تنوع زیستی باکتری های نمک دوست و تحمل کننده نمک سواحل غربی دریاچه ارومیه

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران

2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران

3 دانشیار میکروبیولوژی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

4 مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی، تهرااستادیار ژنتیک مولکولی، مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی، تهران، ایرانن، ایران

چکیده

مقدمه: دریاچه ارومیه واقع در شمال ‌غربی ایران بزرگ‏ترین دریاچه دائمی ایران و یکی از سه دریاچه شور دائمی در سطح جهان است. از چهار منطقه غربی این دریاچه نمونه‌برداری انجام شد و تنوع میکروارگانیسم‌ها با روش‌های مبتنی بر کشت و مستقل از کشت بررسی شد. مواد و روش‏‏ها: در روش مبتنی بر کشت، باکتری‏های هالوفیل و هالوتالرنت در شرایط هوازی در چهار محیط کشت‌ MH، SWN، SWNLN و MHLN جداسازی شدند. جدایه‌ها بر اساس تفاوت‌های کلونی، واکنش گرم، رنگ‌آمیزی اسپور و ویژگی‌های بیوشیمیایی اولیه تفکیک شدند. محتوای ژنومی نمونه‌های محیطی آب و خاک برای بررسی‌های مستقل از کشت استخراج شد. با استفاده از تکثیر S rRNA16 و کلونینگ کتابخانه ژن S rRNA16 تهیه و 20 درصد کلون‌های نوترکیب حاصل تعیین ترادف شدند. نتایج: از بین 217 جدایه حاصل در روش مبتنی بر کشت ژن S rRNA16 برای 52 سویه ترادف‌یابی شد که از نظر فیلوژنتیک در جنس‌های Halobacillus، Halomonas، Planococcus، Gracilibacillus، Bacillus، Pontibacillus، Paracoccus، Marinobacter، Providencia، Staphylococcus، Alkalibacterium، Sanguibacter، Lysobacter، Kocuria، Pontibacter، Salicola، Micrococcus، Oceanobacillus، Brevundimonas، Thalassobacillus، Microbacterium و Piscibacillus قرارگرفتند. در روش مستقل از کشت کلون‌های بررسی شده در جنس‌های Salinibacter، Adhaeribacter و Cesiribacter قرار‌گرفتند. بحث و نتیجه‏گیری: در روش مبتنی بر کشت بین جدایه های تعیین توالی شده 18 جدایه شباهت کمتر از 7/98 درصد با سویه استاندارد نشان دادند که محدوده مرزی برای ارائه گونه جدید میکروبی بومی است. در روش مستقل از کشت کلون‌های بررسی شده در گروه Bacteroidetes قرار‌گرفتند. که مشابه با سایر گزارش‌های موجود در مورد محیط‌های پر شور بررسی شده است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Biodiversity of moderately halophilic and halotolerant bacteria in the western coastal line of Urmia lake

نویسندگان [English]

  • Maliheh Mehrshad 1
  • Mohammad Ali Amoozegar 2
  • Bagher Yakhchali 3
  • Abolhassan Shahzedeh Fazeli 4
1 Ph.D student of Microbiology, University of Tehran, Iran
2 Associate Professor of Microbiology, University of Tehran, Iran,
3 Associate Professor of Microbiology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran
4 Assistant Professor of Molecular Genetics, Iranian Biological Resource Center and Genetic Department, Tehran, Iran,
چکیده [English]

  Introduction: Urmia Lake, located in the northwest of Iran, is the largest permanent lake in Iran and one of the three permanent hypersaline lakes in the world. Microbial sampling from four western different regions of the lake was done and then, biodiversity of the samples were studied by culture dependent and culture independent methods.   Materials and Methods: In culture dependent methods, halophilic and halotolerant bacteria were isolated under aerobic condition on four growth media, MH, SWN, MHLN and SWNLN. Differentiation of bacterial isolates was performed based on colony features, Gram staining and primary biochemical tests. In culture independent method, environmental DNA from water and soil samples were extracted. After 16S rRNA PCR amplification 16S rRNA library was constructed and 20% of clones were sequenced.   Results: Within 217 purified isolates in culture dependent methods, 52 strains were selected for 16S rRNA gene sequencing and representatives of Halobacillus, Halomonas, Planococcus, Gracilibacillus, Bacillus, Pontibacillus, Paracoccus, Marinobacter, Providencia, Staphylococcus, Alkalibacterium, Sanguibacter, Lysobacter, Kocuria, Pontibacter, Salicola, Micrococcus, Oceanobacillus, Brevundimonas, Thalassobacillus, Microbacterium and Piscibacillus genera were identified. In culture independent method, selected clones belonged to Salinibacter ، Adhaeribacter and Cesiribacter genera.   Discussion and Conclusion : In culture dependent selected strains 18 strains showed less than 98.7% sequence similarity to the closest known strains and were representatives as new taxa of Urmia lake. In culture independent method selected clones belonged to Bacteroidetes category. Data obtained from this study were similar to other scientific reports from hypersaline lakes .

کلیدواژه‌ها [English]

  • Halotolerant bacteria
  • Moderately halophilic bacteria
  • Biodiversity
  • Urmia Hypersaline Lake

مقدمه:

تنوع زیستی مفهوم بسیار مهمی است که پایه و اساس حیات روی کره‌ی زمین را تشکیل می‌دهد. روابط بین انسان و سایر موجودات کره‌ی زمین به‌گونه‌ای به هم پیوند خورده که نابودی یک گونه می‌تواند یکی از امکانات زندگی انسان را کاهش دهد. بنابراین حفاظت از محیط زیست و اطمینان از پایداری و همه‌جانبه بودن توسعه‌ی آن از چالش­های مهمی است که جامعه‌ی جهانی با آن روبرو است. امروزه برای مطالعه‌ی تنوع زیستی، سطوح سلسله‌ مراتبی مختلفی شامل تنوع ژنتیکی، تنوع ارگانیسمی یا تاکسونومیک و تنوع بوم‌شناختی در نظر گرفته می‌شوند (1). آگاهی از الگوی تنوع زیستی میکروارگانیسم‌ها از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است؛ چرا که میکروارگانیسم‌ها دارای بیشترین تعداد افراد در روی زمین هستند (2). علاوه بر این، باکتری‌ها واسطه بسیاری از فرآیند‌‌‌های محیطی هستند که باعث حفظ حیات در روی کره زمین می‌شوند. همچنین، تنوع آن‌ها از اهمیت عملی زیادی در حذف زیستی[1] و اکتشاف زیستی[2] برخوردار است.

با وجود تعداد زیاد میکروارگانیسم‌ها، دانش بشری تنها نسبت به بخش بسیار کمی ازآن‌ها آگاهی دارد. تا کنون بین 1 تا1/0 درصد از گونه‌های باکتریایی موجود توصیف شده‌اند (3). اکثر باقی‌مانده گونه‌های باکتریایی (حدود 105×4 تا 106× 3 گونه) ناشناخته باقی مانده‌اند که بیشتر این میکروارگانیسم‌ها با روش‌های موجود، در آزمایشگاه قابل کشت نیستند (4).

روش‌های مستقل از کشت، از قبیل انواع مبتنی بر ماده ژنتیکی استخراج شده از محیط، شناسایی گونه‌های غیر قابل کشت را امکان‌پذیر و شرایط را برای پیشرفت تصویر کامل‌تر و جزیی‌تری از اجتماعات باکتریایی فراهم کرده است (5). توصیف فیلوژنتیک مورد قبول از گونه پروکاریوتی عبارت از سویه‌های با وابستگی DNA-DNA برابر 70 درصد یا بیشتر است (6). به‌علاوه تمامی سویه‌های متعلق به یک گونه باید سطح قابل قبولی از ثبات صفات فنوتیپی را داشته باشند و توصیف یک گونه باید با بیش از یک سویه شاخص انجام شود. تنها زمانی می‌توان نام گونه را به گروهی از میکروارگانیسم‌ها اطلاق کرد که حداقل در یک صفت فنوتیپی تشخیصی از سایر گونه‌ها متمایز شده باشند (7). سویه‌های با میزان شباهت RNA ریبوزومی 7/98 درصد یا کمتر همیشه اعضای گونه‌های متفاوت خواهند بود؛ زیرا تفاوت زیاد در توالی S rRNA16 با احتمال زیادی نشان دهنده وابستگی DNA-DNA کمتر از 70 درصد است (8).

