جداسازی و شناسایی یک سویه باکتری شیمیولیتواتوتروف اختیاری اکسیدکننده آهن و گوگرد از چشمه‏‏ها‏‏ی اردبیل

نویسندگان

1 کارشناس ارشد میکروبیولو‍ژی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران،

2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

3 دانشجوی دکتری میکروبیولو‍ژی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران

4 مربی میکروبیولوژی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: استخراج فلزات از معادن سولفیدی با استفاده از روش‏‏های رایج فیزیکی شیمیایی، علاوه بر آسیب به محیط زیست، بسیار هزینه‏‏بر است. کاربرد عناصر زیستی موجود در طبیعت، نظیر باکتری‏‏ها، در حذف گوگرد از سنگ‏‏های معدنی و استخلاص کم هزینه‏‏تر فلزات، سال‏‏هاست با عنوان فرآیند‏ فروشویی زیستی مورد توجه محققان قرار گرفته است. مواد و روش‏‏ها: برای انجام این تحقیق، نمونه‏برداری از چشمه‏های اسیدی آب معدنی استان اردبیل انجام شد. نمونه‏ها در محیط حاوی عناصر گوگردی و آهن‏دار غنی شدند و باکتری‏ها پس از کشت‏های متوالی در محیط جامد خالص‏سازی شدند. برای شناسایی باکتری جداسازی شده از روش‏های رایج ریخت شناسی، فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و روش فیلوژنتیکی 16S rDNA استفاده شد. نتایج: طبق بررسی‏های انجام شده، باکتری جداشده، یک باسیل گرم مثبت اسپوردار با دمای بهینه رشد 25 درجه سانتیگراد و اسیدیته بهینه 4 است و طبق تحلیل‏ فیلوژنتیکی، یک ‏سویه جدید از باکتری Bacillus firmus با 99 درصد تشابه بوده است که قادر به اکسیداسیون ترکیبات گوناگون گوگردی (نظیر: تیوسولفات پنج درصد، گوگرد عنصری سه درصد، سولفیت سدیم سه درصد) و آهن‏دار (پیریت 3 درصد، پیروتیت 3 درصد، سولفات آهنII 4/5 درصد و پودر آهن 2 درصد) است. همچنین، این باکتری مس نامحلول سنگ معدن سرچشمه (5 درصد) را به سولفات مس تبدیل می‏کند و رنگ محیط را به آبی مایل به سبز تغییر می‏دهد. بحث و نتیجه‏گیری: با توجه به دما و اسیدیته بهینه، و فعالیت‏های اکسیداسیون گوگرد و آهن این باکتری، می‏توان از آن در حضور باکتری‏های لیتوتروف دیگر به شکل‏ مجموعه‏ای (کنسرسیوم) در فرآیند‏های فروشویی زیستی استفاده کرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and characterization of a Facultative chemolithotrophic sulphur and iron oxidizing bacterium from Ardabil acidic springs

نویسندگان [English]

  • Nima Salamian 1
  • GolamHossein Ebrahimipour 2
  • mahdi Ghasemi 3
  • javad Fakhari 4
1 MSc of Microbiology, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran
2 Associate Professor of Microbiology, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran
3 PhD student of Microbiology, University of Isfahan, Isfahan, Iran
4 Lecturer of Microbiology, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: Since metal extraction from sulfide ores by physicochemical methods is expensive and also detrimental to the environment, microorganisms, mainly bacteria are being increasingly used for desulfurization of sulfide minerals. Microbial leaching or bioleaching is an inexpensive and environmentally friendly technology for metal recovery.Materials and Methods: In the present study, to isolate iron and sulfur-oxidizing bacteria which are active in bioleaching process, spring water samples were collected and enriched by iron and sulfur-containing media. In order to identify the isolated bacteria, several morphological, physiological, biochemical and 16S rDNA phylogenetical methods were implemented. Results: After several sub-cultures, a gram-positive spore-forming rod (NS strain) was isolated and then characterized. Sequence analysis of 16S rDNA revealed that the isolated strain was closely related to Bacillus firmus strain IAM 12464 (99%), that was capable to oxidize several sulphur and iron component such as: thiosulfate 5%, elemental sulphur 3%, sodium sulphate 3%, pyrite 3%, pyrrhotite 3%, ferrous sulphate 4.5% and Iron powder 2%. Also, this isolate could dissolve copper of SARCHESHME ore to copper sulphate and change the colour of medium to blue-green. The optimal growth of the isolate was observed at 25°C and pH 4. Discussion and Conclusion: Due to the optimum pH and temperature, and the iron and sulphur oxidizing activity of this isolate, this bacterium together with a consortium of lithotrophic bacteria could be used in bioleaching processes.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bioleaching
  • Chemolithotrophic bacteria
  • Sulphurous springs

مقدمه

استفاده از سوخت‏های فسیلی به منظور حرارت ‏دهی و گوگرد ‏زدایی از سنگ‏های معدنی، سبب پدید آمدن گازهای گلخانه‏ای و نیز گازهای SOx می‏شود که این مورد اخیر باعث به‏وجود آمدن باران‏های اسیدی می‏شود. استفاده از عناصر زیستی موجود در طبیعت، نظیر باکتری‏ها به منظور حذف گوگرد از سنگ‏های معادن سولفیدی، علاوه بر کاهش هزینه‏های استخراج، مشکلات زیست- محیطی استفاده از سوخت‏های فسیلی را به دنبال نخواهد داشت (1).

