جداسازی و غربال‏گری اکتینومیست‏های مولد فیتوتوکسین و بررسی طیف اثر فیتوتوکسین سویه‏های منتخب

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران،

2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران

3 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، مرکز ملی ذخائر ژنتیکی و زیستی

4 استاد ژنتیک مولکولی گیاهی، دانشگاه تهران، ایران

5 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: در بین میکروارگانیسم‌های تولیدکننده علف‌کش‌های زیستی، اکتینومیست‌ها از مهم‏ترین میکروارگانیسم‌های مولد هستند. علف‌کش‌های میکروبی برخلاف مواد شیمیایی، مشکلات زیست محیطی ایجاد نمی‌کنند، به همین دلیل امروزه به استفاده از آن‏ها توجه زیادی می‏شود. مواد و روش‏‏ها: 40 نمونه سویه‌های اکتینومیستی از ریزوسفر و فیلوسفر گیاهان جدا شدند. غربال‏گری نخستین روی محیط GAP به‏وسیله دو بذر شاهی و تربچه انجام‏ شد‏. سویه‌هایی که بالای70 درصد‏ اثر مهاری نشان دادند، انتخاب و سوپرناتانت حاصل از رشد آن‌ها در دو محیط مایع GPM وSCD سنجش زیستی شد. سپس استخراج فیتوتوکسین با حلال‌های آلی انجام شد. میزان تولید، قدرت مهارکنندگی عصاره برای 6 سویه برتر و زمان بهینه تولید و طیف اثر فیتوتوکسین سه سویه برتر از این 6 سویه، با استفاده از 10 گیاه علف هرز بررسی شد. نتایج: از بین 457 جدایه، 11 سویه مهار بالای 70 درصد‏ نشان دادند. همه این سویه‌ها به جنس Streptomyces متعلق بودند. 3 سویه PM2-2، TM14-5 وKB2-2 برای بررسی طیف اثر فیتوتوکسین انتخاب شدند. سویه PM2-2 از لحاظ زمان تولید، قدرت مهارکنندگی و طیف اثر نسبت به سایر سویه‌ها برتری داشت. بحث و نتیجه‏گیری: اعضای جنس Streptomyces، تولیدکننده‌های بسیار مناسبی برای تولید فیتوتوکسین‌ها به-شمار می‌روند. تنها فیتوتوکسین‌هایی که به‌طور مستقیم به مرحله تجاری شدن رسیده‌اند توسط اعضای این جنس تولید می‏شوند. مهار رشد بیشتر بذرهای گیاهان مورد آزمون توسط سویه‌های جدا شده در این پژوهش، نشان از توانمندی بسیار بالای فیتوتوکسین آن‌ها دارد. فیتوتوکسین برخی از سویه‌های این پژوهش مانند بیشتر فیتوتوکسین-های تجاری قدرت مهارکنندگی بالا و طیف اثر وسیعی دارند که باعث می‌شود استفاده از آن‌ها از لحاظ اقتصادی مقرون به صرفه باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and screening of phytotoxin producing actinomycetes and determination of phytotoxin effect spectrum of selected strains

نویسندگان [English]

  • Reyhan Khayat maher 1
  • Mohamad ali Amoozegar 2
  • Shima sadat Seyyedmahdi 3
  • Javad Hamedi 2
  • Mohamad reza Naghavi 4
  • Faranak Foroozan far 1
  • Ali mohamad Latifi 5
1 M.Sc. of Microbiology, University of Tehran, Iran
2 Associate Professor of Microbiology, University of Tehran, Iran
3 M.Sc. of Microbiology, Iranian biological resource centre, Tehran, Iran
4 Professor of plant molecular genetics, University of Tehran, Iran
5 Assistant Professor of Microbiology, Baqiyatallah university of medical science, Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: Actinomycetes are well-known phytotoxin producing microorganisms. Nowadays the use of microbial herbicides versus traditional chemicals draws a great deal of attention as they do not cause any environmental problems. Materials and Methods: Actbacterial strains of 40 rhizospheric and phyllospheric samples were isolated. Primary screening was implemented on radish and cress seeds on GAP‌Agar. Then, bioassay of cell‌free broth of strains with more than 70% inhibitory effect on the seed growth was performed using GPM and SCD liquid media. Finally, compounds were extracted by organic solvents. The dry‌weight, production time and effectiveness of the superior isolate products were examined and three superior products were examined for their product effect spectrum by 10 resistant weeds. Results: Among 457 screened isolates, 11 strains showed 70% or more inhibitory effect on GAP ‌medium. In secondary screening, seed growth inhibitions of 11 strains were more than 70% using cell‌free broth. These strains belonged to Streptomyces genus. According to dry weight products, production time and effectiveness PM2-2, TM14-5 and KB2-21 strains were selected for next steps and PM2-2 was the superior strain. Discussion and Conclusion: Streptomyces species are amog the best phytotoxins producers and the only phytotoxins introduced to the market are produced by the members of this genus. The growth inhibition of the most plant seeds examined by the isolated strains in this experiment showed an excellent potential for these phytotoxins. phytotoxins produced by some of the strains in the present study had high inhibitory effect and broad effect spectrum like commercial ones, so they seem to be economical.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Actinomycete
  • Phytotoxin
  • Herbicide

در حدود 30000 نوع علف هرز در سراسر جهان پراکنده اند. سالانه نزدیک به 7/9 درصد‏ از کل تولیدات کشاورزی به‏وسیله 1800 نوع از علف‌های هرز از دست می رود (1). تمامی مردم حق دسترسی به مقادیر کافی غذای با کیفیت را دارند و برای پاسخگویی به این نیاز روز افزون برای غذا، تولیدات سالانه محصولات کشاورزی باید افزایش یابد (2). با وجود پیشرفت‌های فناورانه انجام شده از دهه 1940، مشکلات آفات (علف-های هرز، حشرات و بیماری‏زاهای گیاهی) در اکوسیستم ادامه دارد. مواد شیمیایی مصنوعی نقش چشمگیری در افزایش تولید محصولات کشاورزی از طریق مهار آفات دارند (2).
به علت نگرانی‌های زیست محیطی حاصل از استفاده از علف-کش‌های شیمیایی و افزایش مداوم تعداد علف‏های مقاوم شده به یک یا چندین علف‌کش، نیاز به توسعه‌ی علف‌کش‌های جدید وجود دارد. ویژگی این علف کش‏های جدید، نیمه عمر کمابیش کوتاه، غیر‏سمی برای ارگانیسم‌های غیر هدف و دارای ساختارهای شیمیایی مناسب برای‏ عمل بر روی جایگاه‏های مولکولی است که هدف علف‏کش‌های تجاری کنونی و یا قدیمی نبوده‏اند (3). در حدود 40 سال پیش استفاده از از بیماری‏زاهای گیاهی و ترکیبات آللوشیمیایی حاصل از بیماری‏زاها و سایر میکروارگانیسم‌ها به عنوان عوامل کنترل زیستی علف‏های هرز (علف‌کش‌های زیستی) آغاز شده است. از آن زمان تاکنون، تعداد بسیاری از بیماری‏زاهای گیاهی (باکتری‌ها و قارچ‌ها) و ترکیبات آللوشیمیایی میکروبی جداسازی، شناسایی و از نظر توانایی علف‏کشی ارزیابی شده اند (3). علف‏کش‏های زیستی می-توانند به‌طور ویژه بر روی میزبان‌های خاص و یا غیراختصاصی عمل کنند. مانند برخی از بیماری‏زاهای قارچی که به‌طور اختصاصی بر روی میزبان خاصی اثر می‌گذارند. اما بیشتر این ترکیبات طبیعی طیف اثر وسیعی دارند که استفاده از آن-ها از لحاظ اقتصادی به‏صرفه‏تر است؛ زیرا، در بیشتر زمین‏های کشاورزی چندین نوع علف هرز با هم حضور دارند که باعث از بین رفتن مقادیر بالایی از محصولات کشاورزی می‏شوند (4).
میکروارگانیسم‏های خاک به‏طور ویژه، قادر به تولید ترکیباتی هستند که برای گیاهان عالی‏تر سمی‏اند (5). یک گروه از این میکروارگانیسم‏ها، اکتینومیست‏ها به‏ویژه استرپتومیست‏ها هستند که قادرند تعداد زیادی ترکیبات خارج سلولی فعال تولید کنند که توانایی علف‏کشی بسیاری از این ترکیبات مثل بیالفوس ، آنیزومایسین ، هربیسیدین B ، هربیسیدین A  به اثبات رسیده است (6). فیتوتوکسین‌های بسیاری تاکنون کشف شده‏اند که تعداد بسیار کمی از آن‏ها تجاری شده‏اند؛ بیالفوس و فسفینوتریسین  تنها علف‌کش‌هایی هستند که به طور مستقیم به تولید تجاری رسیده‏اند (4).
امکان کشف آنتی‏بیوتیک‏های جدید (شامل علف‏کش‏ها) هنوز به شکل نامحدودی وجود دارد و با توجه به کاربرد متابولیت‏های ثانویه برای منافع بشر، تاکنون تنها بخش کوچکی از آن شناخته شده است (7).
هدف از این پژوهش، یافتن اکتینومایست‌هایی با توان تولید متابولیت‏های علف‏کش است تا بتوان از آن‏ها در کنترل زیستی علف‏های هرز استفاده کرده و آن‏ها را جایگزین احتمالی علف‏کش‏های شیمیایی نمود.

