی و گلبول‏های سفید در شیر، تغییرات بافت پارانشیم غدد پستانی که با ملامسه قابل تشخیص است، از تغییرات پاتولوژیک در ورم پستان هستند. از بین عوامل عفونی فراوانی که باعث ایجاد ورم پستان می‏‏شوند، گونه‏های استرپتوکوک یکی از مهم‏ترین عوامل میکروبی این بیماری به حساب می‏‏آیند (2 و 3). مخزن اصلی استرپتوکوک‏ها و به ویژه‏ استرپتوکوکوس آگالاکتیه، انسان و خوک می‏‏باشند، به همین علت شیوع این نوع از ورم پستان، نشان دهنده عدم رعایت موازین بهداشتی در سالن شیردوشی است. علاوه بر این، عفونت‏های حاصل از استرپتوکوکوس یوبریس متداول‏ترین‏ ورم پستان دوره خشکی محسوب می‏‏شود، که ابتدا و انتهای دوره خشکی بروز می‏‏نماید (4). استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس یوبریس دو باکتری گرم مثبت و بیماری‏زای پستان گاوهای شیری هستند. علاوه بر این، استرپتوکوک‏ها یکی از عوامل شایع ایجاد عفونت‏های عمومی‏‏ و مننژیت در نوزادان و همچنین بیماری‏های مهاجم در زنان باردار بوده و می‌توانند در بزرگسالان با شرایط زمینه‌ای مانند نقص سیستم ایمنی نیز بیماری ایجاد کنند (5). اهمیت این دو باکتری آنقدر بالا بوده که تاکنون بیشتر داروهای مبارزه با ورم پستان برای آن‏ها‏ ساخته شده اند.

در بیشتر موارد درمان صحیح و به موقع ورم پستان در گاوهای شیری، مرهون تشخیص سریع و قابل‏ اعتماد بیماری هستند. امروزه روش‏های تشخیصی گوناگونی مانند آزمایش‏ ورم پستان کالیفرنیایی[1]، روش‏های مولکولی مانند انواع واکنش‏های زنجیره ای پلیمراز[2] و روش کشت میکروبی، برای تشخیص ورم پستان و روش‏های مولکولی و کشت میکروبی برای جداسازی عوامل عفونی ایجادگر بیماری، طراحی شده‏اند (6، 7 و 8). این تحقیق، به منظور بررسی میزان شیوع دو باکتری استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس یوبریس در شیر گاوان مبتلا به ورم پستان بالینی درگاوداری‏های صنعتی اطراف استان اصفهان، به دو روش کشت میکروبی و PCR انجام شده است.

 

مواد و روش‏ها

نمونه‏ها، CMT و کشت میکروبی

در تابستان سال 1391 در کل 123 نمونه شیر از گاوان مبتلا به ورم پستان بالینی از گاوداری‏های صنعتی اطراف اصفهان، جمع آوری شد. کلیه 123 نمونه شیر با رعایت شرایط بهداشتی کامل، در روز نمونه گیری در مجاورت یخ، به مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، انتقال داده شدند. کلیه 123 نمونه شیر با روش CMT ارزیابی شدند (6). به منظور جداسازی استرپتوکوک از نمونه‏های شیر مورد مطالعه، 10 میکرولیتر از هر نمونه در محیط آگار محتوی خون حاوی پنج درصد خون گوسفند، 10 میلی‏گرم در لیتر کلیستین و 15 میلی‏گرم در لیتر نالیدیکسیک اسید کشت و به مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتی‏گراد گرمخانه‏گذاری شد. پرگنه‏های واجد کوکسی‏های گرم مثبت و کاتالاز منفی به عنوان پرگنه‏های مشکوک به استرپتوکوک انتخاب و برای‏ تشخیص گونه باکتری دو آزمایش CAMP با استفاده از باکتری استافیلوکوک اورئوس و آزمایش هیدرولیز نشاسته روی آن‏ها انجام گرفت. پرگنه‏هایی که آزمایش‏ CAMP آن‏ها مثبت و هیدرولیز اسکولین آن‏ها منفی بود به عنوان استرپتوکوکوس آگالاکتیه و پرگنه‏هایی که هر دو آزمایش‏ آن‏ها منفی بود به عنوان استرپتوکوکوس یوبریس قلمداد شدند.