به طور کلی، استخراج فلزات از منابع کم عیار شامل دو مرحله است: اولین مرحله آن «فروشویی»[1] است. در این مرحله محلول لیچ کننده (فروشویه) که ممکن است اسید، باز، نمک و یا باکتری باشد، فلز موجود در سنگ معدن را به شکل‏ محلول و یا رسوب در آورده، از باطله جدا می‏نماید. مرحله بعد، جداسازی فلز حل یا ته‏نشین شده است که با کمک حلال‏های آلی و یا رسوب‏ دهی جانشینی و یا الکترولیز انجام می‏شود (2). فروشویی اسیدی فرآیندی است که در آن برای انحلال فلز موجود در سنگ معدن، از اثرگذاری اسید بر سنگ معدن استفاده می‏شود، اما این روش سرعت بسیار پایینی دارد و در فرآوری کنسانتره‏های معدنی سولفیدی، کالکوپیریت و بازیابی فلزات گرانبها کارآیی و توانایی لازم را ندارد. این محدودیت‏ها باعث شده است که مقبولیت فروشویی اسیدی کاهش پیدا کند. از طرف دیگر، صنایع متالورژی امروزه با مشکلات بسیاری مواجه است که عبارتند از: 1) کاهش منابع غنی سنگ معدنی در سطح زمین که باعث روی آوردن معدن‏کاران به منابع فقیر شده است؛ 2) وجود منابع نسبتاً فقیر در اعماق زمین که استخراج این سنگ‏ها با تکنولوژی فعلی مقرون به صرفه نیست؛ 3) وجود دور ریزهای منابع غنی قبلی که حاوی مقادیری از فلزات بوده، بازیابی این مقادیر کم فلز از این دور ریزها به روش کلاسیک مقرون به صرفه نیست؛ 4) مصرف انرژی زیاد، به خصوص در متالورژی حرارتی و 5) آلوده کردن محیط زیست (3 و 4).

کاهش کارآیی فروشویی اسیدی و مشکلات و مسایل ذکر شده در بالا، موجب شد که صاحبان صنایع به «فروشویی زیستی»[2] به عنوان روشی جایگزین که با طبیعت همراهی و هماهنگی کامل دارد، توجه بیشتری مبذول نمایند. از جمله مزایای فروشویی زیستی استخراج فلزات از معادن با عیار پایین است. از آنجایی که به علت مصرف انرژی و نیروی انسانی کمتر هزینه‏های روش فروشویی زیستی، نسبت به روش‏های رایج فیزیکی و شیمیایی کمتر است، در نتیجه فعالیت بر روی این منابع کم عیار توجیه اقتصادی پیدا می‏کند. از طرفی، به دلیل این‏که می‏توان روش فروشویی زیستی را به شکل‏ درجا[3] نیز اعمال نمود، می‏توان منابع زیر زمینی و دور از دسترس را نیز بهره برداری کرد. بازیابی فلزات از ضایعات صنعتی، یکی دیگر از مزیت‏های این روش است که بدین ترتیب هم فلزات سنگین از پساب‏ها حذف می‏شوند و آلودگی محیطی کمتری پدید می‏آورند و هم منبع ثانویه‏ای برای فلزات خام ایجاد می‏شود (5 و 6).

باکتری‏های اصلی درفروشویی زیستی سولفیدی، ویژگی‏های فیزیولوژیک مشترکی دارند. همه باکتری‏های شیمیولیتواتوتروف، اسید‏دوست هستند و قادرند آهن و سولفور را اکسید کنند. این باکتری‏ها بیشتر سولفوریک‏اسید و آهن فریک تولید می‏کنند که برای واکنش‏های فروشویی زیستی مورد نیاز هستند. این باکتری‏ها دارای یک سری ویژگی‏های عمومی هستند که آن‏ها را نسبت به نقشی که در حل کردن معدن دارند، مناسب می‏سازد (7). یکی از مهم‏ترین و اصلی‏ترین میکروارگانیسم‏هایی که در فرآیند‏ فروشویی زیستی یافت و مطالعه شده، باکتری Acidithiobacillus ferrooxidans است (8).

ایران از کشورهای دارای معادن بزرگ سولفوره است. از طرفی، وجود چشمه‏های آب معدنی گوگردی اکوسیستم مناسبی برای دستیابی به باکتری‏های شیمیولیتوتروف بومی اکسیدکننده گوگرد و آهن در کشور است.