ایران دارای تنوعی از محیط­های پر شور است. این محیط­ها شامل معادن نمکی، بیابان­های پر شور، رودخانه­های نمکی و به ویژه دریاچه­های نمک است. دریاچه ارومیه دریاچه نمک مهارلو، تالاب بختگان، دریاچه نمک اینچه­برون و دریاچه نمک آران و بیدگل از جمله دریاچه­های نمکی ایران هستند. دریاچه ارومیه بزرگ‏ترین و شورترین دریاچه دائمی ایران و یکی از دریاچه­های فوق اشباع از نمک دنیا است که از این نظر با دریاچه نمک بزرگ آمریکا شباهت دارد. درازای این دریاچه 140 و پهنای آن بین 15 تا 50 کیلومتر و مساحت آن بین 5000 تا 6000 کیلومتر مربع بر حسب میزان بارش و تبخیر است. سطح حوضه آبریز دریاچه ارومیه حدود 50000 کیلومتر مربع است. میزان شوری این دریاچه در زمستان 220 گرم در لیتر است که در تابستان تا 280 گرم در لیتر افزایش می­یابد. با توجه به اهمیت و پراکندگی بالای مناطق شور در ایران و همین‏طور نقش مطالعات تنوع زیستی در توسعه زیربنایی دانش کشور، باکتری های نمک دوست نسبی و تحمل کننده نمک هتروتروف هوازی سواحل غربی دریاچه پرشور ارومیه به روش‏های مبتنی بر کشت و مستقل از کشت بررسی شدند. هدف ما بررسی تنوع زیستی این دریاچه با استفاده از الگوی پلیفازیک مبتنی بر کشت و مستقل از کشت و شناسایی تاکسون­های احتمالی ارائه شده در این روند پس از این پژوهش است. با توجه به اهمیت اکولوژیک بسیار بالای دریاچه ارومیه به عنوان ذخیره­گاه بیوسفر و در معرض خطر بودن آن انجام این گونه مطالعات به منظور ارائه نقشه ژنتیکی کامل پروکاریوتی این دریاچه با ارزش در آینده نزدیک و حفظ محتوای ژنتیکی این زیست بوم بسیار ضروری به نظر می­رسد.

 

مواد و روش­ها

نمونه برداری

با توجه به وسعت دریاچه ارومیه و شرایط بوم شناختی متنوع آن برای تمرکز بر روی تنوع زیستی دریاچه، نوار ساحلی غربی این دریاچه به‌عنوان محل نمونه‌برداری انتخاب شد. برای نمونه‌گیری، نوار ساحلی غربی دریاچه از نظر دسترسی به چهار ناحیه‌ی مختلف تقسیم شده و در هر کدام از این نواحی حداقل از پنج منطقه نمونه‌برداری انجام شد. نمونه‌های جمع آوری شده از محیط شامل آب، خاک، بلور‌های نمک و بقایای گیاهی بودند که در مهرماه 1389 از نوار ساحلی غربی دریاچه‌ی ارومیه جمع‌آوری شده و در شرایط سترون به آزمایشگاه منتقل شدند. موقعیت جغرافیایی هر یک از نقاط نمونه‌برداری توسط GPS مشخص و ثبت شده است. میزان اسیدیته و دمای نمونه‌ها به‌ترتیب توسط  pHمتر و دماسنج در محل نمونه‌گیری با استفاده از دماسنج قابل حمل، اندازه‌گیری شد. میزان شوری نمونه‌ها نیز با استفاده از دستگاه مالتی‌متر شرکت MettlerToledo مدل Multiseven و پس از انتقال نمونه‌ها به آزمایشگاه اندازه‌گیری شد. تحلیل شیمیایی ترکیبات نمونه­ها برای سنجش عناصر موجود در نمونه‏ها در دانشکده زمین شناسی دانشگاه تهران با استفاده از روش نور سنجی شعله­ای[3] انجام شد. نمونه­ها در آزمایشگاه در دمای چهار درجه سلسیوس نگهداری شدند.

کشت و جدا سازی باکتری­ها

برای رسیدن به تنوع کامل­تری از باکتری‌های نمک‌دوست نسبی و تحمل کننده‌ی نمک هتروتروف هوازی، لازم است از محیط کشت‌های متنوعی استفاده شود. شرایط محیط کشت‌های مورد استفاده بر اساس شرایط اقلیمی دریاچه و همچنین، نیازمندی‌های انواع مختلف این باکتری‌ها انتخاب شده‌اند. محیط کشت‌های MH و SWN با اسیدیته مختلف و SWN و MH با میزان کم ماده غذایی (SWNLN و MHLN) به‌منظور جداسازی بیشترین جدایه‌های ممکن استفاده شدند. مشخصات محیط‌های کشت مورد استفاده برای جداسازی در جدول 1 آورده شده است. تلقیح نمونه‌های خاک، رسوب و نمک با استفاده از روش رقت‌های متوالی تا رقت 5-10 بر روی محیط های مورد استفاده برای جداسازی انجام شد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 1- مشخصات محیط‌های کشت مورد استفاده برای جداسازی

* سترون سازی کلیه محیط­ها در دمای 121 درجه سلسیوس، فشار 15 psi و زمان 15 دقیقه انجام شده است.

* محیط­های MH و SWN با اسیدیته‏های 5/7 و 5/9 و محیط­های LNMHو LNSWN با اسیدیته 5/7 استفاده شدند.

نام محیط کشت

ترکیبات

NaCl

MgCl2.6H2O

MgSO4.7H2O

CaCl2.2H2O

KCl

NaHCO3

NaBr

Yeast Extract

Meat Extract

Peptone

Glucose

Sucrose

Agar

Moderate Halophilic Medium (MH)

101

7

6/9

36/0

2

06/0

026/0

10

-

5

1

-

15

Modified halophilic medium (1125) low nutrient (LNMH)

101

7

6/9

36/0

2

06/0

026/0

1/0

-

-

-

5/0

15

Sea water Nutrient Agar (SWN)

20

3

5

05/0

5/0

-

-

1

2

5

-

-

15

Modified halophilic medium (1125) low nutrient (LNSWN)

20

3

5

05/0

5/0

-

-

1/0

-

-

-

5/0

15

                       

 

برای تلقیح نمونه‌های آب، از رسوب حاصل از سانتریفوژ آب برای تلقیح مستقیم به محیط کشت استفاده شد. محیط‌های تلقیح شده در دمای 34 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شدند. کلونی‌های رشد کرده روی محیط‌های جامد در دوره‌های زمانی 24، 48 و 72 ساعت جداسازی و خالص‌سازی شدند. به‌منظور دسترسی به بیشترین میزان تنوع و جداسازی انواع کند ‌رشد، پلیت‌ها با استفاده از تامین رطوبت در محیط نگهداری و استفاده از پارافیلم دور پلیت­ها به مدت 6 ماه نگهداری شده و در بازه‌های زمانی دو هفته‌ای بررسی و کلونی‌های جدید جداسازی شدند. در هر مرحله کلونی‌های دارای مشخصات ریخت‌شناسی (شکل، اندازه، رنگ، قوام، حاشیه و برآمدگی سطحی) متفاوت جداسازی شدند. این کلونی‌ها در شرایط مشابه محیط جداسازی نگهداری شدند (9).