مواد و روش‏ها
در این پژوهش، مواد مولکولی از شرکت فرمنتاز  و سایر مواد از شرکت مرک  تهیه شدند. بذر تربچه از شرکت ویکیماسید  دانمارک، بذر خیار از شرکت پتوسید  ایالت متحده آمریکا و بذر شاهی تهیه و استفاده شدند.
جمع‌آوری نمونه‌ها
40 نمونه ریزوسفر (نمونه‌های خاک جمع‌آوری شده از اطراف ریشه گیاه، در صورت امکان از عمق 20 سانتی‏متری) و فیلوسفر گیاهان از مناطق مختلف ایران شامل کرج، کاشان، جمکران، لوشان، داماش، لاهیجان و قزوین به شکل غیر‏استریل جمع‏آوری شد.
تیمار نمونه‌ها برای‏ جداسازی اکتینومیست‌ها
 نمونه‏ها پس از انتقال به آزمایشگاه به پلیت شیشه‏ای منتقل و در هوای آزاد به مدت یک هفته قرارداده شده تا خشک شوند. سپس، نمونه‌های خاک با استفاده از هاون چینی ساییده و الک شدند. در ادامه به مدت 10 دقیقه در دمای 120 درجه‏ سانتی‏گراد تیمار شدند. نمونه‏های فیلوسفر پس از خشک و ساییده شدن با استفاده از پرتو UV (280 تا 315 نانومتر) به مدت 10 دقیقه تیمار شدند.
جداسازی و خالص کردن اکتینومسیت‌ها
 برای این منظور، رقت‏های 3-10 و4-10 نمونه‌ها تهیه شد. 100 میکرولیتر از هر رقت به دو محیط آرژینین-گلیسرول- سالت آگار  (AGS) و گلوکز- آسپاراژین- دی پتاسیم فسفات  (GAP) منتقل و با استفاده از میله L شکل در داخل پلیت پخش شد‏ (8 و 9). پلیت‌ها به مدت یک تا دو هفته در دمای 28 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شدند. کلونی‏های اکتینومیست با استفاده از ویژگی‏های ظاهری مشخص و شناسایی شدند. هر کلونی به منظور خالص‏سازی به پلیت حاوی محیط ISP2 منتقل و به روش خطی کشت داده شد. تجدید کشت تا زمان اطمینان از خالص بودن سویه انجام شد (10).
بذرهای شاخص و چگونگی استریل کردن بذرها
 بذرهای گیاه برای سنجش زیستی اکتینومیست‏های مولد فیتوتوکسین استفاده می‏شوند. از میان بذرهای شاخص در این زمینه، دو بذر شاهی و تربچه برای‏ غربال‏گری نخستین و دومین و سه بذر شاهی، تربچه و خیار برای سنجش زیستی ترکیب استخراج شده از محیط مایع با استفاده از حلال آلی، به کار برده شدند. این بذرها در مدت کوتاهی جوانه می‏زنند و شرایط رشد آن‏ها در آزمایشگاه آسان است. به همین دلیل برای انجام مراحل غربال‏گری استفاده می‏شوند. به منظور استریل کردن بذرهای شاهی و تربچه از روش تغییر یافته یانگ لب  (11) استفاده شد‏. به این شکل که بذرها در ویال 5/1 میلی‌لیتری تا حجم 25 درصد‏ ویال ریخته شدند. یک میلی‏لیتر از محلول اتانول 70 درصد ‏به اضافه تریتون X1/0 درصد‏  اضافه شده و به مدت 8 دقیقه ورتکس شدند. سپس، محلول تا جای ممکن خالی شده، یک میلی‏لیتر اتانول 95 درصد‏ اضافه و30 ثانیه ورتکس انجام شد. این مرحله دو مرتبه تکرار شد. در پایان بذرها در داخل پلیت حاوی کاغذ صافی استریل ریخته شده، در زیر هود قرار گرفت تا خشک شوند.
نخستین مرحله غربال‏گری اکتینومیست‌های مولد فیتوتوکسین
برای‏ انجام سنجش زیستی سویه-ها در مرحله غربال‏گری نخستین، سویه‏ها به روش کشت نواری  بر روی محیط گلوکز- آسپاراژین- دی پتاسیم فسفات آگار سنجش زیستی شد‏ند (9 و 12). به این شکل که سویه‏های مورد نظر به شکل یک باند دو سانتی‏متری در میانه پلیت حاوی محیط GAP کشت داده شدند. پس از دو هفته گرماگذاری در دمای 28 درجه سانتی‏گراد، بذرهای شاخص (شاهی و تربچه) استریل در دو طرف باند کشت قرار داده شدند و پس از چهار روز گرماگذاری در دمای 28 درجه‌ سانتی‏گراد میزان رشد بذرها با کنترل (بذرهای رشد کرده در محیط GAP بدون تلقیح) مقایسه شد‏. سپس، برای سویه‌هایی که قادر بودند رشد بذرها را در مقایسه با کنترل 70 درصد‏ یا بالاتر کاهش دهند تکرار گذاشته و در صورت مشاهده مهار، سویه‌های مورد نظر برای‏ غربال‏گری دومین به محیط کشت مایع برده شدند. نحوه محاسبه درصد مهار رشد بذرها به این شکل است:
بذر رشد مهار درصد=100-((بذرها رشد میانگین)/(کنترل در بذرها رشد میانگین)×100)