هدف از انجام تحقیق حاضر، دستیابی به باکتری شیمیولیتوتروف مزوفیلی است که از ذخایر زیست محیطی ایران جداسازی و شناسایی شده باشد و بتواند به شکل‏ مجموعه ای (کنسرسیوم) با سایر باکتری‏ها با طیف دمایی مختلف در فرآیند‏های بیولوژیک استخراج معادن استفاده شود.

مواد و روش‏ها

نمونه‏برداری‏

نمونه‏برداری‏ از دریاچه‏های آب معدنی گوگرد و آهن‏دار قوتورسویی و شابیل در استان اردبیل انجام شد. دمای مظهر چشمه حدود 50 درجه سانتیگراد و دارای اسیدیته برابر 3 است. به منظور جداسازی باکتری‏های مزوفیل، نمونه‏ها از آب مناطق پایین دست چشمه ‏(با دمای حدود 30 درجه سانتیگراد و اسیدیته برابر 5/3) برداشت و با استفاده از بطری‏های استریل به آزمایشگاه منتقل شد.

محیط‏های کشت

در این پژوهش، از هشت محیط پایه معدنی برای جداسازی و بررسی رشد اتوتروفی سویه جدا شده استفاده شد. ترکیب این محیط‏ها در جدول 1 نشان داده شده است.

 

 

 

جدول 1- محیط‏های پایه معدنی استفاده شده در این پژوهش (بر حسب گرم در 100 میلی‏لیتر)

محیط کشت

شماره 1

شماره 2

شماره 3

شماره 4

شماره 5

شماره 6

شماره 7

شماره 8

شماره 9

(NH4)2SO4

3/0

3/0

3/0

3/0

3/0

3/0

3/0

3/0

3/0

MgSO4

05/0

05/0

05/0

05/0

05/0

05/0

05/0

05/0

05/0

Ca(NO3)2

001/0

001/0

001/0

001/0

001/0

001/0

001/0

001/0

001/0

KCl

01/0

01/0

01/0

01/0

01/0

01/0

01/0

01/0

01/0

Na2S2O3

5

 

 

 

 

5

 

 

 

FeS2

 

 

3

 

 

 

 

 

 

FeS

 

 

 

3

 

 

 

 

 

Na2SO3

 

 

 

 

3

 

 

 

 

FeSO4

5/4

5/4

 

 

 

 

 

 

 

پودر آهن

 

 

 

 

 

 

2

 

 

گوگرد عنصری

 

 

 

 

 

 

 

3

 

کنسانتره سنگ مس

 

 

 

 

 

 

 

 

5

آب مقطر( میلی‏لیتر)

100

100

100

100

100

100

100

100

100

 

همچنین، به منظور بررسی رشد هتروتروفی از محیط پپتون- عصاره مخمر براث که حاوی 5 گرم در لیتر عصاره مخمر و سه گرم در لیتر پپتون بود، استفاده شد.

جداسازی و خالص‏سازی باکتری

به منظور جداسازی باکتری‏(های) مورد نظر، پس از آوردن نمونه‏ها به آزمایشگاه، مقداری از رسوبات و نمونه‏های آب پس از مخلوط شدن، در ارلن‏های 250 میلی‏لیتری حاوی 100 میلی‏لیتر محیط پایه معدنی شمارة 1 ریخته و در شیکر انکوباتور با دمای 25 درجه سانتیگراد و شدت همزنی rpm120 قرار داده شد. پس از گذشت سه هفته و بررسی میکروسکوپی رشد باکتری‏ها، از این ارلن‏ها به میزان پنج میلی‏لیتر به درون ارلن‏های واجد محیط کشت تازه تلقیح شد. پس از یک هفته، از ارلن‏های سری دو باز هم به همین نحو کشت مجدد تهیه شد. به‏طور همزمان، با این عمل، از ارلن‏های سری یک و دو با استفاده از سانتریفوژ با دور rpm8000 به مدت دو دقیقه رسوب تهیه و با استفاده از لوپ بر روی محیط کشت جامد برده شد و این عمل کشت بر روی محیط‏های جامد (محیط پایه معدنی شماره 1 محتوی آگار) و مایع چندین بار دیگر تکرار شد. به منظور نگهداری سویه جدا شده، یک میلی‏لیتر از سوسپانسیون مورد نظر در ویال‏های استریل ریخته و سپس یک میلی‏لیتر از محیط کشت پایه معدنی شماره 1 استریل و 2/0 میلی‏لیتر DMSO[4] استریل به آن اضافه شد و سریعاً به داخل فریزر 20- درجة سانتیگراد منتقل شد.