خالص­سازی، نگهداری و نامگذاری سویه­ها

 به منظور خالص­سازی جدایه­ها کشت متوالی از تک کلونی انجام شد. کلونی‌هایی که پس از پنج بار کشت متوالی بر روی محیط­های با مشخصات ثابت از نظر واکنش گرم و ریخت‌شناسی رفتار ثابتی از خود نشان دادند به‌عنوان کلونی خالص در نظر گرفته شدند (9).

توصیف اولیه سویه ها

توصیف اولیه سویه ها بر اساس تعیین صفات اولیه ماکروسکوپی، میکروسکوپی و فیزیولوژیک انجام شد. برای مشاهده‌ی ویژگی‌های ماکروسکوپی کلونی، از محیط جامد با ترکیب مورد استفاده برای جداسازی استفاده شده، شکل، ارتفاع، حاشیه، سطح و رنگ کلونی جدایه‌ها مورد توجه قرار گرفت. شکل میکروسکوپی جدایه‌ها توسط میکروسکوپ نوری و بزرگنمایی 1000 مشاهده شد. برای تایید نتایج حاصل از رنگ‌آمیزی گرم از روش KOH سه درصد توصیه شده توسط بارون[iv] استفاده شد (10). حرکت سلول با استفاده از روش لام مرطوب بررسی شد. برای مشاهده حرکت از بزرگنمایی 400 میکروسکوپ نوری استفاده شد. برای بررسی فعالیت کاتالازی از کشت 24 ساعته جدایه‌ها و پراکسید هیدروژن سه درصد به‌عنوان معرف استفاده شده و تولید حباب به عنوان واکنش مثبت درنظر گرفته شد. برای بررسی فعالیت اکسیدازی از دیسک‌های آماده اکسیداز (شرکت پادتن طب) استفاده شد(11). حدود 25 درصد سویه­ها به شکل تصادفی برای شناسایی تکمیلی استفاده شدند.

تفکیک سویه های نمک دوست نسبی و تحمل کننده نمک

سویه های منتخب از نظر تعلق به گروه نمک دوست‏های نسبی و یا تحمل کننده نمک تفکیک شدند. برای ایجاد تفکیک بین میکروارگانیسم‌ها بر اساس نیاز و پاسخ به غلظت‌های مختلف نمک، غلظت کلی نمک‌های موجود در محیط مطرح است. بنابراین، برای تفکیک جدایه‌ها از نظر تعلق به گروه‌های نمک‌دوست نسبی یا تحمل کننده نمک از محیط با کمترین میزان ماده آلی - که تامین کننده رشد برای سویه­های مورد بررسی باشد- استفاده شد. لازم است از افزوده شدن نمک و اسمولیت‌های ناخواسته به محیط کشت نیز اجتناب شود. محیط کشت فوق با مقادیر مختلف صفر، 5/0، 3، 5، 5/7، 10، 15، 20 و 25 درصد نمک از نمک کلی دریا 30 درصد با ترکیب زیر (گرم در لیتر) تهیه، هر یک از جدایه‌های منتخب بر روی کلیه این محیط‌ها کشت داده شده و در دمای 34 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شدند.

Yeast extract, 5; Sea Water 30%: NaCl, 234; MgCl2.6H2O, 39; CaCl2, 1; MgSO4.7H2O; KCl, 6; NaHCO3, 0.2; KBr, 0.7

درصدی از نمک که نخستین رشد ادامه‌دار باکتری در آن مشاهده شد، به‌عنوان درصد نمک بهینه برای رشد در نظر گرفته شد. گرماگذاری تا 10 روز ادامه یافت و محدوده نمک قابل تحمل برای رشد جدایه‌ها مشخص شد. جدایه‌های با رشد بهینه در محدوده 3 تا 15 درصد نمک به‌عنوان نمک‌دوست نسبی و جدایه‌های با توانایی رشد در محیط فاقد نمک و رشد بهینه در محیط با نمک کمتر از سه درصد به‌عنوان تحمل‌کننده‌ی نمک در نظر گرفته شدند(12، 13 و 14).

شناسایی مولکولی و تحلیل فیلوژنتیک جدایه‌های منتخب

شناسایی تکمیلی جدایه‌های منتخب با تکثیر و تعیین توالی ژن S rRNA16 انجام شد. برای این منظور، ابتدا از جدایه‌های منتخب، توده زیستی تهیه شده و پس از استخراج DNA ژنومی جدایه­ها (15)، تکثیر ژن مربوط به زیر واحد کوچک ریبوزومی انجام شد. این تکثیر با استفاده از پرایمرهای عمومی S rRNA16، 27F با توالی (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)، 1492R با توالی

(5’-GGTTACCTTGTTACGACT T-3’) و پرایمر 1488R با توالی

(5’-CGGTTACCTTGTTACGACTTCACC-3’) و از طریق واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بود (16). استخراج DNA ژنومی و تکثیر ژن S rRNA16 با استفاده از الکتروفورز ژل آگاروز تایید شد. به‌ منظور تکثیر ژن
S rRNA16 با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز بافر با غلظت X1 در ترکیب نهایی، MgCl2با غلظت 5/2 تا 5/0 میلی‏مول، dNTP با غلظت 4/0 میلی‏مول از هر کدام، آنزیم Taq DNA پلیمراز به میزان50/U2 میکرولیتر و پرایمر‏های رفت و برگشت از هر کدام به میزان 5/0 تا 4/0 میلی‏مول و DNA الگو به میزان مناسب استفاده شد. در انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز از نمونه با شرایط مشابه با سایرنمونه‌ها که در آن به‌جای DNA الگو از آب مقطر تزریقی استفاده شده بود، به‌عنوان شاهد منفی استفاده ‌شد. برای انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز از واسرشت اولیه با دمای 95 درجه سانتی‏گراد به مدت پنج دقیقه و 30 چرخه تکرار شونده شامل واسرشت با دمای 95 درجه سانتی‏گراد و اتصال با دمای بین 56 تا 59 درجه سانتی‏گراد هر کدام به مدت 60 ثانیه و سنتز با دمای 72 درجه سانتی‏گراد به مدت 50 تا 60 ثانیه و پس از اتمام 30 چرخه برای سنتز نهایی دمای 72 درجه سانتی‏گراد برای مدت 7 دقیقه در نظر گرفته شد. محصول نهایی حاصل از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز توسط روش ختم سنتز DNA [v] به شکل رفت و برگشت تعیین ترادف شد (شرکت ماکروژن کره جنوبی). نتایج حاصل از آن با استفاده از نرم افزار ChromasPro ویرایش شده و با استفاده از نرم افزار BLAST با توالی‏های معتبر ثبت شده در پایگاه داده EzTaxon (17) مقایسه، نزدیک­ترین سویه از نظر توالی ژن
S rRNA16 مشخص شد. تحلیل فیلوژنتیک سویه­ها پس از یافتن توالی­های مشابه و همراستاسازی توالی­ها، ویرایش و رسم درخت فیلوژنتیک با استفاده از نرم‏افزارهای ClustalX (ویرایش دوم) (18)، Bioedit (19) و MEGA (ویرایش پنجم) (20) و با الگوریتم Neibour-Joining (21) رسم شد. بررسی اعتبار شاخه‏های درخت با استفاده از الگوریتم Bootstrapanalysis و با 100 بار نمونه­گیری انجام شد (22). توالی­های حاصل از این پژوهش در بانک ژنی NCBI ثبت شدند.

استخراج محتوای ژنومی نمونه­های محیطی

به‌منظور استخراج DNA از نمونه‌های آب و خاک از روش ارائه شده توسط بنلوچ[vi] و همکاران استفاده شد (23).