دومین مرحله غربال‏گری اکتینومیست‌های مولد فیتوتوکسین (بررسی تولید در محیط کشت مایع)
در این مرحله از دو محیط مایع GPM (گلوکز-پپتون- ملاس ) و SCD (آرد سویا- شیرابه ذرت-دکسترین ) در سه تکرار استفاده شد (13). به این شکل که یک کلونی متوسط رشد کرده از محیط ISP2 به لوله آزمایش حاوی دو میلی‏لیتر آب مقطر استریل، منتقل و با استفاده از میله شیشه‌ای و ورتکس قطعه قطعه شد‏. یک میلی-لیتر از سوسپانسیون تهیه شده به فلاسک 100 میلی‌لیتر (حاوی 25 میلی‏لیتر محیط کشت مایع مورد نظر) برای‏ پیش کشت منتقل و به مدت 48 ساعت در دمای 28 درجه سانتی‏گراد و دور rpm 180 همزده شد. در ادامه از ارلن مذکور به فلاسک 250 میلی‌لیتر (حاوی 50 میلی‌لیتر محیط کشت مایع مورد نظر) به نسبت 1:20 تلقیح انجام‏ شد‏ و به مدت 7 روز در دمای 28 درجه‌ سانتی‏گراد و دور rpm 180 همزده شد. سپس جدا کردن سلول‌ها از محیط کشت مایع با سانتریفوژ (20 دقیقه، rpm 4500) و دو بار صاف کردن در شرایط کاملاً استریل انجام شد. پنج میلی‏لیتر از مایع رویی صاف شده با 10 میلی‌لیتر آب آگار 5/1 درصد‏ (نسبت 2:1) مخلوط و در داخل پلیت شیشه‏ای استریل ریخته شد. پس از بسته شدن محیط، بذرهای استریل (شاهی و تربچه) بر روی محیط حاصل قرار داده شده (از هر بذر 6 عدد) و به مدت چهار روز در دمای 28 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شدند. پس از طی زمان ذکر شده میزان رشد بذرها (ریشه‌چه و ساقه‌چه) با کنترل (محیط کشت مایع تلقیح نشده که مراحل قبل روی آن به طور مشابه انجام شده است) مقایسه و درصد مهار بذرها محاسبه شد‏.
استخراج و سنجش زیستی فیتوتوکسین
پس از 7 روز رشد سویه در محیط مایع SCD و یا GPM (28 درجه‌ سانتی‏گراد و rpm 180)، مایع تخمیر  با استفاده از سانتریفوژ در دور rpm 4000 به مدت 20 دقیقه جدا شد. مایع تخمیر با حلال آلی به میزان دو برابر حجم مایع تخمیر (v/v 1:2) به مدت 60 دقیقه مخلوط شد‏. فاز آلی از فاز آبی با کمک دکانتور جدا شد. فاز آلی حاوی ترکیب استخراج شده به دستگاه روتاری اواپریتور  منتقل و در دمای بالای 30 درجه سانتی‏گراد حلال تبخیر شد. باقیمانده در 5/2 میلی‏لیتر حلال آلی حل شده، محلول روی فیلتر کاغذی قرار داده شده و در پلیت ریخته شد. پس از تبخیر حلال، فیلتر با 5/2 میلی‏لیتر آب مقطر مرطوب شد‏. در ادامه، برای‏ سنجش زیستی ترکیب استخراج شده، بذرها (شاهی، تربچه و خیار) بر روی فیلتر گذاشته شده و به مدت چهار روز در دمای 28 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شدند. پس از طی زمان ذکر شده میزان رشد بذرها (ریشه‏چه و ساقه‏چه) با کنترل مقایسه و درصد مهار بذرها محاسبه شد. در این مرحله از سه حلال آلی عمومی دی کلرومتان، اتیل استات و کلروفرم استفاده شد‏. در ابتدا استخراج با استفاده از حلال دی-کلرومتان انجام شد و در صورت مشاهده نشدن مهار که گویای عدم استخراج ترکیب فیتوتوکسین با حلال آلی است، آزمایش با استفاده از دو حلال اتیل‌استات و کلروفرم تکرار شد‏.
شناسایی سویه‌های اکتینومیست مولد فیتوتوکسین
برای‏ بررسی صفات ریخت‌شناسی، از محیط‌های کشت توصیه شده توسط شرلینگ  و گوتلیب ، شامل: ISP2 (عصاره مخمر- عصاره مالت آگار)، ISP3 (اوتمیل  آگار)، ISP4 (نمک‌های معدنی- نشاسته آگار)، ISP5 (گلیسرول- آسپاراژین آگار) استفاده شد (14). رنگ میسلیوم هوایی بالغ حاوی اسپور و رنگ میسلیوم رویشی (رنگ پشت کلونی) براساس 7 رنگ اصلی ذکر شده توسط ترسنر  و باکوس  (15) به همان شکلی که توسط شرلینگ و گوتلیب عنوان شده است و با استفاده از سیستم‌ استاندارد تعیین رنگ (16) ISCC-NBS تعیین شد‏. همچنین، تولید پیگمان‌های محلول (به غیر از پیگمان‌های ملانوئیدی) در چهار محیط مذکور بررسی شد.
به منظور بررسی ریخت‌شناسی میکروسکوپی و بررسی آرایش زنجیره‌های اسپوری از روش کشت لام مایل  استفاده شد (17). برای این منظور، محیط کشت ISP2 حاوی دو گرم بر لیتر کربنات کلسیم تهیه و پس از استریل کردن در پلیت ریخته شد. قبل از بستن کامل محیط، لامل‌های استریل به شکل مورب در محیط فرو برده شدند. پس از بستن کامل محیط، باکتری در نزدیکی سطح مایل لامل (سطح تماس لامل با محیط کشت) کشت داده شده و در دمای 28 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شد. لامل‌ها در روزهای متفاوت با استفاده از پنس استریل از محیط خارج شده و با میکروسکوپ فاز کنتراست با بزرگنمایی 1000 برابر مشاهده شدند.
توانایی تولید پیگمان ملانوئیدی بعد از گذشت دو و چهار روز از گرماگذاری روی محیط‏های ISP6 (پپتون- عصاره مخمر- آهن آگار) و ISP7 (تیروزین آگار) در دمای 28 درجه سانتی‏گراد بررسی شد (18).
برای‏ بررسی محدوده رشد سویه-ها در حضور غلظت‌های مختلف سدیم‌کلرید از محیط بنت آگار  اصلاح شده با اسیدیته7 (گلیسرول دو گرم بر لیتر، عصاره مالت یک گرم بر لیتر، عصاره مخمر یک گرم بر لیتر، پپتون دو گرم بر لیتر، آگار 20 گرم بر لیتر) استفاده شد‏. رشد سویه‌ها در غلظت‌های مختلف سدیم‏کلرید 15‏، 5/12‏، 10‏، 5/7‏، 5، 3‏ و صفر درصد‏ بعد از 7 و 14 روز بررسی شد (18).
به منظور تعیین ترادفS rRNA16 سویه‌های اکتینومیست منتخب، ابتدا سویه‌ها در محیط ISP2 براث کشت داده شده و به مدت 48 ساعت در دمای 28 درجه سانتی‏گراد در همزن  با دور rpm 220 گرماگذاری شدند (15). پنج میلی‌لیتر از محیط‌های کشت مایع به لوله‌های فالکون استریل منتقل و در دمای چهار درجه سانتی‏گراد در rpm4000 به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ شدند. زیتوده‏های  سلولی به دست آمده به میکروتیوب‌های 5/1 میلی‌لیتری استریل منتقل و دو بار با آب دیونیزه شسته شدند. در مرحله بعد، برای‏ استخراج DNA تام سویه‏های اکتینومیستی منتخب از روش رسوب با نمک  برای استخراجDNA ژنومی استفاده شدند (19). در نهایت توالی S rRNA16 اکتینومیست‌ها با استفاده از جفت پرایمرهای 27F-1492R و 10F-1500R تکثیر و تعیین ترادف شدند‏ (20). برنامه دمایی PCR برای هر جفت از پرایمرها به شرح زیر بود:
- 27F- 1492R : واسرشتی  اولیه در دمای 94 درجه‌ سانتی‏گراد به مدت پنج دقیقه انجام شد. چرخه تکثیر شامل 35 سیکل تکرار شونده با دمای واسرشتی 94 درجه‌ سانتی‏گراد به مدت یک دقیقه، دماهای اتصال 5/55، 5/57 و 5/59 درجه‌ سانتی‏گراد به مدت یک دقیقه و دمای ساخت 72 درجه‌ سانتی‏گراد به مدت یک دقیقه و 30 ثانیه بود. پس از اتمام چرخه‏ها و به منظور تکمیل نهایی ساختار DNA‏ های تکثیر شده، نمونه‏ها به مدت پنج دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‏گراد نگهداری شدند.
- 10F- 1500R: واسرشتی اولیه در دمای 95 درجه سانتی‏گراد به مدت 5 دقیقه انجام شد. چرخه تکثیر شامل 30 سیکل تکرار شونده با دمای واسرشتی 94 درجه سانتی‏گراد به مدت یک دقیقه، دمای‌های اتصال 56، 58 و60 درجه سانتی‏گراد به مدت یک دقیقه و دمای ساخت 72 درجه سانتی‏گراد به مدت یک دقیقه بود. پس از اتمام چرخه‏ها و به منظور تکمیل نهایی ساختار DNA های تکثیر شده، نمونه‏ها به مدت پنج دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‏گراد نگهداری شدند.
میزان تولید فیتوتوکسین‌ها و قدرت مهارکنندگی آن‌ها
در این مرحله 6 سویه KB2-21،Li7-8 ، TM14-5،PM2-10 ،PM2-2 ،PM2-B برای تولید فیتوتوکسین در محیط مایع SCD کشت داده شدند. سپس، عصاره هر 6 سویه با روش استخراج با حلال آلی (دی‌کلرومتان) گرفته شد. وزن خشک عصاره‌ها محاسبه شد. در ادامه رقت‌های 1،2/1، 4/1 و 8/1 از عصاره‌ها تهیه شد و بر روی بذرهای خیار، شاهی و تربچه اثر داده شد تا قدرت مهارکنندگی عصاره‌ها مشخص شود.
زمان بهینه تولید
از سویه‌ها طبق روش ذکر شده، پیش‌کشت 48 ساعته تهیه شد و به محیط مایع تولید SCD (250 میلی‏لیتر در ارلن یک لیتری) تلقیح شد. محیط‌ها در دمای 28 درجه سانتی‏گراد و دور rpm 180 قرار گرفتند. در روزهای سوم، پنجم، هفتم و نهم از ارلن‌ها نمونه‏برداری انجام‏ شد‏ (هر بار 50 میلی‏لیتر از هر ارلن) و با روش گفته شده استخراج با حلال انجام‏ شد‏. عصاره به‏دست آمده خشک و وزن آن محاسبه شد. سپس عصاره‏ها بر روی بذرهای خیار، شاهی و تربچه اثر داده، پس از چهار روز گرماگذاری در 28 درجه سانتی‏گراد درصد جوانه‏زنی در مقایسه با کنترل بررسی شد. آزمایش‏ها با سه بار تکرار انجام شد (21).
بررسی طیف اثر
برای بررسی طیف اثر فیتوتوکسین سویه‌هایی که با توجه به نتایج مراحل قبلی انتخاب شده بودند (KB2-21، PM2-7، TM14-5)، عصاره به‏دست آمده از آن‏ها بر روی بذرهای زیر اثر داده شد
شقایق، قاصدک ، چغلونه ، Draba melanopus، عروسک پشت پرده ، تاج خروس قرمز ، جو سرارود ، خاکشیر شیرین ، شب بوی آفریقایی ، بومادران  و Adoropus litoraodis .
این گیاهان همگی از علف‌های هرز مقاوم محسوب می‌شوند و در بین آن‌ها، هم گیاه تک لپه و هم دولپه وجود دارد. همه بذرها با استفاده از روش تغییر یافته یانگ لب، استریل شدند. عصاره فیتوتوکسین سویه-ها در 5/2 میلی‌لیتر حلال دی‏کلرومتان حل شد و در پلیت-های شیشه‌ای بر روی کاغذ صافی ریخته شد. پس از خشک شدن حلال 5/2 میلی‌لیتر آب مقطر به کاغذهای صافی اضافه شد و بذرها بر روی آن‌ها قرار گرفت. در پلیت شاهد همه مراحل یکسان است اما فیتوتوکسین وجود ندارد. بیشتر این بذرها در دماهای بین 15 تا20 درجه سانتی‏گراد قادر به رشد بودند. بنابراین، همه پلیت‌ها در دمای 17 درجه سانتی‏گراد به مدت دو هفته قرار گرفتند. از هر گیاه 6 بذر در هر پلیت قرار گرفت و برای هر گیاه سه پلیت استفاده شد (18 بذر از هر گیاه). پس از دو هفته درصد جوانه‏زنی بذرها در مقایسه با کنترل اندازه‏گیری شد. این آزمایش یک بار دیگر نیز تکرار شد. نتایج بدست آمده به روش آزمایش فاکتوریل (شامل دو فاکتور سویه و گیاه) توسط نرم‌افزار MSTATC تجزیه و تحلیل آماری شدند.