شناسایی باکتری

خصوصیات ظاهری باکتری از لحاظ رنگ کلونی‏ و شکل باکتری در محیط کشت پایه معدنی شماره 1 بررسی شد. نوع واکنش گرم، رنگ‏آمیزی اسپور و آزمایش‏های بیوشیمیایی مختلفی نظیر بررسی آنزیم‏های کاتالاز، اکسیداز و اوره‏آز، احیای نیترات، بررسی حرکت و تولید ایندول و سولفید هیدروژن در محیط SIM، بررسی تجزیه گلوکز، ساکارز و لاکتوز و همچنین، تولید دی اکسید کربن و سولفید هیدروژن در محیط TSIو آزمایش‏ MR/VP مطابق با روش‏های استاندارد شناسایی باکتری‏ها انجام شد (9).

به منظور شناسایی دقیق باکتری ایزوله شده، علاوه بر روش‏های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی، از روش توالـی‏یابی 16S rDNAنیز استفاده شد. استخراج DNA ژنومی و آهن‏زدایی با استفاده از کیتHigh pure PCRProductمحصول شرکت Roche آلمان انجام شد.

در این پژوهش، از یک جفت پرایمر عمومی که توانایی تکثیر 16S rDNA بیشتر یوباکتری‏ها را دارند، استفاده شد. توالی پرایمرهای رفت (Fd1)و برگشت (rD1) که محصولی در حدود 1600 جفت باز می‏دهد، به شرح زیر است (10):

fd1: 5′- AGA GTT TGA TCC TGG CTC -3′

rD1: 5′- TAA GGA GGT GAT CCA GCC - 3′

 

مخلوط PCR (25 میکرولیتر) حاوی یک میکرولیتر DNA، 5/2 میکرولیتر بافر 10xPCR، 75/0 میکرولیتر MgCl2، یک میکرولیتر dNTP (10 میلی‏مولار)، یک میکرولیتر از هر یک از پرایمرها (10 پیکومول) و 3/0 میکرولیتر از آنزیم DNA پلیمراز Taq (u/µL 5) است. حجم نهایی مخلوط با استفاده از آب دیونیزه دوبار تقطیر به 25 میکرولیتر رسانده شد. واکنش PCR با دناتوراسیون اولیه در 94 درجه سانتیگراد به مدت پنج دقیقه آغاز شد و در 30 سیکل با برنامه دمایی به شکل‏ دناتوراسیون در 94 درجه سانتیگراد به مدت 40 ثانیه، چسبیدن در 55 درجه سانتیگراد به مدت 40 ثانیه، پلیمریزاسیون در 72 درجه سانتیگراد به مدت 60 ثانیه و پلیمریزاسیون نهایی در همین دما به مدت 10 دقیقه به پایان رسید. محصول PCR بر روی ژل آگاروز‏ یک درصد حاوی اتیدیوم بروماید و بافر TAE(1x) الکتروفورز شد و توسط دستگاه ترانس‏لومیناتور با تابش اشعه ماورای بنفش مشاهده شد. به منظور تعیین توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rDNA، محصول خالص PCR به شرکت تکاپوزیست ارسال شد (11).

تعیین اسیدیته بهینه رشد باکتری

برای تعیین اسیدیته بهینه برای رشد باکتری، در ارلن‏های 250 میلی‏لیتری، 100میلی‏لیتر محیط کشت معدنی شمارة 1 استریل ریخته شد. پس از تلقیح باکتری (به میزان 3 میلی‏لیتر با کدورت دو مک فارلند معادل تقریبا 106×600 سلول در میلی‏لیتر)، اسیدیته محیط‏ها با سولفوریک‏اسید‏ 10 نرمال بر روی 2، 3، 4 و 5 تنظیم شد. سپس ارلن‏ها در شیکر انکوباتور با دمای 25 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. هر سه روز یک بار، سه میلی‏لیتر نمونه از هر کدام از ارلن‏ها برداشته شد و پس از سانتریفیوژ شدن، مایع رویی دور ریخته شد و با افزودن یک میلی‏لیتر آب مقطر استریل به رسوبات، تا روز تعیین غلظت پروتئین کل در فریزر نگهداری شدند.

تعیین دمای بهینه رشد باکتری

برای تعیین بهترین دما برای رشد باکتری، در ارلن‏های 250 میلی‏لیتری، 100میلی‏لیتر محیط کشت معدنی شمارة یک استریل ریخته شد (اسیدیته 4). ارلن‏ها پس از تلقیح باکتری (به میزان سه میلی‏لیتر با کدورت دو مک فارلند معادل تقریبا 106×600 سلول در میلی‏لیتر)، در شیکر انکوباتورهایی با دماهای 15، 25 و 35 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. هر سه روز یک بار، سه میلی‏لیتر نمونه از هر کدام از ارلن‏ها برداشته شد و پس از سانتریفیوژ شدن، مایع رویی دور ریخته شد و با افزودن یک میلی‏لیتر آب مقطر استریل به رسوبات، تا روز تعیین غلظت پروتئین کل در فریزر نگهداری شدند.