بررسی تنوع زیستی با استفاده از روش کلونینگ- تعیین توالی

در این روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده ازDNAاستخراج شده از محیط برای استحصال ژن
S rRNA16 با استفاده از پرایمرهای عمومی باکتریایی مورد استفاده در روش قابل کشت انجام شد. برای تکثیر ژن S rRNA16 از برنامه Touchdown استفاده شد و دمای اتصال از 60 درجه سانتی‏گراد در دوره اول شروع شد و در هر دوره دو درجه سانتی‏گراد کاهش داشت تا به 50 درجه سانتی‏گراد رسید.20 دوره باقیمانده با دمای اتصال 50 درجه سانتی‏گراد انجام شد. ژ

ژن‌های
S rRNA16 تکثیر شده از نمونه‌های محیطی برای استفاده در مراحل بعد با استفاده از الکتروفورز ژل آگاروز و با استفاده از کیت استخراج DNA از ژل شرکت Roche آلمان خالص شد. با استفاده از روش کلونینگ هر یک از ژن‌های تکثیر شده که ژن
S rRNA16 مربوط به یک سویه منفرد است با استفاده از کیتT/A وکتور Fermentase به درون وکتور pTz57R/T انتقال یافته و در درون باکتری E. coliسویه DH5α به‌عنوان میزبان کلونینگ تکثیر یافت. واکنش اتصال در حجم نهایی 30 میکرولیتر (Buffer, 1; rATP, 1; vector, 1; T4 ligase, 1وDNA ورودی بسته به غلظت) انجام شد. پس از افزودن همه ترکیبات، ویال در دمای 22 درجه سانتی‏گراد برای مدت 16 ساعت قرار داده شد. بر اساس توصیه کیت و فرمول­های ارائه شده میزان ژن ورودی 25 نانوگرم محاسبه شد. سلول‌های میزبان برای انتقال وکتور ابتدا مستعد شده و سپس فرآیند ورود وکتور به درون سلول انجام شد. از روش شوک حرارتی به مدت دو دقیقه در دمای 42 درجه سانتی‏گراد برای انتقال پلاسمید به درون باکتری مستعد استفاده شد. جداسازی سلول­های واجد پلاسمید نوترکیب با استفاده از غربال‏گری سفید و آبی انجام،کلونی­های سفید انتخاب و کتابخانه­ای از آن‏ها تهیه شد. هر کدام از کلونی های سفید دارای یک ژن
S rRNA16متفاوت است. با تعیین توالی هر یک از این ژن‌ها امکان بررسی تنوع زیستی میکروارگانیسم‌های موجود در محیط مورد بررسی به‌شکل مستقل از کشت فراهم می‌شود. به‌طور تصادفی 20 کلونی برای مطالعات بعدی استفاده شد. استخراج پلاسمید با استفاده از کیت استخراج پلاسمید Bioneer انجام شد(Miniprep plasmid extraction kit, Bioneer, South Korea). از تغییر موقعیت پلاسمید واجد ژن در مقایسه با حالت اولیه در ژل آگاروز ورود ژن به پلاسمید تایید اولیه و پلاسمید های با غلظت (شدت باند) مناسب برای تعیین توالی استفاده شدند. پلاسمیدها توسط شرکت Macrogen با استفاده از پرایمرهای رفت و برگشت M13 مربوط به وکتور تعیین توالی شدند. توالی‌های به‌دست آمده با استفاده از نرم‌افزارهای Chromas و Bioedit ویرایش شدند. از نرم‌افزار Bellerphon برای ارزیابی وجود کایمر در بین قطعات تکثیر شده استفاده شد (24). توالی‌های حاصل از روش مستقل از کشت مشابه با روش ارائه شده برای توالی­های حاصل از روش قابل کشت تحلیل فیلوژنتیک شدند.

 

نتایج

تصویر دریاچه و موقعیت جغرافیایی مناطق نمونه‏برداری بر روی نقشه در شکل 1 نمایش داده شده است.

 

شکل 1- نقشه مناطق جغرافیایی نمونه برداری

 

نمونه برداری و بررسی ویژگی­های نمونه­ها

مشخصات جغرافیایی محل نمونه برداری و میزان شوری نمونه­های شاخص در جدول2 آورده شده است. بیشترین میزان شوری در منطقه باری و کمترین میزان شوری در منطقه چیچست مشاهده شد.

جدول3 ترکیب و نوع یون‌های موجود در دریاچه را نشان می­دهد. یون­های سدیم و کلر به ترتیب بیشترین میزان کاتیون و آنیون را در ترکیب این دریاچه به خود اختصاص دادند که نشان­دهنده ماهیت تالازوهالین این دریاچه است.

 

 

جدول 2- مشخصات نمونه­های شاخص مناطق نمونه­برداری

منطقه نمونه‌برداری

مختصات جغرافیایی

نوع نمونه

دما(درجه‌ی سلسیوس)

شوری

mg/L

اسیدیته

آب

نمک

خاک

باری

N: 37.59.7.87

E: 45.4.5.87

P

 

P

20

2830

5/7

دیزج

N: 37.17.52.99

E: 45.18.14.90

 

 

P

20

1000

8

چیچست

N: 37.35.33.45

E: 45.16.35.11

P

P

 

18

710

7

اسکله

N: 37.45.43.04

E: 45.18.5.88

P

P

 

18

1020

8

جدول 3- ترکیب و نوع یون­های موجود در دریاچه ارومیه

نوع یون

باری

(mg/L)

اسکله

(mg/L)

چیچست

(mg/L)

Na

10728

83812

63296

K

9750

3470

9600

Mg

16300

33700

22000

Ca

73

71

149

Fe

626/0

43/0

23/0

Ba

18

5/6

2/10

Cl

134900

236075

181700

HCO3

190

324

506

 

 

بر اساس تفاوت در ویژگی‌های اولیه از قبیل تفاوت در کلونی و رشد، تعداد 217 جدایه از نمونه‌ها و محیط‌های مختلف جداسازی به‌دست آمد. تعداد جدایه‌های اولیه منطقه باری 106، منطقه چیجست 54، منطقه دیزج 39 و منطقه اسکله 18 جدایه بود. بر این اساس، منطقه باری بیشترین میزان جدایه‌های اولیه و اسکله کمترین میزان جدایه اولیه را در بین مناطق مختلف نمونه‌برداری به خود اختصاص دادند. در شکل 3 میزان اولیه جدایه‌ها به تفکیک محیط مورد استفاده برای جداسازی، شکل میکروسکوپی و رنگ آمیزی گرم آورده شده است. محیط SWN بیشترین و محیط SWNLN و MHLN کمترین میزان جدایه‌های اولیه را به خود اختصاص داده است. در بین 52 جدایه منتخب، تعداد 27 جدایه نمک‌دوست نسبی و تعداد 25 جدایه دارای بهینه رشد کمتر از 3 درصد و تحمل کننده نمک بودند.

 

 

 

شکل 4- نمودار میزان جدایه‌های اولیه به تفکیک محیط کشت، شکل میکروسکوپی و رنگ‌آمیزی گرم

 

 

نتایج حاصل از مقایسه سویه­های منتخب از نظر میزان شباهت در توالی ژن S rRNA16 با سویه­های استاندارد ثبت شده در پایگاه داده Eztaxon در جدول 4 آورده شده است. بیشترین شباهت، 100 درصد و کمترین شباهت، 9/96 در میان سویه ها مشاهده شد.