نتایج
نخستین مرحله غربال‏گری اکتینومیست‌های مولد فیتوتوکسین
 از نمونه‌های کار شده 724 جدایه اکتینومیست به دست آمد. با کنار گذاشتن جدایه‌های مشابه در هر نمونه در نهایت 457 سویه انتخاب و بر روی محیط GAP آگار به روش کشت نواری غربال‏گری اولیه شدند (12).
شکل 1، درصد سویه‌های اکتینومیست سنجش شده در طی غربال‏گری نخستین را نشان می‏دهد. رشد بذرها در محدوده‏های بین صفر تا30 درصد‏، 30 تا50 درصد‏، 50 تا70 درصد‏ و 70 تا100 درصد نسبت به کنترل مهار شده اند. همان‌طور که در نمودار مشاهده می‌شود، از سویه-های اکتینومیست سنجش شده تنها 4/2 درصد‏ رشد بذر شاهی و 7/1 درصد‏ رشد بذر تربچه را بیش از 70 درصد‏ مهار کرده اند.
11 سویه برتر اکتینومیست که در غربال‏گری نخستین مهار 70 درصد‏ یا بیشتر را در مقایسه با کنترل نشان دادند عبارت بودند از: AJ-30، TM14-5، PM2-10، PM2-2، PM2-B، KB2-21، Li7-8، Lo14-7، Lo14-1، CH7-4 و Lo14-5 . در جدول 1 میزان مهار مشاهده شده در هر بذر به تفکیک میزان مهار رشد ریشه‌چه و رشد ساقه‌چه در مقایسه با کنترل آمده است. هر 11 سویه رشد بذر شاهی را بیش از 70 درصد‏ در مقایسه با کنترل مهار کردند درحالی‌که 8 سویه رشد بذر تربچه را بیش از 70 درصد‏ مهار کردند.
 

 
شکل 1- نمودار درصد سویه‌های اکتینومیست سنجش شده موجود در هر محدوده مهاری رشد بذرها


 
بر اساس نتایج گرفته شده، می‏توان گفت بذر شاهی نسبت به بذر تربچه حساسیت بالاتری دارد و تعداد زیادی از سویه‏های غربال‏گری شده بذر شاهی را به طور چشمگیری مهار کردند. در مورد هر دو بذر، در بیشتر موارد رشد ریشه‌‏چه نسبت به ساقه‌چه، بیشتر مهار شده است.
جدول 1- درصد مهار رشد بذرها در مقایسه با کنترل در 11 سویه برترغربال‏گری نخسین
سویه    درصد مهار رشد بذرها در مقایسه با کنترل(درصد‏) در محیط GAP
    تربچه    شاهی
    ساقه چه    ریشه-چه    ساقه-چه    ریشه-چه
AJ-30    0/72    4/86    0/97    8/89
Tm14-5    7/72    9/88    7/66    7/91
PM2-10    7/77    3/84    3/94    3/77
PM2-2    8/12    9/41    3/94    3/77
PM2-B    7/61    9/68    0/100    0/100
KB2-21    1/70    4/81    0/100    0/100
Li7-8    3/28    7/70    3/95    8/95
Lo14-5    3/65    9/87    7/89    5/93
CH7-4    5/3    7/78    3/86    8/93
Lo14-1    0/85    7/94    6/90    1/96
Lo14-7    9/22    7/66    4/99    4/99

دومین مرحله غربال‏گری اکتینومیست‌های مولد فیتوتوکسین
تولید فیتوتوکسین 11 سویه منتخب غربال‏گری نخستین، در محیط‌های مایع SCD و GPM برای‏ غربال‏گری دومین ارزیابی شد.
در محیط GPM سویه CH7-4 قادر به تولید فیتوتوکسین در محیط مایع نبود و کمترین درصد مهار را داشت. سویه AJ-30 نیز در مقایسه با دیگر سویه‌ها تولید خوبی نداشت. اما سایر سویه‌ها درصد بالایی از مهار را در مقایسه با کنترل نشان دادند. در محیط SCD کمترین درصد مهار را سویه CH7-4 نشان داد و سایر سویه‌ها درصد بالایی از مهار را در مقایسه با کنترل نشان دادند. سویه‌های AJ-30، PM2-10، KB2-21، PM2-B، PM2-2، Li7-8 و Lo14-7 در محیط SCD تولید بالاتری را نشان دادند. این در حالی است که مهار رشد مشاهده شده در سنجش زیستی سوپرناتانت حاصل از رشد سویه TM14-5 در هر دو محیط GPM و SCD کمابیش یکسان بود. سویه Lo14-1 در محیط GPM تولید بالاتری داشت. سویه Lo14-5 رشد بذر شاهی را در هر دو محیط کمابیش یکسان، اما رشد بذر تربچه را در محیط GPM به طور درخور توجهی بیشتر مهار کرد. در شکل‌های 2 و 3 به ترتیب، اثر سوپرناتانت کشت سویه‌های منتخب در محیط مایع GPM بر رشد ریشه‌چه و ساقه‌چه بذرهای شاهی و تربچه در مقایسه با کنترل (محیط مایع GPM بدون تلقیح) نشان داده شده است.