سنجش پروتئین کل

در این مطالعه، با تعیین مقدار پروتئین کل، میزان رشد باکتری اندازه‏گیری شد. برای این منظور یک میلی‏لیتر از نمونه، در داخل میکروتیوب به مدت دو دقیقه در rpm80000 سانتریفوژ شد. به رسوب سلولی حاصل یک میلی‏لیتر آب مقطر اضافه شد و پس از بهم زدن، 5/0 میلی‏لیتر محلول 3/0 مولار NaOH اضافه و به‏هم زده شد. سپس، لوله‏ها به مدت 90 دقیقه در حمام آب گرم (بن ماری) 60 درجه سانتیگراد قرار داده شدند تا سلول‏ها کاملاً تخریب شوند. اندازه‏گیری پروتئین به روش لاری[5] انجام شد. در این روش، از دو معرف استفاده شد:

1) معرف مس: شامل یک میلی‏لیتر محلول الف (1/0 گرم سولفات مس در 20 میلی‏لیتر محلول سدیم پتاسیم تارتارات 1 درصد) و محلول ب (50 میلی‏لیتر محلول کربنات سدیم 2 درصد)؛ 2) معرف فولین: شامل یک حجم معرف فولین و دو حجم آب مقطر.

رنگ آمیزی به این ترتیب انجام شد که به هر یک از لوله‏های حاوی سلول‏های لیز شده و همچنین، یک لوله شاهد حاوی 1 میلی‏لیتر آب مقطر و 5/0 میلی‏لیتر 3/0 مولار NaOH، به تدریج و با تکان دادن، 5 میلی‏لیتر معرفمس اضافه شد. پس از 10 دقیقه قرار گرفتن در تاریکی، 5/0 میلی‏لیتر معرف فولین اضافه و سریع به‏هم زده شد و دوباره به مدت 30 دقیقه در تاریکی قرار داده شد. در نهایت، لوله‏ها به مدت دو دقیقه در rpm 80000 سانتریفوژ شدند تا بقایای سلولی ته نشین شوند و جذب نوری محلول در 623 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. مقدار پروتئین موجود در هر نمونه با استفاده از منحنی خطی استاندارد حاصل از سرم آلبومین گاوی محاسبه شد (12).

بررسی رشد اتوتروفی باکتری بر روی منابع گوگردی و آهن‏دار

برای بررسی رشد اتوتروفی باکتری روی سولفات آهن (FeSO4)،پیریت(FeS2)، سولفید آهن(FeS)، سولفیت سدیم (Na2SO3)، تیوسولفات سدیم (Na2S2O3)، پودر آهن، گوگرد عنصری و سنگ معدن سرچشمه (که حاوی کالکوپیریت (CuFeS2) است) به عنوان تنها منبع انرژی و الکترون، به ترتیب از محیط کشت پایه معدنی شمارة 2 تا 8 استفاده شد. باکتری را در شرایط استریل تلقیح کرده، یک محیط کشت فاقد باکتری نیز به عنوان شاهد تهیه شد و هر دو پس از تنظیم اسیدیته بر روی هم‏زن در شیکر انکوباتور 25 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. هر روز میزان رشد باکتری‏ها با ایجاد کدورت در محیط و با اندازه‏گیری اسیدیته محیط در مقایسه با شاهد به مدت 15 روز بررسی شد.

بررسی رشد هتروتروفی باکتری

برای انجام این آزمایش از دو محیط کشت پپتون‏- عصاره ‏مخمر آگار و پپتون‏- عصاره ‏مخمر براث استفاده شد. پس از تهیه و اتوکلاو کردن هر دو محیط، اسیدیته محیط‏ها بر روی 4 تنظیم شد. سپس باکتری در شرایط استریل به محیط‏های کشت تلقیح شد. برای محیط کشت پپتون‏- عصاره ‏مخمر براث یک شاهد (محیط کشت بدون باکتری) نیز تهیه شد. محیط‏های کشت و شاهد همزمان در 25 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. هر روز میزان رشد باکتری با ایجاد کدورت در محیط کشت مایع و مقایسه با شاهد، و بررسی تشکیل کلنی در محیط جامد به مدت 15روز بررسی شد.

 

نتایج

جداسازی و شناسایی سویه اکسیدکننده آهن و گوگرد

چشمه‏های آب معدنی قوتورسویی و شابیل در استان اردبیل، به علت وجود رسوبات گوگردی و آهن‏دار در دهانه چشمه، از محل‏های مناسب برای جداسازی باکتری‏های شیمیولیتوتروف مزوفیل و ترموفیل هستند. در این پژوهش، از این چشمه‏ها به منظور نمونه‏برداری‏ استفاده شد. نمونه‏ها پس از مراجعه به آزمایشگاه طی چند کشت متوالی در محیط پایه معدنی شماره 1 شامل عناصر مورد نیاز برای رشد باکتری و تیوسولفات سدیم و سولفات فریک به عنوان منابع انرژی و الکترون، غنی‏سازی شده و سپس بر روی محیط کشت جامد پایه معدنی شماره 6 که علاوه بر عناصر مورد نیاز برای رشد، دارای پنج درصد تیوسولفات سدیم به عنوان منبع انرژی و الکترون نیز بود، یک سویه (سویه NS) باسیلوس شیمیولیتوتروف اختیاری از چشمه قوتورسویی جداسازی و خالص‏سازی شد‏ (شکل 1).