 

جدول 4- مقایسه میزان شباهت ژن S rRNA16 سویه‌های منتخب با سویه­های استاندارد

ردیف

نام سویه منتخب

سویه استاندارد با بیشترین میزان شباهت

درصد شباهت

1

BC1

Bacillus novalis LMG 21837(T)

9/96

2

WT16

Piscibacillus salipiscarius RBU1-1(T)

8/98

3

WH2

Microbacterium testaceum DSM 20166(T)

7/97

4

WE17

Halomonas ventosae Al12(T)

4/99

5

WE16

Providencia vermicola OP1(T)

5/99

6

WB4

Paracoccus aminovorans JCM 7685(T)

9/97

7

DB2

Thalassobacillus hwangdonensis AD-1(T)

7/99

8

BH20

Bacillus daliensis DLS13(T)

5/99

9

BH3

Brevundimonas basaltis J22(T)

2/99

10

BB6

Bacillus niabensis 4T19(T)

4/97

11

BE1

Oceanobacillus picturae LMG 19492(T)

7/99

12

BD3

Micrococcus lylae DSM 20315(T)

2/99

13

BZ2

Planococcus donghaensis JH 1(T)

1/98

14

WT10

Gracilibacillus saliphilus YIM 91119(T)

98

15

WG9

Salicola salis B2(T)

3/99

16

WE21

Marinobacter adhaerens HP15(T)

1/99

17

DC2

Alkalibacterium putridalgicola T129-2-1(T)

1/99

18

BH54

Planococcus rifietoensis M8(T)

5/98

19

BH53

Pontibacter korlensis X14-1(T)

2/97

20

BH50

Bacillus pseudofirmus DSM 8715(T)

6/99

21

BH44

Staphylococcus saprophyticussubsp. bovis GTC 843(T)

5/99

22

BH41

Planococcus donghaensis JH 1(T)

8/97

23

BH6

Bacillus halmapalus DSM 8723(T)

6/97

24

BG14

Paracoccus homiensis DD-R11(T)

9/97

25

WT4

Bacillus vallismortis DSM 11031(T)

100

26

N2

Kocuria gwangalliensis SJ2(T)

3/99

27

WL12

Bacillus hwajinpoensis SW-72(T)

1/99

28

BH24

Planococcus rifietoensis M8(T)

1/98

29

BG3

Bacillus horikoshii DSM 8719(T)

98

30

DB7

Lysobacter spongiicola KMM 329(T)

100

31

WT6

Bacillus safensis FO-036b(T)

100

32

WE12

Sanguibacter marinus 1-19(T)

4/99

33

BH8

Alkalibacterium putridalgicola T129-2-1(T)

8/99

34

WN2

Staphylococcus warneri ATCC 27836(T)

8/99

35

WL3

Bacillus subterraneus DSM 13966(T)

5/99

36

WG5

Providencia vermicola OP1(T)

8/99

ادامه جدول 4

ردیف

نام سویه منتخب

سویه استاندارد با بیشترین میزان شباهت

درصد شباهت

37

BB4

Bacillus oceanisediminis H2(T)

3/99

38

A5

Marinobacter daqiaonensis YCSA40(T)

5/99

39

BG5

Planococcus antarcticus CMS 26or(T)

4/97

40

BG7

Paracoccus aestuarii B7(T)

2/99

41

DA2

Pontibacillus marinus BH030004(T)

6/99

42

DB9

Bacillus vietnamensis 15-1(T)

4/98

43

DB14

Halobacillus profundi IS-Hb4(T)

99

44

WE7

Planococcus rifietoensis M8(T)

1/99

45

WT1

Bacillus clausii KSM-K16

5/98

46

WT20

Gracilibacillus dipsosauri DD1(T)

8/99

47

BG6

Halomonas desiderata FB2(T)

9/98

48

DB8

Halobacillus profundi IS-Hb4(T)

6/98

49

WE11

Planococcus donghaensis JH 1(T)

4/98

50

WE22

Halomonas ventosae Al12(T)

3/99

51

WL1

Halomonas fontilapidosi 5CR(T)

8/99

52

WT17

Halobacillus trueperi DSM 10404(T)

5/99

 

 

درخت فیلوژنتیک کلی برای مقایسه وضعیت سویه‏های مورد بررسی و درخت فیلوژنتیک رسم شده برای سویه­های متعلق به هر شاخه، به تفکیک شاخه­های مختلف به ترتیب در شکل‏های 4، 5، 6 و 7 آورده شده است. در شکل 4 که درخت کلی سویه­های مورد بررسی به تفکیک شاخه رسم شده است، فراوانی شاخه­های مختلف در بین سویه­های مورد بررسی و رابطه فیلوژنتیک این شاخه­ها را نمایش می‏دهد. همانطور که مشاهده می‏شود، شاخه Firmicutes بیشترین میزان جدایه­ها را به خود اختصاص داده است.

 

 

شکل 4- درخت فیلوژنتیک جدایه‌ها برای نمایش روابط فیلوژنتیک با استفاده از روشNeighbor- joining

 وضریبBoot Strapصد

 وضریبBoot Strapصد

.

شکل 5- درخت فیلوژنتیک جدایه‌های شاخه­های Bacteroidetes، Alphaproteobacteria و Actinobacteria برای نمایش روابط فیلوژنتیک سویه­های جداسازی شده در هر شاخه با یکدیگر و با سایر شاخه­ها با استفاده از روش Neighbor- joining و ضریب Boot Strap صد

 

 

شکل 6- درخت فیلوژنتیک جدایه‌های شاخه­ Gamaproteobacteria برای نمایش روابط فیلوژنتیک سویه­های جداسازی شده در هر شاخه با یکدیگر و با سایر شاخه­ها با استفاده از روش Neighbor- joining و ضریب Boot Strap صد

 

شکل 7- درخت فیلوژنتیک جدایه‌های شاخه­ Firmicutesبرای نمایش روابط فیلوژنتیک سویه­های جداسازی شده در هر شاخه با یکدیگر و با سایر شاخه­ها با استفاده از روش Neighbor- joining و ضریب Boot Strap صد

 

در روش مستقل از کشت، نتایج حاصل از مقایسه میزان شباهت کلون­های منتخب در توالی ژن
S rRNA16 در جدول 5 آورده شده است. بیشترین میزان شباهت مشاهده شده به میزان 9/98 و کمترین میزان شباهت مشاهده شده به میزان 3/82 است. درخت فیلوژنتیک رسم شده برای توالی‏های حاصل از روش مستقل از کشت در شکل 8 آورده شده است.

 

 

جدول 5- مقایسه‌ی کلون‌های منتخب با توالی‌های ثبت شده استاندارد


ردیف

نام کلون

سویه استاندارد با بیشترین میزان شباهت

درصد شباهت

1

C10

Salinibacter ruber DSM 13855(T)

3/99

2

G8

Adhaeribacter aquaticus MBRG1.5(T)

8/82

3

G15

Salinibacter ruber DSM 13855(T)

2/98

4

G17

Adhaeribacter aquaticus MBRG1.5(T)

8/82

5

C3

Salinibacter ruber DSM 13855(T)

9/98

6

C22

Salinibacter ruber DSM 13855(T)

9/98

7

C24

Salinibacter ruber DSM 13855(T)

3/98

8

G3

Salinibacter ruber DSM 13855(T)

2/97

9

G5

Adhaeribacter aquaticus MBRG1.5(T)

4/82

10

G20

Salinibacter ruber DSM 13855(T)

94

11

N6

Salinibacter ruber DSM 13855(T)

6/97

12

N11

Cesiribacter roseus 311(T)

3/82

 

 

شکل 8- درخت فیلوژنتیک جدایه­های حاصل از روش کلونینگ و تعیین توالی به روشNeighbor- joiningو بااستفاده از معیارBoot strapصد


بحث

محیط‌های پر شور به دو بخش آب‌های پر شور و خاک‌های پرشور تقسیم می‌شوند. محیط‌های پر شور به علت سختی شرایط زندگی از تنوع زیستی کمتری نسبت به محیط‌های معتدل برخوردارند؛ اما از نظر حضور میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست و تحمل‌کننده نمک، تنوع بالایی دارند و انواعی از نمک‌دوست‌های نسبی و تحمل‌کننده‌های نمک در این محیط‌ها وجود دارند.