استخراجDNA

DNA ژنومیبه شکل مستقیم از نمونه‏های شیر، ‏به‏وسیله‏ کیت استخراج DNA ساخت شرکت سیناژن ایران[3] و با توجه به دستورالعمل کیت سازنده استخراج و تا زمان انجام PCRدر فریزر منفی20 درجه سانتی‏گراد نگهداری شد.

واکنش زنجیره ای پلیمراز

واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از پرایمر‏های اختصاصی برای ژن S rDNA16 دو باکتری استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس یوبریس، انجام شد. توالی پرایمرهای طراحی شده برای تشخیص استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس یوبریس در جدول 1 نشان داده شده اند.کلیه شرایط واکنش با توجه به روش‏های پیشین انجام شد (3 و 9). در نهایت محصولات PCR روی ژل آگاروز 5/1 درصد حاوی اتیدیوم بروماید در ولتاژ ثابت 90 ولت الکتروفورز و با استفاده از نور UV ارزیابی شد.

 

 

جدول 1- توالی پرایمر‏های اختصاصی برای تشخیص استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس یوبریس در شیر گاو‏های مبتلا به ورم پستان بالینی

نام باکتری

ژن هدف

توالی پرایمر

اندازه محصول(bp)

منابع

استرپتوکوکوس آگالاکتیه

S rDNA16

F: 3’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGA-5’

R: 3’-CGGGTGTTACAAACTCTCGTGGT-5’

1400

3

استرپتوکوکوس یوبریس

S rDNA16

F: 3’-CGC TGA GGT TTG GTG TTT ACA-5’

R: 3’-CAC TCC TAC CAA CGT TCT TC-5’

405

9

 


بررسی آماری

به منظور تجزیه و تحلیل آماری نتایج از آزمایش‏ مربع کای و نرم افزار آماری SPSS ویرایش 16 استفاده شد‏. در این بررسی، P value < 0.05 به عنوان معنی دار، معرفی شد.

نتایج

کلیه 123 نمونه شیر جمع آوری شده از گاوان مبتلا به ورم پستان بالینی در آزمایش‏ ورم پستان کالیفرنیایی مثبت3 بودند. پس از کشت شیرهای مورد مطالعه، باکتری‏های استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس یوبریس به ترتیب 16 و 9 نمونه تشخیص داده شدند (جدول 2). واکنش زنجیره ای پلیمراز نشان داد که از کل 123 نمونه شیر، باکتری‏های استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس یوبریس به ترتیب در 24 و 13 نمونه تشخیص داده شدند (جدول 2). بنابراین، روش واکنش زنجیره ای پلیمراز از دقت بالایی برای تشخیص باکتری‏های استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس یوبریس در نمونه‏های شیر، برخوردار است.

 

 

شکل 1- واکنش زنجیره ای پلیمراز برای‏ تشخیص باکتری‏های استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس یوبریس در نمونه‏های شیر. (ستون M: نشانگر‏ 1 کیلو بازی DNA، ستون 1= نمونه کنترل منفی، ستون‏های 2 تا 4: نمونه‏های مثبت برای باکتری استرپتوکوکوس آگالاکتیه و ستون‏های 5 تا 7: نمونه‏های مثبت برای باکتری استرپتوکوکوس یوبریس)

 

جدول 2- مقایسه دو روش کشت میکروبی و واکنش زنجیره‏ای پلیمراز در تشخیص دو باکتری استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس یوبریس در شیر گاوان مبتلا به ورم پستان بالینی در گاوداری‏های صنعتی اطراف اصفهان