 

 

شکل 1- الف) باکتری خالص شده در محیط حاوی تیوسولفات سدیم. هاله ایجاد شده ناشی از تجزیه تیوسولفات سدیم توسط باکتری است. ب) تصویر میکروسکوپ نوری از باسیل گرم مثبت اسپورزا (سویه NS)

 

 

 

جدول 2- خصوصیات ریخت‏شناسی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی سویه جدا شده از چشمه قوتورسویی

آزمایش‏‏های شناسایی

سویه NS

شکل

باسیل

واکنش گرم

مثبت

رنگ‏آمیزی اسپور

مثبت

حرکت

مثبت

اکسیداز

مثبت

کاتالاز

مثبت

رشد اتوتروفی

مثبت

رشد هتروتروفی

مثبت

اسیدیته بهینه

4

دمای بهینه

25 درجه

احیای نیترات به نیتریت

منفی

اوره آز

مثبت

آزمایش‏ VP

مثبت

آزمایش‏ MR

منفی

آزمایش‏ TSI

منفی

تولید اندول

منفی

تولید H2S

منفی

 

پس از انجام PCR و تعیین توالی ژن 16SrDNA، توالی‏های به دست آمده هم‏تراز[6] و با میکروارگانیسم‏های موجود در بانک ژنی NCBI مقایسه شد (شکل 2). نتایج حاصل از BLAST مشخص کرد که این باکتری، سویه‏ای از Bacillusfirmusاست، زیرا توالی به دست آمده دارای شباهت 99 درصد به ژن 16SrDNA باکتری Bacillusfirmus سویه IAM12464 است. شکل 3 الکتروفورز محصول PCR با طول 1600 جفت باز را بر روی ژل آگاروز‏ نشان می‏دهد.

 

 

شکل 3- باند 16S rDNA حاصل از PCRبر روی ژل آگاروز‏ یک درصد

 

 

 

 

5GTACCTGACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTANGGCCGCAAGGCTGANN-TCAAAGGAATTGANGGGGGCC3

شکل 2- توالی ژن 16S rDNAسویه جداسازی شده

 

 


تعیین اسیدیته و دمای بهینه رشد باکتری

به طور کلی، باکتری‏های شیمیولیتوتروف اسیدوفیل در اسیدیته بین 1 تا 6 و دمای بین 20 تا 90 درجه سانتیگراد رشد می‏کنند. Acdthobacllus ها معمولاً اسیدیته بین 2 تا 3 و درجه حرارت 25 تا 40 درجه سانتیگراد و solfolubus ها معمولاً در اسیدیته بین 2تا3 و درجه حرارت ببین 50 تا80 درجه سانتیگراد بیشترین رشد را دارند (13 و 14). باکتری Methylobacteriumجداسازی شده توسط بخششی بیش‏ترین رشد را در دمای 50 درجه سانتیگراد و اسیدیته 3 داشته است (15).

در این پژوهش، به منظور استفاده صنعتی باکتری جداسازی شده در آینده، دسترسی به اسیدیته بهینه و دمای رشد سویه NS بررسی شد. نتایج حاصل از این بررسی در شکل 3 و 4 نمایش داده شده است. با توجه به میزان پروتئین کل تولید شده توسط باکتری در طی 12 روز، به نظر می رسد اسیدیته بهینه آن 4 بوده باشد. با توجه به شکل 3 مشاهده می‏شود که در اسیدیته 2 کمترین میزان رشد وجود دارد. همچنین، میزان تولید پروتئین در 6 روز اول به حداکثر می‏رسد که برابر با 3/49 میلی‏گرم در 100 میلی‏لیتر است (شکل 3).

 

شکل 3- تعیین اسیدیته بهینه رشد باکتری به روش پروتئین سنجی در دمای 25 درجه سانتیگراد و در محیط کشت پایه معدنی شماره 1

 

دمای بهینه سویه NS با توجه به میزان پروتئین کل تولید شده در طی 12 روز، 25 درجه سانتیگراد تعیین شد. با توجه به شکل 4 مشاهده می‏شود که در دمای 15 درجه سانتگیراد، کم‏ترین میزان رشد وجود دارد. همچنین، میزان تولید پروتئین در 6 روز اول به حداکثر می‏رسد که برابر با 5/50 میلی‏گرم در 100 میلی‏لیتر است. این باکتری توانایی رشد مناسب در دمای 35 درجه سانتیگراد نیز نشان می‏دهد، به طوری‏که در 6 روز اول میزان پروتئـین کل به‏دست آمده از آن برابر 45 میلی‏گرم در 100 میلی‏لیتر است (شکل 4).