در روش­های مبتنی بر کشت در زمینه جدا‌سازی، از محیط‌های کشت متنوع و رقت‌های متوالی و گرماگذاری طولانی، برای جداسازی بیشترین تنوع گونه‌ها استفاده شد. محیط کشت‌های رقیق شده SWNLN و MHLN نیز برای افزایش جداسازی استفاده شد. کارآیی استفاده از محیط کشت‌های رقیق شده در پژوهش‌های قبلی تایید شده است (25 و 26). در زمینه استفاده از این محیط‌ها یکی از دشواری­ها، خالص­سازی میکروارگانیسم‌های جدا شده از طریق این محیط است که این مورد در بیشتر موارد به علت عدم توانایی رشد در محیط‌های خالص‌سازی است. محیط‌های MH و SWN بازده مناسبی در جداسازی داشتند. تفاوت در میزان جدایه‌های حاصل از هر محیط کشت نشان‌دهنده بازده هر کدام از محیط‌ها در جداسازی و همچنین ایجاد امکان کشت مجدد و خالص‌سازی است. بیشترین میزان جدایه‌ها از نمونه‌های محیط بازی به‌دست آمد که شاید به‌علت وجود نمونه‌های خاک در بین نمونه‌های مربوط به این منطقه است. از جدایه‏های حاصل از محیط‏های جداسازی دارای اسیدیته قلیایی، جدایه‏های BH8 و DC2 برای تکثیر ژن S rRNA16 و توالی‌یابی انتخاب شدند و بیشترین میزان شباهت را به گونه استاندارد (Alkalibacterium putridalgicola T129-2-1T) نشان دادند. این جدایه‌ها پلی­اکستریموفیل (نمک­دوست و قلیا­دوست) بوده و به علت این ویژگی دارای قابلیت بررسی در زمینه توانمندی‌های آنزیمی هستند. بیشترین میزان سویه­ها دارای شکل میکروسکوپی میله­ای و گرم مثبت هستند که با توجه به شرایط شوری و سخت اکوسیستم و توانایی برخی از اشکال میله­ای در ایجاد هاگ و قرارگیری در حالت خفتگی مورد انتظار است. نتیجه مشابه در بررسی‌های قبلی بر روی دریاچه آران و بیدگل نیز به‌دست آمده است (27 و 28). جدایه‌های گرم منفی و جدایه‌های دارای شکل میکروسکوپی کوکوس از فراوانی کمتری در بین جدایه‌ها برخوردار بودند. در بررسی مشابه که توسط گارابیتو[i] و همکاران در سال 1998 انجام شد. ایشان این گروه 99 شکل میله­ای به شدت تحمل کننده نمک گرم مثبت و مولد هاگ را از خاک و رسوبات زیستگاه­های پر شور واقع در نقاط مختلف اسپانیا جدا کردند که قادر به رشد در غلظت‌های نمک 20 تا 25 درصد بودند و بر اساس ویژگی­های ریخت­شناسی و محتوی G+C، در گونه­های مختلف جنس Bacillus قرار گرفتند (29).

بر خلاف نتایج حاصل از پژوهش حاضر، که اشکال میله­ای گرم مثبت در بین جدایه‌ها دارای بیشترین میزان فراوانی هستند و 9/59 درصد جدایه‌ها را به خود اختصاص می‌دهند، در مطالعه­ی مشابه انجام شده توسط مارکوز[ii] و همکاران که در سال 1987 انجام شد، تعداد 154 باکتری غیر نمک‌دوست از یک حوضچه نمک واقع در Huelvea کشور اسپانیا جداسازی و مطالعه شد که بیشتر آن‏ها کوکوس­های گرم مثبت به جنس‌های MicrococcusوStaphylococcusمتعلق بوده و اشکال میله­ای گرم مثبت از جنس Bacillus نیز با سهم کمتری در این زیست‌گاه حضور داشتند (30). این اختلاف تعجب برانگیز نبوده و در مطالعات انجام شده مشخص شده که تنوع میکربی خاک­های پرشور بیشتر به خاک‌های غیر شور شباهت دارد تا آب­های شور و باکتری­های خاک­های پرشور به طور معمول وابستگان تحمل‌کنندة نمک باکتری­های معمول موجود در خاک هستند (9). با توجه به جدا سازی بخش اعظم سویه‏ها از خاک و رسوبات این تفاوت قابل تفسیر است.

بیشترین میزان جداسازی سویه‏ها بر روی محیط SWN با میزان نمک سه درصد به‌دست آمد که به‌علت تعداد زیاد نمونه‌های خاک با شوری متوسط قابل انتظار است. همچنین، ناهمگونی مکانی[iii] که از ویژگی­های ذاتی خاک است موجب به‌وجود آمدن ریز زیستگاه‏های مختلفی می‏شود که دارای شرایط فیزیکی شیمیایی و زیستی متفاوت هستند (31). از آن‏جایی که در خاک ماده غذایی بیشتری در دسترس باکتری­­ها است، وجود چنین ریز زیستگاه­هایی در خاک نسبت به شورابه و بلور­های نمک، که شوری بسیار بالا (40 درصد) و یکنواخت دارند، برای رشد و تکثیرگونه­های تحمل‌کننده نمک مکان مناسب‌تری است. در مورد نمونه‌های با درصد نمک بالا و کریستال‌های نمک از قبیل نمونه‌های بلور نمک مربوط به منطقه اسکله و چیچست، تعداد جدایه‌ها بسیار پائین بود که شاید به علت شوری بالا، برای زندگی انواع نمک‌دوست اجباری مناسب‌تر به‌نظر می‌رسند. در بررسی­های فیلوژنتیک بر اساس توالی‌یابی ژن S rRNA16 در مورد سویه‌های منتخب، این سویه‌ها به پنج رده
 Firmicutes، Actinobacteria، Proteobacteria-γ، α-Proteobacteriaو Bacteroidet و22 جنس مختلف تعلق داشتند. در بین سویه‌های تعیین توالی شده تعداد 34 سویه به رده Firmicutes و 10سویه به رده Proteobacteria-γ تعلق داشتند. همچنین، تعداد چهار سویه به شاخه α-Proteobacteria، سهسویه به شاخهActinobacteriaو یک سویه به شاخهBacteroidetes تعلق داشتند. در مطالعه‏ی مشابه دیگری با هدف جداسازی و شناسایی باکتری‌های نمک­دوست نسبی بومی دریاچه نمک آران و بیدگل و توانایی این میکروارگانیسم­ها در تولید آنزیم‌های هیدرولازی خارج سلولی، 83 سویه نمک‌دوست نسبی جدا شد که با جنس‌های نمک‌دوست نسبی Bacillus، Thalassobacillus، Salinococcus، Halobacillus، Halomonas، Staphylococcus، Marinococcus، Idiomarina و Salicola نزدیکی داشته و بیشترین فراوانی مربوط به جنس­های Salicola و Halobacillus گزارش شد (32).

در مطالعه تنوع زیستی باکتریهای تحمل کننده نمک دریاچه آران و بیدگل، جدایه‌های حاصل به چهار رده Firmicutes، Actinobacteria، -Proteobacteriaγ و α-Proteobacteriaو 20 جنس مختلف متعلق بودند. 41 سویه متعلق به رده Firmicutes، چهار سویه در رده Actinobacteria، در رده-Proteobacteriaγسهسویه و در رده α-Proteobacteriaدو سویه گزارش شد.جنس­های Aneurinibacillus، Bacillus،Brevibacillus،                        Marinilactibacillus،Oceanobacillus، Ornithinibacillus، Paenibacillus، Virgibacillus، Staphylococcus، Aerococcus، Jeotgalicoccus، Salinicoccus، Arthrobacter، Kocuria، Microbacterium، Pseudomonas، Halomonas، Acinetobacter، Paracoccus، Bervundimonas در این مطالعه گزارش شدند (27).