نام باکتری

درصد نمونه‏های مثبت در روش کشت

درصد نمونه‏های مثبت در واکنش زنجیره ای پلیمراز

استرپتوکوکوس آگالاکتیه

13

51/19

استرپتوکوکوس یوبریس

31/7

56/10

بحث و نتیجه گیری

تاکنون به کارآمدی، دقت، سرعت و اطمینان روش واکنش زنجیره ای پلیمراز برای تشخیص گونه‏های استرپتوکوک، توجه زیادی شده است (9 و 10). در این مطالعه، بین میزان آلودگی شیرها به استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس یوبریس، اختلاف معنی‏دار (P<0.05) مشاهده شد‏. به عبارت دیگر میزان شیوع استرپتوکوکوس آگالاکتیه به مراتب از استرپتوکوکوس یوبریس، بیشتر بوده است. مطالعه ای در مصر (11) نشان داد که 12/3 درصد‏ شیرهای ورم پستانی از نظر حضور باکتری استرپتوکوکوس آگالاکتیه، مثبت بوده اند که این مقدار به مراتب از نتایج این پژوهش کمتر بوده است (51/19 درصد‏). مطالعه ای در کالیفرنیا (12) نشان داد که از بین 362 نمونه استرپتوکوکی که از گاوان مبتلا به ورم پستان جدا شده بودند، 9/39 درصد‏ آن‏ها استرپتوکوکوس یوبریس و 2/42 درصد‏ آن‏ها استرپتوکوکوس دیس آگالاکتیه بوده اند. مطالعه دیگری در کشور کره (13) نشان داد که از کل 178 نمونه استرپتوکوکی که از گاوان ورم پستانی جدا شده بودند، 99 نمونه استرپتوکوکوس یوبریس و پنج نمونه استرپتوکوکوس آگالاکتیه بوده اند که با نتایج این بررسی مغایرت دارد. مطالعه ای در کشور انگلیس نشان داد که میزان شیوع باکتری استرپتوکوکوس یوبریس و اشریشیا کلی در شیر‏های ورم پستانی به ترتیب 5/23 درصد‏ و 8/19 درصد‏ بوده است (14).

بررسی دیگری در کشور نیجریه نشان داد که از بین 200 نمونه شیر گاوان مبتلا به ورم پستان بالینی، 130 استرپتوکوک جدا شد که از بین آن‏ها استرپتوکوکوس یوبریس، استرپتوکوکوس آگالاکتیه، استرپتوکوکوس دیس آگالاکتیه، استرپتوکوکوس زواپیدمیکوس، استرپتوکوکوس بوویس و استرپتوکوکوس اکویینیس به ترتیب با میزان شیوع 4/55، 6/24‏، 3/12‏، 9/3‏، 3/2‏ و 5/1 درصد‏ بیشترین و کمترین فراوانی را داشته اند (8). بررسی دیگری نشان می‏‏دهد که پستان 73 درصد‏ گاوان بریتانیایی به باکتری استرپتوکوکوس یوبریس آلوده بوده ولی این باکتری تنها عامل 14 درصد‏ از ورم پستان‏های بالینی بوده است (15).

نتایج این بررسی، که بیانگر میزان شیوع کمابیش‏ بالای استرپتوکوکوس یوبریس و استرپتوکوکوس آگالاکتیه در شیر گاوان مبتلا به ورم پستان بالینی می‏‏باشد، تأیید کننده نتایج بررسی‏های کیف[iv] و اکین و گورتوک[v] می‏‏باشد که به ترتیب میزان شیوع را 44‏ و 7/44 درصد‏ بیان کردند (17و16). این بررسی، نشان داد که میزان شیوع باکتری استرپتوکوکوس یوبریس به مراتب از میزان شیوع باکتری استرپتوکوکوس آگالاکتیه کمتر بوده است. علاوه بر این بین میزان شیوع این دو باکتری اختلاف آماری معنی دار، مشاهده شد. با وجود این، مطالعات بسیاری میزان شیوع باکتری استرپتوکوکوس یوبریسرا بیشتر دانسته اند (12، 14 و 15) که به نظر می‏‏رسد که منطقه جغرافیایی و شاید آب و هوا عامل‏های خطرسازی برای میزان شیوع این دو باکتری هستند.

این بررسی در استان اصفهان، نشان داد که گونه‏های استرپتوکوک و به ویژه‏ استرپتوکوکوس آگالاکتیه سهم بیشتری در بروز ورم پستان بالینی دارند. پیشنهاد می‏‏شود که کلیه کارکنان گاوداری‏ها، به ویژه‏ کارکنان سالن‏های شیر دوشی بهداشت کامل را رعایت کنند. ضد عفونی کردن سرپستانک‏ها، شیردوشی منظم از گاوان و جلوگیری از انباشته شدن شیر در پستان، استفاده از دستکش‏های بهداشتی در سالن شیردوشی و در نهایت ضد عفونی کردن سالن شیر دوشی، به ویژه‏ دستگاه شیردوش از اهمیت بالایی در کنترل و کاهش بروز ورم پستان برخوردار هستند. نویسندگان این مقاله استفاده از روش دقیق، سریع و قابل اعتماد واکنش زنجیره ای پلیمراز را برای بررسی و کنترل کیفیت بهداشتی شیر و تشخیص انواع میکروارگانیسم‏های بیماری زا، پیشنهاد می‏‏کنند.