 

شکل 4- تعیین دمای بهینه رشد باکتری به روش پروتئین سنجی در اسیدیته‏4 و در محیط کشت پایه معدنی‏شماره 1.

 

بررسی رشد اتوتوتروفی و هتروتروفی باکتری

میکروارگانیسم‏ها کربن مورد نیاز خود برای رشد را از ترکیبات آلی یا دی اکسید کربن موجود در اتمسفر به دست می‏آورند. باکتری‏های هتروتروف کربن را از ترکیبات آلی و باکتری‏های اتوتروف کربن را از منبع دی‏اکسید کربن موجود در اتمسفر در طی چرخه کلوین به دست می‏آورند (16). منبع اصلی الکترون و انرژی در باکتری‏های لیتوتروف، مواد معدنی است، اما گروهی از باکتری‏های هتروتروف اختیاری نیز یافت شده‏اند که علاوه بر توانایی رشد در محیط‏های هتروتروفی، قابلیت رشد در محیط‏های اتوتروفی و اکسیداسیون گوگرد عنصری (17)، تیوسولفات (18)، و آهن (19) را نیز دارا هستند. برای تشخیص اتوتروف یا هتروتروف بودن باکتری جداسازی شده، آزمایش‏ رشد باکتری در محیط‏های پایه معدنی و محیط هتروتروفی پپتون‏- عصاره ‏مخمر براث و پپتون‏- عصاره ‏مخمر آگار انجام شد. نتایج نشان داد که این باکتری قادر به رشد در تمامی محیط‏های پایه معدنی و محیط هتروتروفی بوده است و کلونی‏‏های سفید ستاره‏ای شکل در محیط واجد آگار پدید می‏آورد. باکتری‏های اکسید کننده آهن نظیر leptospirillumferrooxidans، اکثر Acidithiobacillus‏ ها و برخی از solfolubus ‏ها این توانایی را دارند که در چنین شرایطی آهن فرو را به آهن فریک اکسیده نموده، محیط را به رنگ نارنجی و قهوه‏ای در آورند (20). باکتری جداشده در این پژوهش نیز واجد این توانایی است و با اکسیده کردن آهن فرو در سولفات آهن II و نیز پودر آهن، پیریت و FeS تولید آهن فریک نموده ، رسوباتی قهوه‏ای در ظرف برجا می‏گذارد. همچنین، توانایی اکسیده کردن گوگرد عنصری، تیوسولفات سدیم و سولفیت سدیم توسط باکتری جداشده در این پژوهش بررسی شد که باکتری مذکور با مصرف گوگرد اسید تولید می‏نماید و اسیدیته محیط را کاهش می‏دهد. کاهش اسیدیته در محیط حاوی تیوسولفات موجب تغییر رنگ محیط به شیری می‏گردد. مصرف گوگرد عنصری در مدت زمان طولانی‏تری انجام می‏شود و سبب انحلال گوگرد در محیط می‏شود.

ایجاد کدورت، کاهش اسیدیته و تغییر رنگ محیط در نتیجه رشد و اکسیداسیون آهن و گوگرد موجود در محیط کشت توسط باکتری، از علایم فعالیت و تکثیر سویه NS بود. بنابراین، سویه NS یک باکتری شیمیولیتوتروف اختیاری است که هم به شکل‏ اتوتروفی و هم به شکل‏ هتروتروفی رشد می‏کند.

 

بحث و نتیجه‏گیری

امروزه استفاده از میکروارگانیسم‏ها در صنایع، بویژه صــنایع استخراج فلزات، کاربرد گسترده‏ای یافته است. به علت استخراج مداوم از معادن و کمبود ذخایر فلزی موجود در این معادن، صنایع به دنبال یافتن فرآیندهایی هستند تا از معادنی با عیار پایین نیز استفاده کنند. هم‏اکنون، فروشویی زیستی از کاربردی‏ترین این فرآیندهاست که به علت مزایای فراوانی که از نظر اقتصادی، فنی و زیست- محیطی دارد، به آن توجه و جایگزین فرآیند‏‏‏های معمول و رایج فیزیکی و شیمیایی شده است (5). باکتری‏های شیمیولیتوتروفی، نظیر: Acidithiobacillus ، solfolubus ‏و leptospirillum از بهترین گونه‏های مورد استفاده در فرآیند فروشویی هستند (13 و 14). به منظور استفاده از ذخایر زیستی بومی ایران، اقداماتی در جهت جداسازی باکتری‏های شیمیولیتوتروف با بهینه دمایی مختلف انجام شد. باکتری جداسازی شده توسط بخششی یک Methylobacteriumبا بهینه دمای 50 درجه سانتگیراد و اسیدیته بهینه 3 است (15). برای آن‏که بتوان گستره دمایی متنوعی را تحت پوشش قرار داد، در این پژوهش باکتری شیمیولیتوتروف اختیاری‏ با دمای بهینه 25 درجه سانتگیراد و اسیدیته 4 جداسازی شد. باکتری جدا شده در این پژوهش توانایی بالایی در اکسیداسیون ترکیبات گوگردی و آهن‏دار از خود نشان داد. همچنین، در محیط معدنی حاوی نمونه مس سرچشمه رشد کرد و مس را از حالت نامحلول به سولفات مس محلول تبدیل نمود و رنگ محیط را به آبی مایل به سبز تغییر داد. بنابراین، از سویه NS می‏توان در حضور باکتری‏های لیتوتروف دیگر به شکل‏ مجموعه‏ای (کنسرسیوم) در فرآیند‏ فروشویی زیستی استفاده کرد.