 
 
شکل2- نمودار اثر سوپرناتانت کشت سویه‌های منتخب در محیط مایع GPM بر رشد ریشه چه بذرهای شاهی و تربچه در مقایسه با کنترل (محیط مایع GPM بدون تلقیح). رشد در کنترل 100 درصد‏ و درصد مهار کنترل صفر در نظر گرفته شده است.

 
شکل 3- نمودار اثر سوپرناتانت کشت سویه‌های منتخب در محیط مایع GPM بر رشد ساقه چه بذرهای شاهی و تربچه در مقایسه با کنترل (محیط مایع GPM بدون تلقیح). رشد در کنترل 100 درصد‏ و درصد مهار کنترل صفر‏ در نظر گرفته شده

 
در شکل‌های 4 و 5، به ترتیب اثر سوپرناتانت کشت سویه‌های منتخب در محیط مایع SCD بر رشد ریشه‌چه و ساقه‌چه بذرهای شاهی و تربچه در مقایسه با کنترل (محیط مایع SCD بدون تلقیح) نشان داده شده است. نتایج، بر اساس میانگین اعداد محاسبه شده در سه تکرار ارائه شده است. به طور کلی، درصد مهار طول ریشه‌چه در هر دو محیط بیشتر از طول ساقه‏چه ارزیابی شد.
 


 
شکل 4- نمودار اثر سوپرناتانت کشت سویه‌های منتخب در محیط مایع SCD بر رشد ریشه چه بذرهای شاهی و تربچه در مقایسه با کنترل (محیط مایع SCD بدون تلقیح). رشد در کنترل 100 درصد‏ و درصد مهار کنترل صفر‏ در نظر گرفته شده است.

 
شکل 5- نمودار اثر سوپرناتانت کشت سویه‌های منتخب در محیط مایع SCD بر رشد ساقه چه بذرهای شاهی و تربچه در مقایسه با کنترل (محیط مایع SCD بدون تلقیح). رشد در کنترل 100 درصد‏ و درصد مهار کنترل صفردر نظر گرفته شده است.

       
 

استخراج و سنجش زیستی فیتوتوکسین
بر اساس نتایج بدست آمده از غربال‏گری دومین، استخراج فیتوتوکسین از سوپرناتانت کشت سویه‌های AJ-30، PM2-10، KB2-21، PM2-B، PM2-2، Li7-8 و Lo14-7 در محیط مایع SCD انجام شد. برای سویه‌های Lo14-5 و TM14-5 استخراج از هر دو محیط SCD و GPM انجام و برای سویه Lo14-1 از محیط GPM استفاده شد‏.
سنجش زیستی ترکیبات استخراج شده از محیط‌های کشت مایع سویه-های PM2-10، KB2-21، TM14-5، PM2-B، PM2-2 و Li7-8 با استفاده از حلال دی‏کلرومتان، رشد بذرهای شاهی، تربچه و خیار را به میزان چشمگیری مهار کردند. برای سایر سویه‌ها (Lo14-7، Lo14-5، Lo14-1 و CH7-4) استخراج با استفاده از حلال‌های اتیل-استات و کلروفرم تکرار شد‏.
ترکیبات استخراج شده با استفاده از حلال‌های مذکور از محیط‌های مایع کشت سویه‌های Lo14-1، Lo14-5 و CH7-4 اثر مهاری درخور توجهی روی هیچ یک از بذرها نشان ندادند.
میانگین نتایج بدست آمده از دو تکرار انجام شده مربوط به 7 سویه‌ای که ترکیب استخراج شده از سوپرناتانت کشت آن‌ها در محیط مایع اثر مهاری قابل توجهی روی بذرهای شاخص نشان دادند، در جدول 2 آورده شده است. تصاویر این 7 سویه در شکل 6 نشان داده شده است. درصد مهار طول ریشه‌چه در تمامی موارد بیش از ساقه‌چه ارزیابی شد.

جدول 2- پاسخ بذرهای شاهی، تربچه و خیار روی کاغذ صافی مرطوب شده (با ترکیب استخراج شده با حلال آلی از سوپرناتانت کشت سویه‌ها در محیط مایع در مقایسه با کنترل)
سویه    درصد مهار رشد بذرها در مقایسه با کنترل (درصد‏)
    شاهی    تربچه    خیار
    ریشه-چه    ساقه-چه    ریشه-چه    ساقه-چه    ریشه-چه    ساقه-چه
KB2-21    3/99    9/98    0/100    0/100    8/97    1/97
PM2-10    5/98    9/79    4/99    4/94    8/97    1/97
PM2-2    0/97    8/95    6/98    7/93    0/98    6/97
PM2-B    5/98    8/95    1/97    9/88    8/97    6/96
Tm14-5    7/93    4/87    8/96    4/79    8/97    6/96
Li7-8    5/98    9/97    0/100    0/100    6/93    5/91
Lo14-7    4/97    3/96    4/45    0/46    0/52    7/51
 

 

شکل 6- تصاویر سویه‌های Streptomyces دارای توان بالای تولید فیتوتوکسین
 
در مورد بذر شاهی، بالاترین درصد مهار در سویه KB2-21 و کمترین درصد مهار در سویه TM14-5 مشاهده شد. بالاترین درصد مهار بذر تربچه در سویه‏های KB2-21 و Li7-8 مشاهده شد و کمترین درصد مهار را سویه TM14-5 نشان داد. بالاترین اثر مهاری روی بذر خیار را سویه PM2-2 نشان داد درحالی‏که کمترین اثر مهاری به سویه Lo14-7 مربوط بود.
ترکیبات استخراج شده از سوپرناتانت کشت سویه‏های KB2-21، PM2-10، Li7-8، PM2-2 و PM2-B اثر مهاری بسیار بالا روی هر سه بذر شاخص نشان دادند. این درحالی است که ترکیب استخراج شده از سوپرناتانت کشت سویه TM14-5 با وجود اثر مهاری محسوس روی بذرهای تربچه و شاهی، اثر مهاری درخور توجهی روی بذر خیار نشان داد. ترکیب استخراج شده با استفاده از حلال کلروفرم از محیط مایع کشت سویه Lo14-7 رشد بذر شاهی را بیش از 96 درصد‏ مهار کرد در حالی‏که اثر مهاری کمی روی بذرهای تربچه و خیار نشان داد.
شناسایی سویه‌های اکتینومیست مولد فیتوتوکسین
 ویژگی‌های فنوتیپی مانند میزان رشد، تشکیل اسپور، رنگ میسلیوم هوایی و رویشی و تولید پیگمان محلول توسط سویه-های منتخب مولد فیتوتوکسین روی محیط‏های ISP2-ISP5 در جدول 3 آورده شده است.
تولید پیگمان ملانوئیدی روی محیط‌های ISP6 و ISP7 توسط سویه-های KB2-21، TM14-5 و Li7-8 مثبت ارزیابی شد. سویه LO14-7 تنها روی محیط ISP6 پیگمان تولید کرد.
 