از بین جدایه‌های نمک‌دوست نسبی حاصل از بررسی تنوع زیستی در دریاچه آران و بیدگل جنس­های Aquisalibacillus، Bacillus، Gracilibacillus، Halobacillus، Oceanobacillus، Ornithinibacillus، Paraliobacillus، Piscibacillus، Salinicoccus، Salirhabdus، Thalassobacillus، Virgibacillus، Salicola، Marinobacter، Chromohalobacter، Halomonas و Idiomarina گزارش شدند (28).

در مطالعه­ای که در سال 2011 بر روی جداسازی میکروارگانیسم­ها از دریاچه ارومیه انجام شده است نیز میکروارگانیسم­هایی در دو شاخه γ- Proteobactreiaو Firmicutes گزارش شدند که بیشترین میزان شباهت را به جنس­های Halomonas، Salicola، Pseudomonas، Idiomarina، Marinobacter، BacillusوHalobacillusنشان دادند (33). در پژوهش حاضر، تنوع بسیار بالاتری در سطح شاخه و جنس مشاهده شد که می­توان آنرا به تنوع محیط­های جداسازی و حجم بالاتر کار نسبت داد.

 در این پژوهش، سویه­های گرم مثبت در جنس­های Halobacillus، Planococcus، Gracilibacillus، Bacillus، Staphylococcus، Ornithinibacillus، Alkalibacterium، Kocuria، Pontibacter، Sanguibacter، Micrococcus، Oceanobacillus، Microbacterium، Thalassobacillus و Piscibacillus و سویه­های گرم منفی نیز در جنس‌های Halomonas، Paracoccus، Marinobacter، Providencia، Lysobacter، Pontibacter، Salicola و Brevundimonas قرار گرفتند.

در مطالعات محدودی که روی تنوع زیستی خاک‏های پرشور انجام شده، مشخص شد که جنس‌های بیشتر در این محیط­ها را به طور معمول جنس‌های Bacillus، Pseudomonas، Micrococcus، Alcaligenes، Flavobacterium و Acinetobacter تشکیل می­دهند (9).

علاوه بر این گروه‌ها، جنس‌هایSalinivibrio، Pseudoalteromonas، Vibrio، Marinicoccus، Geotgalibacillus، Nestrenconia، Actinopolyspora، Aquisalibacillus، Ornithinibacillus، Paraliobacillus، Salirhabdus، Salinicoccus، Virgibacillus، ChromohalobacterوIdiomarinaکه در بررسی تنوع زیستی دریاچه ارومیه مشاهده نشدند؛ در مطالعه بر روی محیط‌های پر شور دیگر گزارش شده‌اند (34، 35، 36، 37 و 38).

تعداد و تنوع نمونه‌های به‌کار گرفته شده، فصل‌های مختلف نمونه‌برداری، توزیع طبیعی میکروارگانیسم‌ها در محیط زیست و مشخصات بوم‌شناختی هر منطقه همگی از جمله‌ی مواردی هستند که در نوع باکتری‌های جداسازی شده اثر خواهند داشت (39). احتمال افزایش تنوع موجود با افزایش هربار نمونه‌برداری نیز در تفاوت نوع و تعداد میکروارگانیسم‌های جداشده در هر پژوهش تأثیرگذار خواهد بود (40).

 بخش اصلی توالی‌ها در کتابخانه ژنی باکتری‌ها، توالی‌های به گروه Bacteroidetes متعلق بود. در این گروه، توالی‌های مرتبط با گونه Salinibacter ruber بیشترین فراوانی را داشت به‌طوری‏که 66 درصد از توالی‌های به‌دست آمده در روش مستقل از کشت، اعضای این جنس بودند. این مشاهده در دیگر دریاچه‌های نمک نیز گزارش شده است (41 و42). مطالعه بر روی تنوع زیستی باکتری‌های دریاچه آران و بیدگل با استفاده از روش کلونینگ و توالی‌یابی نیز نتایج مشابهی را ارائه داد که حدود 40 درصد از جدایه‌های تعیین توالی شده به گونه Salinibacter ruberمتعلق بودند (43). در میان اعضای کتابخانه‌های ژنومی تهیه شده از دریاچه ارومیه در 42 درصد از جدایه‌های تعیین توالی شده شباهت کمتر از 97 درصد با گونه‌های استاندارد ثبت شده مشاهده شد. سه جنس متفاوت Salinibacter، Adhaeribacter و Cesiribacter در بین جدایه‌های تعیین توالی شده مشاهده شدند که هر سه به رده Bacteroidetes متعلق هستند.

روش‌های کشت و کلونینگ- توالی‌یابی، برای بررسی تنوع زیستی باکتری‌های دریاچه ارومیه به‌کار برده شدند. نتایج به‌دست آمده از هرکدام از روش‌ها با توجه به ویژگی‌های ذاتی روش و شیوه‌های اجرایی دارای محدودیت و جهت‌گیری‌های[iv] خاص است. در روش کشت علاوه بر محدودیت اصلی (دسترسی به تنها حدود یک درصد از میکروارگانیسم‌های موجود)، محیط‌ها و روش‌های کشت استفاده شده، تنها امکان رشد گروه خاصی از میکروارگانیسم‌ها را فراهم می­کند و نتایج به‌دست آمده از این روش بیانگر واقعیت کامل جامعه نیست. در روش مولکولی سد کشت برداشته شده و دسترسی به میکروارگانیسم‌های محیط بدون نیاز به رشد آن‌ها در شرایط مصنوعی آزمایشگاه میسر است. با این وجود، دسترسی به ماده ژنتیکی و توانایی تکثیر ژن مورد نظر در این روش محدودیت‌هایی ایجاد می‌کند. تمامی میکروارگانیسم‌های منطقه در برابر روش استخراج DNA بکاربرده شده پاسخ یکسانی ندارند. در این پژوهش، هیچ‌گونه همپوشانی در بین نتایج حاصل از روش‌های وابسته به کشت و غیر وابسته به کشت مشاهده نشد که این امر را می‌توان به تعداد بسیار کم جدایه‌های تعیین توالی شده با استفاده از روش کلونینگ و تعیین توالی نسبت داد. در بررسی جوامع میکروبی افزایش تعداد نمونه به‌اندازه افزایش تعداد نمونه در جوامع گیاهی و جانوری مؤثر و قابل تعمیم به واقعیت نیست. اما با افزایش تعداد نمونه‌ها نتایج قابل‌قبول‌تری به‌دست می‌آید. بر اساس نتایج به‌دست آمده، به‌کارگیری روش‌های پلی فازیک شامل استفاده همزمان از روش‌های سنتی وابسته به کشت و روش‌های مولکولی بهترین نتیجه در معرفی تنوع زیستی منطقه را ارائه می‌دهد. علاوه بر آن، استفاده از ابزارهای مختلف دید درست‌تری در مورد تنوع زیستی میکروارگانیسم‌های منطقه به‌دست می‌دهد.

تشکر و قدردانی

پژوهش حاضر با حمایت مالی مرکز ملی ذخایر ژنتیک و زیستی ایران انجام گرفته است.



[i]. Garabito

[ii]. Marquez

[iii]. Spatial heterogeneity

[iv]. Bias

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



[1]. Biodegradation

[2]. Bio prospecting

[3]. Flame photometry

[iv]  Baron

[v]. Deoxy nucleotide chain termination

[vi]. Benlloch

 

References

(1)  Heywood V.H., Baste I., Gardner K.A. GlobalBiodiversity Assessment. Cambridge: Cambridge University Press; 1995

(2)  Olembo, R, Hawksworth D. Importance of microorganisms and invertebrates as components of biodiversity. CAB International. 1991

(3)  Colwell R, Hawksworth D. Microbial Diversity 21: Action Statement. International Union of Biological Sciences and International Union of Microbiological Societies. UK; 1991

(4)  Barnes, R. Invertebrate Zoology. Philadeplphia: W. B. Saunders Company; 1984

(5)  Head, I., J. Saunders, R.W. Pickup. Microbial evolution, diversity, and ecology: a decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated microorganisms. Microbial Ecology 1998; 35(1): 1-21.