تشکر و قدردانی

کلیه نویسندگان این مقاله از کارکنان محترم مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد اسلامی شهرکرد و همچنین آقایان دکتر محمد‏هاشم فاضلی، دکتر شاهین نجات و دکتر فرهاد صفرپور دهکردی کمال تشکر و قدردانی را دارند. این بررسی در تابستان سال 1391 در مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد انجام شد.



[1]. California Mastitis Test (CMT)

[2]. Polymerase Chain Reaction (PCR)

[3]. DNPTM DNA Purification KIT

[iv] . Keefe

[v] . Ekin and Gurturk

References

(1) Sordelli DO, Buzzola FR, Gomez MI, Steele-Moore L, Berg D, Gentilini E, et al. Capsule expression by bovine isolates of Staphylococcus aureus from Argentina: genetic and epidemiologic analyses. J Clin Microbiol 2000; 38(2): 846-50.

(2)  Fortin M, Messier S, Paré J, Higgins R. Identification of catalase-negative, non-beta-hemolytic, gram-positive cocci isolated from milk samples. J Clin Microbiol 2003; 41(1): 106-9.

(3)  Khan IU, Hassan AA, Abdulmawjood A, Lämmler C, Wolter W, Zschöck M. Identification and epidemiological characterization of Streptococcus uberis isolated from bovine mastitis using conventional and molecular methods. J Vet Sci 2003; 4(3): 213-24.


(4) Myllys V, Rautala H. Characterization of clinical mastitis in primiparous heifers. J Dairy Sci 1995; 78(3): 538-45.

(5)  Ko WC, Lee HC, Wang LR, Lee CT, Liu AJ, Wu JJ. Serotyping and antimicrobial susceptibility of group B Streptococcus over an eight-year period in southern Taiwan. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2001; 20(5): 334-9.

(6) Schalm OW, Noorlander DO. Experiments and observations leading to development of the California mastitis test. J Am Vet Med Assoc 1957; 130(5): 199-204.

(7) Vieira-da-Motta O, Folly MM, Sakyiama CCH. Detection of different Staphylococcus aureus strains in bovine milk from subclinical mastitis using PCR and routine techniques. Braz J Microbiol 2001; 32(1): 27-31.

(8) Amosun EA, Ajuwape ATP, Adetosoye AI. Bovine Streptococcal mastitis in Southwest and Northern states of Nigeria. Afr J Biomed Res 2010; 13(1): 33-7.

(9)  Riffon R, Sayasith K, Khalil H, Dubreuil P, Drolet M, Lagacé J. Development of a rapid and sensitive test for identification of major pathogens in bovine mastitis by PCR. J Clin Microbiol 2001; 39(7): 2584-9.

(10)            Meiri-Bendek I, Lipkin E, Friedmann A, Leitner G, Saran A, Friedman S, et al. A PCR-based method for the detection of Streptococcus agalactiae in milk. J Dairy Sci 2002; 85(7): 1717-23.

(11)           Abd El-Razika KA, Abdelrahmanb KA, Ahmeda YF, Gomaac AM, Eldebakya HA. Direct identification of major pathogens of the bubaline subclinical mastitis in Egypt using PCR. J Am Sci 2010; 6(1): 652-60.

(12)           Rossitto PV, Ruiz L, Kikuchi Y, Glenn K, Luiz K, Watts JL, et al. Antibiotic susceptibility patterns for environmental streptococci isolated from bovine mastitis in central California dairies. J Dairy Sci 2002; 85(1): 132-8.

(13)            Nam HM, Lim SK, Kang HM, Kim JM, Moon JS, Jang KC, et al. Antimicrobial resistance of streptococci isolated from mastitic bovine milk samples in Korea. J Vet Diagn Invest 2009; 21(5): 698-701.

(14)            Bradley AJ, Leach KA, Breen JE, Green LE, Green MJ. Survey of the incidence and aetiology of mastitis on dairy farms in England and Wales. Vet Rec 2007; 160(8): 253-7.

(15)            Bramley AJ, Dodd FH. Reviews of the progress of dairy science: mastitis control--progress and prospects. J Dairy Res 1984; 51(3): 481-512.

(16)            Keefe GP. Streptococcus agalactiae mastitis: a review. Can Vet J 1997; 38(7): 429-37.

(17)            Ekin IH, Gurturk K. Characterization of bovine and human group B streptococci isolated in Turkey. J Med Microbiol 2006; 55(Pt 5): 517-21.