جدول 3- رشد، ریخت‏شناسی و تولید پیگمان محلول سویه‌های منتخب بر روی محیط‏های ISP2-ISP5 (بر اساس طیف رنگی ISCC-NBS). در محیط‏هایی که سویه‏های مورد نظر اسپور تولید نکردند (رشد sparse)، برای میسلیوم هوایی رنگی گزارش نشده است.
تولید پیگمان محلول    رنگ میسلیوم رویشی    رنگ میسلیوم هوایی    رشد
نام سویه    Li7-8
ISP2    +    قهوه‌ای مایل به قرمز تیره    -    ضعیف
ISP3    +    قهوه‌ای تیره    قهوه‌ای مایل به خاکستری تیره    خوب
ISP4    +    قهوه‌ای مایل به زرد تیره    قهوه‌ای مایل به خاکستری    خوب
ISP5    +    نارنجی پررنگ    -    ضعیف
نام سویه    KB2-21
ISP2    +    نارنجی پررنگ    -    ضعیف
ISP3    +    قهوه‌ای پررنگ    قهوه‌ای مایل به خاکستری تیره    خوب
ISP4    -    قهوه‌ای زیتونی تیره    قهوه‌ای مایل به زرد پر رنگ    خوب
ISP5    +    نارنجی پررنگ    -    ضعیف
نام سویه    PM2-10
ISP2    +    نارنجی پررنگ    نارنجی شفاف    خوب
ISP3    +    قهوه‌ای مایل به زرد پر رنگ    زرد مایل به سبز شفاف    خوب
ISP4    +    زیتونی ملایم    زرد مایل به سبز پر رنگ    خوب
ISP5    +    زرد نارنجی روشن    سفید    خوب

 ادامه جدول 3
تولید پیگمان محلول    رنگ میسلیوم رویشی    رنگ میسلیوم هوایی    رشد
نام سویه    Tm14-5
ISP2    -    زرد پر رنگ    سفید    ضعیف
ISP3    +    زرد پر رنگ    سفید    خوب
ISP4    -    زیتونی ملایم    آبی مایل به خاکستری تیره    خوب
ISP5    +    زرد نارنجی پر رنگ    -    ضعیف
نام سویه    PM2-2
ISP2    +    زرد نارنجی پر رنگ    سفید    خوب
ISP3    +    قهوه‌ای زیتونی ملایم    زرد مایل به سبز پر رنگ    خوب
ISP4    +    زیتونی تیره    زرد مایل به سبز پر رنگ    خوب
ISP5    +    زرد پر رنگ    سفید    خوب
نام سویه    PM2-B
ISP2    +    قهوه‌ای مایل به قرمز پر رنگ    نارنجی شفاف    خوب
ISP3    +    قهوه‌ای تیره    زرد مایل به سبز شفاف    خوب
ISP4    +    زیتونی تیره    زیتونی کمرنگ    خوب
ISP5    +    زرد نارنجی روشن    سفید    خوب
نام سویه    Lo14-7
ISP2    -    قهوه‌ای زیتونی ملایم    خاکستری تیره    خوب
ISP3    -    زرد مایل به خاکستری تیره    خاکستری زیتونی    خوب
ISP4    -    قهوه‌ای مایل به زرد روشن    -    ضعیف
ISP5    -    زرد مایل به سبز روشن    -    ضعیف

 
نتایج بررسی رشد در غلظت‌های متفاوت کلرید سدیم نشان داد که بهینه‌ی رشد همه سویه‌ها در محیط بدون نمک است. سویه PM2-10 تا 15 درصد‏ نمک رشد داشت که یک باکتری تحمل‌کننده نمک  است.
با بررسی نتایج حاصل از تعیین ترادف ژن
S rRNA16 مشخص شد که سویه‌های PM2-10، PM2-B و PM2-2 بیشترین شباهت را به گونه Streptomyces cyaneofuscatus JCM 4364 وسویه‏های KB2-21، Li7-8 و LO14-7 بیشترین شباهت را به گونه Streptomyces galilaeus JCM 4757 دارند. سویه TM14-5 نیز بیشترین شباهت را به گونه NBRC 13032 Streptomyces corchorusii دارد.

میزان تولید فیتوتوکسین‌ها و قدرت مهارکنندگی آن‌ها
در جدول 4 درصد و قدرت مهارکنندگی عصاره حاوی فیتوتوکسین 6 سویه ذکر شده (در رقت‌های مختلف) آورده شده است. تحلیل آماری نتایج توسط نرم‌افزار MINITAB نشان داد که تفاوت اثر مهارکنندگی عصاره سویه‌های KB2-21 و Li7-8 (این دو سویه بیشترین شباهت را به گونه Streptomyces galilaeus دارند) در اکثر موارد معنادار است (در سطح احتمال پنج درصد‏) و اثر عصاره KB2-21 بیشتر است. تفاوت اثر مهارکنندگی عصاره سویه‌های PM2-2، PM2-B و PM2-10 که بیشترین شباهت را به گونه Streptomyces cyaneofuscatus دارند، در اکثر موارد معنادار است و PM2-2 اثر بهتری دارد. اثر عصاره سویه TM14-5 که بیشترین شباهت را به سویه Streptomyces corchorusii دارد، در اکثر موارد با عصاره PM2-2 اختلاف معنادار ندارد. براساس نتایج بدست آمده در این بخش، سه سویه KB2-21، PM2-2 و TM14-5 نتایج ارزشمندتر و بهتری را نسبت به سایر سویه‌ها نشان می‌دادند.
جدول 4 - بررسی درصد و قدرت مهارکنندگی بذر فیتوتوکسین سویه‌ها
نام سویه    رقت    نام بذر    درصد مهار بذر
KB2-21    1    خیار    3/0±4/35
        شاهی    4/0±5/97
        تربچه    4/0±6/95
    2/1    خیار    5/0±7/10
        شاهی    5/0±5/21
        تربچه    5/0±6/96
    4/1    خیار    5/0±3/5
        شاهی    6/0±5/12
        تربچه    6/0±7/30
    8/1    خیار    6/0±3/2
        شاهی    7/0±3/10
        تربچه    7/0±6/12
Li7-8    1    خیار    5/0±7/24
        شاهی    0±100
        تربچه    4/0±2/91
    2/1    خیار    5/0±5/5
        شاهی    5/0±3/82
        تربچه    7/0±2/38
    4/1    خیار    6/0±2/3
        شاهی    8/0±7/60
        تربچه    1±3/20
    8/1    خیار    7/0±8/1
        شاهی    8/0±5/55
        تربچه    6/0±3/10


PM2-2    1    خیار    8/0±98
        شاهی    0±100
        تربچه    0±100
    2/1    خیار    8/0±95
        شاهی    0±100
        تربچه    7/0±3/93
    4/1    خیار    6/0±95
        شاهی    0±100
        تربچه    6/0±4/90
    8/1    خیار    7/0±0/90
        شاهی    0±100
        تربچه    6/0±7/89
PM2-B    1    خیار    6/0±97
        شاهی    0±100
        تربچه    0±100
    2/1    خیار    7/0±9/94
        شاهی    0±100
        تربچه    7/0±8/90
    4/1    خیار    8/0±7/90
        شاهی    0±100
        تربچه    5/0±6/88
    8/1    خیار    7/0±9/86
        شاهی    0±100
        تربچه    7/0±2/76
PM2-10    1    خیار    7/0±93
        شاهی    0±100
        تربچه    0±100
    2/1    خیار    7/0±8/90
        شاهی    0±100
        تربچه    6/0±2/94
    4/1    خیار    7/0±3/86
        شاهی    7/0±9/98
        تربچه    7/0±2/83
    8/1    خیار    6/0±5/81
        شاهی    8/0±2/95
        تربچه    7/0±1/74
TM14-5    1    خیار    9/0±9/97
        شاهی    0±100
        تربچه    0±100
    2/1    خیار    7/0±7/94
        شاهی    0±100
        تربچه    7/0±92
    4/1    خیار    6/0±90
        شاهی    0±100
        تربچه    7/0±9/88
    8/1    خیار    5/0±87
        شاهی    0±100
        تربچه    7/0±1/80