(6)  Wayne,L.G., Brenner,D.J., Colwell,R.R., Grimont,P.A., Kandler,O., Krichevsky,M.I., et al. International Committee on Systematic Bacteriology. Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics. Int J Syst Bacteriol 1987; 37: 463–464.

(7)  Stackebrandt, E., Frederiksen, W. Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the species definition in bacteriology. Int J Syst Evol Microbiol 2002; 52(3): 1043.

(8)  Stackebrandt, E., J. Ebers. Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards. Microbiology today 2006; 33(4): 152.

(9)  Caton, T.M., Witte, L.R., Ngyuen, H.D., Buchheim, J.A., Buchheim, M.A. Schneegurt, M.A. Halotolerant aerobic heterotrophic bacteria from the Great Salt Plains of Oklahoma. Microbial Ecology 2004; 48(4): 449-462.

(10)             Baron, F., Finegold, S.. Diagnostic Microbiology, 8Th ed. St. Loui; The CV Mosby Co., 1990.

(11)             Murray R. G. E., Doetsch R. N., Robinow C. F. Determinative and cytological light microscopy. In: Gerhardt P, Murray R G E, Wood W A, Krieg N R, editors; Gerhardt P, Murray R G E, Wood W A, Krieg N R, editor            s. Methods for general and molecular bacteriology. Washington, D.C: American Society for Microbiology; 1994. 22–41.

(12)             Gibbons, N. Isolation, growth and requirements of halophilic bacteria. Methods in microbiology 1969; 3: 169-183.

(13)             Kushner, D. Life in high salt and solute concentrations: halophilic bacteria, In: D. Kushner, editor. Microbial life in extreme environments. UK; Academic Press: 1978. P 317-68.

(14)             Larsen, H. Halophilism. The bacteria 1962; 4: 297-342.

(15)             Wilson, K. Preparation of genomic DNA from bacteria, In Current Protocols in Molecular Biology, B.R. Ausubel FM, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, editor., New York; John Wiley & Sons: 1987

(16)             Spencer, J. Environmental microbiology: methods and protocols. US; Humana Press Inc., 2004.

(17)             Chun, J., Lee, J.-H., Jung, Y., Kim, M., Kim, S., Kim, B. K., Lim, Y. W. EzTaxon: a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences. Int J Syst Evol Microbiol 2007; 57: 2259-2261.

(18)             Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 2007; 23: 2947-2948.

(19)             Hall, T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp. Ser. 1999; 41: 95–98.

(20)             Kumar S, Stecher G, Peterson D, and Tamura K. MEGA-CC: Computing Core of Molecular Evolutionary Genetics Analysis Program for Automated and Iterative Data Analysis. Bioinformatics 2012; 28:2685-2686.

(21)             Saitou, N., Nei, M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology Evolution 1987; 4: 406-425.

(22)             Felsenstein, J. Phylogenies and the comparative method. American Naturalist; 1985. p1-15

(23)             Benlloch, S., Martinez-Murcia, A. J., odríguez-Valera, F. Sequencing of bacterial and archaeal 16S rRNA genes directly amplified from a hypersaline environment. J. Syst Appl Microbiol. 1995; 18: 574-581.

(24)             Huber, T., Faulkner, G., Hugenholtz, P.. Bellerophon; a program to detect chimeric sequences in multiple sequence alignments. Bioinformatics. 2004; 20: 2317-2319.

(25)             Schut, F., Vries, E. J., Gottschal, J. C.,  Robertson, B. R., Harder, W.,  Prins, R. A., et al.  Isolation of typical marine bacteria by dilution culture: growth, maintenance, and characteristics of isolates under laboratory conditions. Appl Environ Microbiol 1993; 59(7): 2150-2160.

(26)             Button, D., F. Schut, Quang, P., Martin, R., Robertson, B.R. Viability and isolation of marine bacteria by dilution culture: theory, procedures, and initial results. Appl Environ Microbiol 1993; 59(3): 881.

(27)             Didari. M. Diversity of aerobic heterotrophic halotolerant bacteria from Aran-Bidgol Lake [Dissertation]. Tehran: University of Tehran.; 2009.

(28)             Bagheri. M. Diversity of aerobic heterotrophic moderately halophilic bacteria from Aran-Bidgol Lake [Dissertation]. Tehran: University of Tehran.; 2009.

(29)             Garabito MJ, Marquez MC, Ventosa A. Halotolerant Bacillus diversity in hypersaline environments. Can J Microbiol 1998; 44:95-102.

(30)             Márquez, M.C., Ventosa, A., Ruiz-Berraquero, F. A. Taxonomic study of heterotrophic halophilic and non halophilicbacteria from a solar saltern. Gen. Microbiol. 1987; 133: 45-46.

(31)             Kirk, L., Beaudette, L.A., Hart, M., Moutoglis, P., Klironomos, J.N., Lee, H., et al. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of microbiological methods 2004; 58(2): 169-188.

(32)             Babavalian, H., Amoozegar, M., Pourbabaei, A.A. Isolation, Identification and Characterization of moderately halophilic bacteria producing Hydrolytic enzymes from Aran-Bidgol salt Lake. Iranian Journ of Biology 2009; 22(1): 24-45.

(33)             Zununi Vahed, S., Forouhandeh, H., Hassanzadeh, S., Klenk, H., Hejazi, M. A., Hejazi, M. S. Isolation and characterization of halophilic bacteria from Urmia Lake in Iran. Microbiology 2011; 80 (6): 834–841.

(34)             Dong, H., G. Zhang, Jiang, H., Yu, B., Chapman, L.R., Lucas, C.R., Fields, M.W. Microbial diversity in sediments of saline Qinghai Lake, China: linking geochemical controls to microbial ecology. Microbial Ecology 2006; 51(1): 65-82.

(35)             Ghozlan, H., H. Deif, et al. Biodiversity of moderately halophilic bacteria in hypersaline habitats in Egypt. The Journal of General and Applied Microbiology 2006; 52(2): 63-72.

(36)             Jiang, H., H. Dong, Zhang, G., Yu, B., Chapman, L.R., Fields, M.W. Microbial diversity in water and sediment of Lake Chaka, an athalassohaline lake in northwestern China. Appl Environ Microbiol 2006; 72(6): 3832.

(37)             Ventosa, A., Márquez, M.,  Garabito, MJ., Arahal, DR. Moderately halophilic gram-positive bacterial diversity in hypersaline environments. Extremophiles 1998; 2(3): 297-304.

(38)             Yeon, S., W. Jeong, Park, JS. The diversity of culturable organotrophic bacteria from local solar salterns. Microbiology 2005; 43: 1-10.

(39)             Alain, K. and J. Querellou. Cultivating the uncultured: limits, advances and future challenges. Extremophiles 2009; 13(4): 583-594.

(40)             Hughes, J. B., Hellmann, J. J., Ricketts, T. H., Bohannan, B. J. M.. Counting the uncountable: statistical approaches to estimating microbial diversity. Appl Environ Microbiol 2001; 67(10): 4399-4406.

(41)             Maturrano, L., Santos, F., Rossello-Mora, R., Anton, J. Microbial diversity in Maras salterns, a hypersaline environment in the Peruvian Andes. Appl Environ Microbiol. 2006; 72: 3887-3895.

(42)             Mutlu, M. B., Martínez-Garcıa M., Santos F., Pen A., Guven K, Anton J. Prokaryotic diversity in Tuz Lake, a hypersaline environment in Inland Turkey. FEMS Microbiol Ecol. 2008; 63: 1-10.

(43)             Makhdoumi-Kakhki A, Amoozegar MA, Kazemi B, Pašić L, Ventosa A. Prokaryotic diversity in Aran-Bidgol salt lake, the largest hypersaline playa in Iran. Microbes Environ 2011; 27(1): 87-93.