 

 



[1]-Leaching

[2]-Bioleaching

[3]-In situ

[4]-Dimethyl sulfoxide

[5]-Lowry

[6]-alignment


References

Watling H.R.The bioleaching of sulphide minerals with emphasis on copper sulphides A review. Hydrometallurgy 2006; 84(1): 81-108.

  • Torma A.E. Role of Thiobacillus ferroxidans in hydrometalorgical processes. Adv. Biochem. Eng 1997; 6: 1-37.

  • Abraitis P.K, Pattrick R.A.D, Kelsall G.H, Vaughan, D.J. Acid leaching and dissolution of major sulphide ore minerals: processes and galvanic effects in complex systems. Mineral. Mag 2004; 68(2): 343-51.

  • Gharabaghi M, Irannajad M, Noaparast M. A review of the beneficiation of calcareous phosphate ores using organic acid leaching. Hydrometallurgy 2010; 103: 96-107.

  • Rawlings D.E. Heavy metal mining using microbes. Annu. Rev. Micribiol 2002; 56: 65-91.

  • Pradhan N, Nathsarma K.C, SrinivasaRao K, Sukla L.B, Mishra B.K. Heap bioleaching of chalcopyrite: A review. Minerals Engineering 2008; 21(5): 355–65.

  • Murr L.E, Torma A.E, Brierley J.A. Metallurgical applications of the bacterial leaching and related microbiological phenomena. New York. USA: Academic Press; 1978.

  • Rohwerder T, Sand W. The sulfane sulfur of persulfides is the actual substrate of the sulfur-oxidizing enzymes from Acidithiobacillus and Acidiphilium spp. Microbiology 2003; 149(Pt 7): 1699-1709.

  • Slepecky R.A, Hemphill H.E. The Prokaryotes, 3rd Ed.. New York: Springer; 2006.

  • Weisburg W G, Barns S M, Pelletier D A, Lane D J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J Bacteriol. 1991; 173: 697–703.

  • Pizzaro J, Jedlicki E, Orellana O, Romero J, Espejo R.T. Bacterial populations in samples of bioleached copper ore as revealed by analysis of DNA obtained before and after cultivation. J Bacteriol. 1996; 62: 1323-28.

  • Lowry O.H, Rosenbrough N.J, Farr A.L, Rendall R.J. Protein measurement with the Folin phenol Reagent. J. Biol. Chem 1951; 193: 265-75.

  • Das A,Mishara A.K, Roy P. Inhibition of thiosulfate and tetrathionate oxidation by ferrous iron in Thiobacillus ferrooxidans. FEMS-Microbiol. Lett 1993; 112 (1): 67-71.

  • Kargi, F, Robinson J.M. Microbial desulfurization of coal by thermophilic microorganism, Sulfolobus acidocaldarius. Appl. Environ. Microb 1982; 44: 878-83.

  • Bakhsheshi R. Isolation and Identification of chemolithotroph acidophilic bacteria of Qotoursou spring in Ardebil province [Dissertation]. Tehran: Shahid Beheshty Univ.; 2006.

  • Vogler K.G. Studies on metabolism of autotrophic bacteria. J. Gen. physiol 1942; 26(1): 103–17.

  • Yang Z, Stoven K, Haneklaus S, Singh B, Scung E. Elemental sulfur oxidation by thiobacillus spp. and aerobic heterotrophic sulfur-oxidizing bacteria. Pedosphere 2010; 20: 71-9.

  • Nakagawa S. Sulfurihydrogenibium yellowstonense sp. nov., an extremely thermophilic, facultatively heterotrophic, sulfur-oxidizing bacterium from Yellowstone National Park, and emended descriptions of the genus Sulfurihydrogenibium, Sulfurihydrogenibium subterraneum and Sulfurihydrogenibium azorense. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2005; 55: 2263-68.

  • Bacelar-Nicolau P, Barrie Johvson D. Leaching of pyrite by acidiphilic heterotrophic iron-oxidizing bacteria in pure and mixed culture. Appl. Environ. Microbiol 1999; 65(2): 585-90.

  • Silverman M P, Ehrlich H L. Microbial formation and degradation of minerals. Adv. Appl. Microbiol 1964, 6: 153-206.