زمان بهینه تولید
وزن خشک عصاره‌های حاصل از سه سویه KB2-21، PM2-2 و TM14-5 محاسبه و اثر آن بر روی بذرهای شاخص بررسی شد‏. سویه 2-2PM در کوتاهترین زمان (3 روز) بیشترین مقدار تولید (008/0 گرم در 50 میلی‌لیتر) را نسبت به سایر سویه‌ها داشت.
بررسی طیف اثر
فیتوتوکسین تولید شده توسط سویه KB2-21 توانست بذرهای Adoropus litoraodis، تاج خروس قرمز، قاصدک و عروسک پشت پرده را در حدود 80 درصد‏، بذر خاکشیر شیرین را حدود 97 درصد‏ وD.molanopus را 34 درصد‏ مهار کند. عصاره این سویه بر روی سایر بذرها اثری نداشت.
فیتوتوکسین تولید شده توسط سویه TM14-5 بذرهای قاصدک، خاکشیر شیرین، تاج‌خروس قرمز، Adoropus litoraodis، جو سرارود، شب بوی آفریقایی ، بومادران  () و چغلونه را 100 درصد‏ مهار کرد. همچنین بذرهای عروسک پشت پرده و D. melanopus را بالای 85 درصد‏ مهار کرد.
فیتوتوکسین تولید شده توسط سویه PM2-2، بذرهای شقایق، قاصدک ، چغلونه31، جو سرارود ، خاکشیر شیرین  ، شب‌بوی آفریقایی ، Adoropus litoraodis، تاج‌خروس قرمز ، بومادران  و خیار را 100 درصد‏ مهار کرد؛ و قادر بود بذرهای
D. melanopus، عروسک پشت پرده ، شاهی و تربچه را بیش از 90 درصد‏ مهار کند. در شکل 7، 8 و 9 نتایج تحلیل آماری مربوطه آورده شده است. بر اساس تحلیل آماری نتایج، اختلاف بین اکثر درصدهای مهار رشد ریشه‌چه، ساقه‌چه و جوانه گیاهان مختلف معنادار است. در شکل 10 تصاویر مهار بذرها آورده شده است. فیتوتوکسین سویه‌های PM2-2 و TM14-5 بر روی همه بذرها اثر مهاری خوبی داشتند. می‌توان گفت فیتوتوکسین این سویه‌ها طیف اثر وسیعی دارد.
 
 
شکل 7- تحلیل نتایج آماری بررسی طیف اثر فیتوتوکسین سویه TM14-5
A، B و C (شاخص گروه‌بندی دانکن): گروه A بهترین و بالاترین درصد مهار گیاه مورد نظر (ریشه‌چه، ساقه‌چه و جوانه) را نشان می‌دهد و گروه B و C در رتبه‌های بعدی قرار می‌گیرند. بین درصدهای مهاری که در یک گروه دانکن قرار می‏گیرند، تفاوت معناداری وجود ندارد.

 
شکل 8- تحلیل نتایج آماری بررسی طیف اثر فیتوتوکسین سویه PM2-2
A، B و C : شاخص گروه‌بندی دانکن


 
شکل 9- تحلیل نتایج آماری بررسی طیف اثر فیتوتوکسین سویه KB2-21
A، B، C، D، E، F و G : شاخص گروه‌بندی دانکن‌



 

 

 
شکل10- تصاویر مهار برخی از بذرها توسط سویه PM2-2


 
بحث
متابولیت‌های ثانویه میکروبی را شاید بتوان بهترین منبع ترکیبات زیستی فعال علیه گیاهان دانست. بیالفوس، فسفینوتریسین  و بسیاری فیتوتوکسین تولید شده به وسیله‌ی جنس Streptomyces ثبت شده و در حال حاضر به عنوان علف‌کش‌های طبیعی و موافق اکوسیستم به فروش می‌رسند (1).
در این پژوهش، برای افزایش شانس یافتن اکتینومیست‌های مولد فیتوتوکسین سعی شد نمونه‏برداری از مناطق مختلف انجام شود. نمونه-برداری از مناطق شمالی (لوشان، لاهیجان، داماش و چمخاله)، شمال غربی (لیقوان تبریز)، مرکزی (کرج، قزوین، کاشان و جمکران) و جنوبی (کرمان) ایران انجام شد. سویه‏های مولد شناسایی شده نیز به مناطق مختلف تعلق داشتند. Lo14-7 از لوشان، PM2-2، TM14-5، PM2-B و PM2-10 از قزوین، KB2-21 از کرج و Li7-8 از لیقوان جداسازی شدند.
روش غربال‏گری نخستین در این پژوهش همانند دیگر پژوهش‌های انجام شده روی محیط آگار دار با استفاده از روش کشت نواری انجام شد (12). با توجه به نتایج بدست آمده در این پژوهش، این روش بسیار کارامد و تکرار پذیر است و هر 11 سویه بدست آمده از غربال‏گری نخستین، در غربال‏گری دومین نیز رشد بذرهای شاخص را مهار کردند.
روش غربال‏گری دومین به کار گرفته شده، متفاوت از دیگر پژوهش-هایی که تاکنون برای‏ غربال‏گری اکتینومیست‌های مولد فیتوتوکسین انجام شده است، انجام‏ شد‏. در سایر پژوهش‌ها، بررسی اثر مهاری سوپرناتانت محیط کشت مایع سویه‌ها بر رشد بذرهای شاخص روی کاغذ صافی آغشته شده به سوپرناتانت رقیق شده با آب مقطر (به نسبت 1:1) انجام شده است (12). در حالی‏که در این پژوهش بر اساس آزمون‏های انجام شده، سوپرناتانت به نسبت 2:1 با آب آگار 5/1 درصد‏ رقیق شده و اثر مهاری سوپرناتانت بر رشد بذرها بر روی محیط جامد حاصل بررسی شد. روش استفاده از کاغذ صافی آغشته به سوپرناتانت رقیق شده با آب مقطر به نسبت 1:1 در تکرارهای انجام شده نتایج یکسانی را نشان نداد. با توجه به این‏که غنی بودن محیط کشت مایع خود عامل مهاری رشد بذرهاست، رقت‏های بالاتر 2:1 و 3:1 با آب مقطر نیز بررسی شدند که نتایج بدست آمده تکرار پذیر نبود.
در مرحله استخراج ترکیب فیتوتوکسیک، سنجش زیستی ترکیب استخراج شده با استفاده از حلال‏های آلی، مانند سایر پژوهش‌ها انجام‏ شد‏ و رشد بذرهای شاخص روی کاغذ صافی مرطوب شده با ترکیب استخراج شده با حلال از سوپرناتانت کشت سویه‌ها در محیط مایع با کنترل (ترکیب استخراج شده از محیط مایع بدون تلقیح) مقایسه شد. در تکرارهای انجام شده به این روش نیز نتایج حاصل، کاملاً تأیید کننده یکدیگر بودند که نشان دهنده مناسب بودن و قابل اطمینان بودن روش است.
7 سویه برتر مولد غربال‏گری شده در این پژوهش، به جنس Streptomyces متعلق هستند. از آنجائی‏که جنس Streptomycetes، اکتینومیست‌های غالب در محیط هستند و تاکنون نزدیک به 17 درصد‏ از متابولیت‌های فعال زیستی از این جنس به دست آمده‏اند، این امر غیر قابل انتظار نبوده است. در سایر پژوهش‌های انجام شده در زمینه غربال‏گری اکتینومیست‌های مولد فیتوتوکسین نیز اعضای جنس Streptomycetes به عنوان مولدین اصلی در بین اکتینومیست‌ها معرفی شده‏اند (12). همان‏طور ‏که در نتایج پژوهش ذکر شد، سویه‏های PM2-B، Li7-8، PM2-2، KB2-21 و PM2-10 اثر مهاری درخور توجه (نزدیک به 100 درصد‏) روی هر سه بذر شاهی، خیار و تربچه نشان دادند، درحالی‏که سویه Tm14-5 بیشترین اثر مهاری را روی بذر خیار نشان داد و سویه LO14-7 رشد بذر شاهی را در حدود 100 درصد‏ مهار کرده در صورتی‏که اثر مهاری کمی روی بذرهای خیار و تربچه نشان داد. این نتایج نشان می‌دهد فیتوتوکسین‌های حاصل از سویه‏های Tm14-5 و LO14-7 تا حدی انتخابی عمل می کنند و بقیه محدوده میزبانی وسیع‏تری دارند.
در این پژوهش، زمان بهینه تولید نیز مشابه آن‏چه توسط هیسی  و پوتنام  (6) و پالمر  و بندر  (21) انجام شده بود، برای سه سویه ذکر شده، بررسی شد. زمان بهینه تولید برای دو سویه TM14-5 و KB2-21 در روز هفتم بود؛ در حالی‏که برای سویه PM2-2 زمان بهینه، مانند پژوهش هیسی و پوتنام، در روز سوم بود. کوتاه بودن زمان تولید، یک مزیت مهم در تولید محصولات میکروبی محسوب می‌شود.
فیتوتوکسین‌ها می‌توانند به‌شکل اختصاصی و یا غیراختصاصی بر روی میزبان عمل کنند. در این پژوهش، اثر فیتوتوکسین سه سویه KB2-21، PM2-2 و TM14-5بر روی 10 نوع بذر بررسی شد. سویه
KB2-21 نسبت به دو سویه دیگر اثر مهاری کمتری بر روی بذرها دارد و بر روی برخی بذرها اصلاً اثر مهاری ندارد. سویه PM2-2 و TM14-5 (بویژه PM2-2) بر روی همه بذرها اثر مهاری خوبی داشتند. اثر فیتوتوکسین‌های این سویه‌ها بر روی همه این بذرها نشان می‌دهد که این فیتوتوکسین‌ها دارای طیف اثر وسیعی هستند و غیراختصاصی عمل می-کنند. در کشاورزی بیشتر از فیتوتوکسین‌های با طیف اثر وسیع استفاده می‏شود، زیرا به طور معمول در مزارع چندین نوع علف هرز به-طور همزمان با هم حضور دارند. فیتوتوکسین‌های غیراختصاصی میزبان با وجود این‏که عملکرد غیراختصاصی دارند، به‌طور انتخابی عمل می-کنند (1). در نتیجه، با انتخاب فیتوتوکسین مناسب می‌توان از آسیب به محصول اصلی جلوگیری کرد. نکته برتر در این پژوهش نسبت به سایر پژوهش‌ها این است که در این پژوهش، از تعداد زیادی بذر استفاده شده است که علف‌های هرز مقاوم و بومی محسوب می‌شوند؛ در حالی‏که در پژوهش‌های دیگر از تعداد محدودتری از بذرها استفاده شده است که بیشتر بذرهای شاخص و حساس هستند. برای مثال، داناسکاران  و همکاران (22) اثر فیتوتوکسین یک اکتینومیست را بر روی چهار نوع بذر علف هرز بررسی کردند که سویه آن‌ها تنها توانسته بودند یکی از چهار نوع بذر را مهار کنند. داناسکاران و همکاران (23) از 6 نوع علف هرز برای بررسی اثر آللوپاتیک سویه‌های اکتینومیستی استفاده کردند که تنها برخی از آنها توانسته بودند هر 6 نوع علف هرز را مهار کنند.

نتیجه‌گیری
اعضای جنس Streptomyces در تولید فیتوتوکسین‌ها بسیار مورد توجه هستند و تنها فیتوتوکسین‌هایی که به طور مستقیم به تولید تجاری رسیده‌اند (بیالفوس و فسفینوتریسین) توسط اعضای این جنس تولید می-شوند. علف‌کش‌های زیستی از لحاظ ساختاری بسیار متنوع و دارای جایگاه‌های اثر متفاوتی هستند که باعث می‌شود سرعت ایجاد مقاومت نسبت به آن‏ها کمتر شود. این علف‌کش‌ها بسیار با طبیعت سازگار هستند و بیشتر آن‌ها طیف اثر وسیعی دارند. در بیشتر زمین‌های کشاورزی چندین نوع علف هرز همزمان با هم حضور دارند. در نتیجه برای از بین بردن آن‌ها بیشتر از علف‌کش‌های با طیف اثر وسیع استفاده می‌شود که از لحاظ اقتصادی مقرون به‌صرفه‌تر باشد. فیتوتوکسین سویه‌های حاصل از این پژوهش طیف اثر وسیعی داشتند و بر روی بیشتر علف‌های هرز مورد آزمون اثر مهاری مناسبی داشتند. این مسئله باعث می‏شود استفاده از فیتوتوکسین این سویه‌ها از لحاظ تجاری مقرون به صرفه باشد.
تشکر و قدردانی
این پروژه توسط طرح شماره 1/14 دانشگاه بقیه الله، حمایت مالی شد.


















 

References

(1) Li Y, Sun Z, Zhuang X, Xu L, Chen Sh, Li M. Research progress on microbial herbicides. Crop Protection 2003; 22(2): 247-52.

(2) Saxena S, Pandey A K. Microbial metabolites as eco-friendly agrochemicals for the next millennium. Applied Microbiology and Biotechnology 2001; 55(4): 395-403.

(3) Hoagland R E. Microbial allelochemicals and pathogens as bioherbicidal agents. Weed Technology 2001; 15(4): 835-57.

(4) Punzo B. Phytotoxin produced by Alternaria sonchi, a potential mycoherbicide for biocontrol of Sonchus arvensis. France: Federico II Univ.; 2009.

(5) Heisey R, DeFrank J, et al. The chemistry of allelopathy. Washington DC: Am. Chem. Soc; 1985.

(6) Heisey R M, Putnam R. Herbicidal effect of Geldanamycin and Nigericin, antibiotics from Streptomyces hygroscopicus. Natural Products 1986; 49 (5): 859-65.

(7) Demain A L. New application of microbial products. Science 1983; 219 (1): 709-14.

(8) EI-Nakeeb M A, Lechevalier H A. Selective isolation of aerobic actinomycetes. Applied Microbiology 1963; 11 (2): 75-7.

(9) Waksman S. Microorganisms (Book Reviews: The Actinomycetes. A Summary of Current Knowledge). Science 1967; 157 (3792): 1028.

(10) Pridham T G, Anderson P, Foley C, Lindenfelser L A, Hesseltine C W, Benedict R G. A selection of media for maintenance and taxonomic study of Streptomycetes. Antibiotic Annual. 4th ed. New York: Medical Encyclopedia; 1956.

(11) Young Lab 2002. Seed Sterilization. Available from: www.gantlet.org/pdf/sterilize.pdf Accessed: October. 12, 2002.

(12) Mallik M A B. Selective Isolation and Screening of Soil Microorganisms for Metabolites with Herbicide Potential. Crop Production 2001; 4 (2): 219-36.

(13) Warren H B, Prokop J F, Grundy, W E. Nonsynthetic media for antibiotic producing actinomycetes. Antibiotic and Chemotherapy 1995; 5 (2): 6-12.

(14) Shirling E B, Gottlieb D. Methods for characterization of Streptomyces species. Int. J. Syst. Bacteriol. 1966; 16 (3): 313-40.

(15) Tresner H D, Backus E J. System of color wheels for streptomycete taxonomy. Appl. Microbiol. 1963; 11 (4): 335-8.

(16) Kelly K L. Inter-Society Color Council–National Bureau of Standards Color-Name Charts Illustrated with Centroid Colors. Washington DC: US Government Printing Office; 1964.

(17) Kawato M, Shinobu R. On Streptomyces herbaricolor nov. sp. supplement: A simple technique for the microscopical observation. Nat. Sci. 1959; 8 (1): 114-9.

(18). Williams S t, Goodfellow M, Alderson G, Wellington E M H, Sneath P H A, Sackin M J. Numerical classification of Streptomyces and related genera. J Gen Microbiol. 1983; 129 (6): 1743 – 1813.

(19) Pospiech A, Neumann B. A versatile quick-prep of genomic DNA from gram-positive bacteria. Trends in Genetics 1995; 11(6): 217-18.

(20) Spencer J, de Spencer A, et al. Environmental microbiology: methods and protocols. 16th ed. New Jersey: Humana Press Inc.; 2004.

(21) Palmer D A, Bender L. Effects of Environmental and Nutritional Factors on Production of the Plyketide Phytotoxin Coronatine by Pseudomonas syringae pv. Glycinea. Applied and Environmental Microbiology 1993; 59 (5): 1619-29.

(22) Dhanasekaran D, Nooruddin T, Panneerselvam A. Herbicidal agents from actinomycetes against selected crop plants and weeds. Natural Product Research 2010; 24 (6): 521-29.

(23) Dhanasekaran D, Ambika K, Thajauddin N, Panneerselvam A. Allelopathic effect of actinobacterial isolates against selected weeds. Phytopathology and Plant Protection 2011; 45